14-氯-β-榄香烯一氧化氮供体型衍生物及其制备和应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一类14-氯-β-榄香烯一氧化氮供体型衍生物及其制备和应用。

背景技术

榄香烯是从莪术中提取分离的倍半萜天然产物，具有广泛抗肿瘤活性。1994年，榄香烯口服乳和注射液经国家食品药品监督管理总局(China Food and DrugAdministration，CFDA)批准，作为广谱抗癌药物用于肺癌、肝癌、食管癌、鼻咽癌和脑癌的治疗。

在榄香烯提取混合物中，β-榄香烯的含量最高，也是最主要的抗肿瘤活性成分。但是，β-榄香烯结构中只含有碳氢两种元素，导致其脂溶性过强、水溶性差、生物利用度较低，不易被人体吸收，使其临床应用受到限制。以β-榄香烯注射液为例，患者治疗过程中往往需要大剂量注射给药，药液对患者血管的刺激性较大，容易引发静脉炎。因此，有必要对β-榄香烯进行结构改造与修饰，一方面改善其理化性质，另一方面提高其抗肿瘤活性。

一氧化氮(NO)参与多种生理和病理过程，且高水平的一氧化氮可通过多种信号通路抑制肿瘤细胞的生长，如ERKs，Akt等。但是，一氧化氮作为一种气体小分子，不易定量和运输，因此制备一种便于携带、稳定性好的一氧化氮供体成为了研究的热点。

研究发现，苯磺酰基呋咱是一种经典的一氧化氮供体，可以在体内外产生高水平的一氧化氮。因此，在β-榄香烯结构中引入一氧化氮供体，将大幅提高β-榄香烯的抗肿瘤活性，改善β-榄香烯的类药性，有希望获得疗效更好的抗肿瘤药物。

中国专利申请201710066664.1公开了一种一氧化氮供体型β-榄香烯衍生物的合成，具体通式如图1所示。该专利中报道的化合物是以β-榄香烯的13-醇为中间体，借助于酯化反应与呋咱类一氧化氮供体相连接，制备获得了酯类一氧化氮β-榄香烯衍生物。该系列化合物虽然表现出很好的体外抗肿瘤活性和体内抑瘤活性，但如图1所示，该系列化合物中β-榄香烯13位的酯键在体内极易被酯酶水解，代谢生成13-β-榄香醇。随后，13-β-榄香烯醇将迅速被氧化代谢为13-β-榄香醛。而13-β-榄香醛具有很强的细胞毒性，中、高剂量给药长期可直接造成给药动物死亡，因此长期用药具有较大的安全性风险，不适于应用于人体。此外，由于该专利中公开的化合物易于代谢分解，化合物稳定性差，很难透过血脑屏障，无法有效治疗脑内肿瘤，如恶性脑胶质瘤。

发明内容

本发明所公开的化合物，以醇胺结构为连接臂，首先制备得到13-β-榄香烯胺类中间体，再与呋咱一氧化氮供体连接，最终制备得到具有新型连接臂的β-榄香烯一氧化氮供体型衍生物，具有优异活性的同时不存在专利201710066664.1中可能出现的毒性问题。

13,14-双氯-β-榄香烯的合成路线如图2所示，反应条件和试剂：N-氯代丁二酰亚胺NCS，三氟甲烷磺酸镱Yb(OTf)

本发明采用13,14-双氯-β-榄香烯作为抗肿瘤活性骨架，具有如下重要优势：1)在β-榄香烯氯化反应中，会同时生成13-氯-β-榄香烯(中间体2，主产物)、14-氯-β-榄香烯(中间体3，副产物)和13,14-双氯-β-榄香烯(中间体4)，而两个单取代β-榄香烯氯代衍生物的极性极为相似，即便通过HPLC制备，也很难将二者分开，只能以二者的混合物为原料进行后续的反应，造成终产物中含有一定量的14位衍生物，不易纯化。因此，所制备得到的化合物难于纯化，不适合工业化大生产，不利于研发出可大规模制备的药物，因此难于进行药物的开发研究；2)制备13,14-双氯-β-榄香烯相对而言较易获得，且双氯代产物与单氯代β-榄香烯的极性差异较大，易于分离获得高纯度的双氯代β-榄香烯中间体，以及后续的衍生化终产物，且适宜于放大生产；3)13,14-双氯-β-榄香烯的抗肿瘤活性与13-氯-β-榄香烯、14-氯-β-榄香烯和β-榄香烯相当，且双氯代后轻微增加了化合物的极性，表现出了更好的类药性。

因此，本发明公开的β-榄香烯一氧化氮供体型衍生物易于制备分离，结构代谢稳定性更好，长期用药安全性更优，且可透过血脑屏障，强效地抑制恶性脑胶质瘤，具有很好的创新性和新颖性。

本发明提供了14-氯-β-榄香烯一氧化氮供体型衍生物，或其可药用盐，或溶剂化物，或其对映异构体、非对映异构体。

所述14-氯-β-榄香烯一氧化氮供体型衍生物具有如下通式(I)：

式(I)中：

R

R

在一优选例中，式(I)中：

R

R

在一优选例中，式(I)中：

R

R

在一优选例中，所述14-氯-β-榄香烯一氧化氮供体型衍生物选自如下通式(I-1)～(I-6)：

式(I-1)～(I-6)中，R

在一优选例中，所述14-氯-β-榄香烯一氧化氮供体型衍生物选自如下结构所示的化合物1～24：

本发明还提供了所述的14-氯-β-榄香烯一氧化氮供体型衍生物，或其可药用盐，或溶剂化物，或其对映异构体、非对映异构体在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述肿瘤包括肺癌、结肠癌、恶性脑胶质瘤等。

本发明与现有技术相比，主要优点包括：

本发明引入了可提高体内抗肿瘤活性的醇胺结构作为连接臂，提高了体内稳定性，并且对临床上缺乏有效治疗药物的恶性脑胶质瘤具有很好的治疗活性。

附图说明

图1为本申请化合物与CN201710066664.1专利化合物相比的优势；

图2为13,14-双氯-β-榄香烯的合成路线；

图3为中间体5-10的合成路线；

图4为中间体12、13、14a、14b、15a、15b的合成路线；

图5为β-榄香烯一氧化氮供体型衍生物终产物Ia-d、IIa-b、IIIa-d、IVa-d、Va-b和VIa-b的合成路线；

图6为β-榄香烯和实施例4对脑恶性胶质瘤的抗肿瘤活性(n＝5)，A.体重，B.大脑重量，C.脑肿瘤的荧光信号强度，D.β-榄香烯和实施例4的抑制率；

图7中，A为模型组、β-榄香烯组和实施例4组的脑胶质瘤图像，B为脑胶质瘤肿组织的组织学分析。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

(一)中间体4的制备

如图2所示，在0℃条件下，向含β-榄香烯(1.02g，5mmol)的二氯甲烷(8mL)和四氢呋喃(2mL)混合溶液中，依次加入NCS(1.34g，20mmol)、三氟甲烷磺酸镱(310mg，0.5mmol)、三甲基氯硅烷(54mg，0.5mmol)，0℃下反应8h。反应结束时，减压蒸馏除去溶剂，加入水(15mL)稀释，用乙酸乙酯(4mL×3)萃取，合并有机相，依次用水(20mL×2)和饱和食盐水(20mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经硅胶柱层析分离(纯石油醚)，得到无色液体化合物，即中间体4，产率为45％。

(二)中间体5-10的制备

如图3所示，向含有中间体4(304mg，1.1mmol)的N,N-二甲基甲酰胺DMF(3mL)中，依次加入相应的醇胺反应物(1.3mmol)和N,N-二异丙基乙胺DIPEA(172mg，1.3mmol)，60℃搅拌12。反应结束时，向混合溶液加水(10mL)稀释，用乙酸乙酯(10mL)萃取，合并有机液，用水(10mL)和饱和食盐水(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥后，残留物经硅胶柱层析分离(二氯甲烷：甲醇体积比150：1)，得到淡黄色液体，即中间体5-10，图谱数据如下。

中间体5-10的

2-((2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基))(甲基)氨基)乙-1-醇(5)

Light yellow liquid,yield 44％.

2-((2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)(异丙基)氨基)乙-1-醇(6)

Light yellow liquid,yield 60％.

(S)-1-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)吡咯烷-3-醇(7)

Light yellow liquid,yield 48％.

(1-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)哌啶-4-基)甲醇(8)

Light yellow liquid,yield 60％.

(1-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)哌啶-3-基)甲醇(9)

Light yellow liquid,yield 51％.

2-((4-(2-(4-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)哌嗪-1-基)乙-1-醇(10)

Light yellow liquid,yield 44％.

(三)中间体12、13的制备

在0℃条件下，向含有3,4-双(苯磺酰基)-1,2,5-恶二唑2-氧化物(183mg，0.5mmol)的四氢呋喃溶液中，缓慢滴加25％NaOH水溶液(0.2mL)，滴加完毕后，继续搅拌10min，加入反应物乙二醇(124mg，2mmol)，室温条件下反应6h。减压蒸馏除去溶剂，加入水(15mL)稀释，用二氯甲烷(20mL×3)萃取，合并有机相，依次用水(20mL×2)和饱和食盐水(20mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经硅胶层析(二氯甲烷：甲醇体积比400：1)得到中间体12(72mg，48％)。

m.p.128-130℃.

按照图4和上述相同的方法，更换反应物(将乙二醇换成1,4丁炔二醇)，制得中间体13。

中间体13的

4-((4-羟基丁基2-炔-1-基)氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物(13)

White solid,yield 53％,m.p.116-118℃.

(四)中间体14a、14b、15a、15b的制备

如图4所示，向含有中间体12(182mg，0.63mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中，依次加入反应物丁二酸酐(76mg，0.76mmol)和4-二甲氨基吡啶DMAP(38mg，0.32mmol)，室温搅拌6h，在室温条件下，向混合溶液加入水(5mL)淬灭，继续搅拌10min，用二氯甲烷(5mL×3)萃取，合并有机相，依次用水(20mL×2)和饱和食盐水(20mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经硅胶柱层析分离(二氯甲烷：甲醇体积比150：1)得到白色固体，即中间体14a(167mg，67％)。

m.p.118-120℃.

按照图4和上述相同的方法，更换反应物，制得中间体14b和15a、15b。

中间体14b和15a、15b的

4-(2-((4-羧基丁酰基)氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物(14b)

White solid,yield 53％,m.p.91-93℃.

4-((4-((3-羧基丙酰基)氧基)丁-2-炔-1-基)氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物(15a)

White solid,yield 54％,m.p.106-108℃.

4-(4-((4-羧基丁酰)氧基)丁-2-炔-1-基氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物(15b)

White solid,yield 54％,m.p.94-96℃.

(五)β-榄香烯一氧化氮供体型衍生物终产物Ia-Id、IIa-IIb、IIIa-IIId、IVa-IVd、Va-Vb和VIa-VIb的制备

如图5所示，将中间体5-10(0.08mmol)、NO供体中间体14a、14b和15a、15b(0.10mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDCI(0.12mmol)和DMAP(0.01mmol)在无水二氯甲烷(2mL)中在室温下搅拌8小时。采用薄层色谱法检测反应。用二氯甲烷(5mL)稀释反应混合物。有机层依次用水和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物通过柱色层析(二氯甲烷/甲醇)纯化，使产物为浅黄色液体。

所采用的各中间体均可按上述(一)～(四)进行制备，在此不再赘述。

具体的：

实施例1

4-(2-((4-(2-((2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基))(甲基)氨基)乙氧基)-4-氧代丁酰基)氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备。

向含有中间体5(26mg，0.084mmol)的二氯甲烷(1.5mL)溶液中，依次加入中间体14a(39mg，0.101mmol)、DMAP(1mg，0.008mmol)、EDCI(24mg，0.126mmol)，室温搅拌8h。加二氯甲烷(5mL)稀释，依次用水(10mL×2)和饱和食盐水(10mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经硅胶柱层析分离(二氯甲烷：甲醇体积比400：1)，淡黄色液体，产率69％。

实施例2

4-(2-((5-(2-((2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)(甲基)氨基)乙氧基)-5-氧戊烷酰基)氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例1，区别在于，区别在于，将(三)中的丁二酸酐替换为戊二酸酐。

本实施例制得黄色蜡状液体，产率71％。

实施例3

4-((4-((4-(2-((2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)(甲基)氨基)乙氧基)-4-氧代丁酰基)氧基)丁-2-炔-1-基)氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例1，区别在于，将(三)中的乙二醇替换为1,4-丁炔二醇。

本实施例制得黄色蜡状液体，产率74％。

实施例4

4-((4-((5-(2-((2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)(甲基)氨基)乙氧基)-5-氧戊烷氧基)丁-2-炔-1-基氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例3，区别在于，将(三)中的丁二酸酐换成戊二酸酐。

本实施例制得黄色蜡状液体，产率73％。

实施例5

4-(2-((4-(2-((2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)(异丙基)氨基)乙氧基)-4-氧代丁酰基)氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例1，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺换成2-(异丙基氨)乙醇。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率58％。

实施例6

4-(2-((5-(2-((2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)(异丙基)氨基)乙氧基)-5-氧戊烷氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例2，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺换成2-(异丙基氨)乙醇。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率68％。

实施例7

4-((4-((4-(2-((2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)(异丙基)氨基)乙氧基)-4-氧代丁酰基)氧基)丁-2-炔-1-基)氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例3，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺换成2-(异丙基氨)乙醇。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率47％。

实施例8

4-((4-((5-(2-((2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)(异丙基氨基)乙氧基)-5-氧戊烷酰基)氧基)丁-2-炔-1-基)氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例4，区别在于，将(一)中的步骤1中的N-甲基-2-羟基乙胺换成2-(异丙基氨)乙醇。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率53％。

实施例9

4-(2-((4-(((S)-1-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)吡咯烷-3-基)氧基)-4-氧代丁酰基)氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例1，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺换成(R)-3-吡咯烷醇。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率68％。

实施例10

4-(2-((5-(((S)-1-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)吡咯烷-3-基)氧基)-5-氧戊烷酰基)氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例2，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺换成(R)-3-吡咯烷醇。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率62％。

实施例11

4-((4-((4-(((S)-1-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)吡咯烷-3-基)氧基)-4-氧代丁酰基)氧基)丁-2-炔-1-基)氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实例3，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺换成(R)-3-吡咯烷醇。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率53％。

实施例12

4-((4-((5-(((S)-1-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)吡咯烷-3-基)氧基)-5-氧戊烷酰基)氧基)丁-2-炔-1-基)氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实例4，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺换成(R)-3-吡咯烷醇。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率63％。

实施例13

4-(2-((4-((1-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)哌啶-4-基)甲氧基)-4-氧代丁酰基)氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例1，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺替换成4-羟甲基哌啶。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率67％。

实施例14

4-(2-((5-((1-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)哌啶-4-基)甲氧基)-5-氧戊烷酰基)氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-恶二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例2，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺替换成4-羟甲基哌啶。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率70％。

实施例15

4-((4-((4-((1-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)哌啶-4-基)甲氧基)-4-氧代丁酰基)氧基)丁-2-炔-1-基)氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例3，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺替换成4-羟甲基哌啶。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率65％。

实施例16

4-((4-((5-((1-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)哌啶-4-基)甲氧基)-5-氧戊烷酰基)氧基)丁-2-炔-1-基)氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例4，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺替换成4-羟甲基哌啶。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率60％。

实施例17

4-(2-((4-((1-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)哌啶-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酰基)氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例1，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺替换成3-羟甲基哌啶。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率70％。

实施例18

4-(2-((5-((1-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)哌啶-3-基)甲氧基)-5-氧戊烷酰基)氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例2，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺替换成3-羟甲基哌啶。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率74％。

实施例19

4-((4-((4-((1-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)哌啶-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酰基)氧基)丁-2炔-1-基)氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-恶二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例3，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺替换成3-羟甲基哌啶。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率70％。

实施例20

4-((4-((5-((1-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)哌啶-3-基)甲氧基)-5-氧戊烷酰基)氧基)丁-2-炔-1-基)氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例4，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺替换成3-羟甲基哌啶。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率73％。

实施例21

4-(2-((4-(2-(4-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)哌嗪-1-基)乙氧基)-4-氧代丁酰基)氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例1，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺替换成N-羟乙基哌嗪。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率53％。

实施例22

4-(2-((4-(2-(4-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)哌嗪-1-基)乙氧基)-4-氧代丁酰基)氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例2，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺替换成N-羟乙基哌嗪。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率56％。

实施例23

4-((4-((4-(2-(4-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)哌嗪-1-基)乙氧基)-4-氧代丁酰基)氧基)丁-2-炔-1-基)氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例3，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺替换成N-羟乙基哌嗪。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率60％。

实施例24

4-((4-((5-(2-(4-(2-((1R,3R,4S)-3-(3-氯丙-1-烯-2-基)-4-甲基-4-乙烯基环己基)烯丙基)哌嗪-1-基)乙氧基)-5-氧戊二酰基)氧基)丁-2-炔-1-基)氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物的制备方法基本同实施例4，区别在于，将(一)中的N-甲基-2-羟基乙胺替换成N-羟乙基哌嗪。

本实施例中制得黄色蜡状液体，产率58％

药效学实验

1.一氧化氮体外释放试验

1.1实验设备与试剂

仪器

多功能酶标仪(美国MD Spectramac M3)

超净工作台(苏州净化)

试剂

磷酸二氢钾(阿拉丁化学试剂有限公司)

磷酸氢二钾(阿拉丁化学试剂有限公司)

L-半胱氨酸(阿拉丁化学试剂有限公司)

1.2实验方法

(1)配制不同浓度的亚硝酸钠溶液绘制校正曲线。

(2)对样品进行处理，配制100μM的溶液，取配好的化合物溶液2.5mL和2.5mL的半胱氨酸溶液37℃孵育120min，不同时间点取样。

(3)设置空白孔和标准孔，收集样本160μL和显色剂0.08mL混匀，37℃静置15min。λ＝550nm，酶标仪测定吸光度OD值，将数值代入标准曲线，即求得NO释放量。

1.3试验结果

表1.实施例1-24制得得β-榄香烯衍生物的NO体外释放结果

由表1中数据可以看出，所有实施例化合物均能有效释放一氧化氮，且绝大多数实施例，随着时间的增加，一氧化氮的释放水平增加。

2.体外抗肿瘤活性评价试验

2.1实验设备与试剂

仪器：

超净工作台(苏州净化设备有限公司)

CO

倒置生物显微镜(日本OLYMPUS)

酶标仪(美国BioTek)

试剂：

青霉素、链霉素混合液(江苏凯基生物技术股份有限公司)

胰蛋白酶消化液(江苏凯基生物技术股份有限公司)

PBS(江苏凯基生物技术股份有限公司)

Fetal Bovine Serum(GIBCO)

RPMI-1640(江苏凯基生物技术股份有限公司)

DMEM(江苏凯基生物技术股份有限公司)

L-15(江苏凯基生物技术股份有限公司)

CCK8(江苏凯基生物技术股份有限公司)

DMSO(SIGMA)

2.2实验方法

(1)将细胞消化、计数，配制细胞悬液(H520,SW620 5.0×104个/mL，U87MG3.5×104个/mL)，96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液；

(2)96孔细胞培养板置于37℃，5％，CO

(3)用培养基稀释药物至所需工作液浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组，阳性对照组；

(4)96孔细胞培养板置于37℃，5％，CO

(5)将96孔板进行CCK-8染色，λ＝450nm，测定OD值；

1)每孔加入10μL CCK-8，在培养箱继续培养2-3小时；

2)摇床10分钟轻轻地混匀，去除96孔板中气泡；

3)λ＝450nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率。

(6)利用下列公式(1)，求得肿瘤细胞生长抑制率；所求结果代入IC

式(1)

2.3实验结果

表2.实施例1-24对3种人类癌细胞株抗增殖活性的抑制率(1μM)

由表2可知，在1μM浓度下，24个化合物对三种人源肿瘤细胞SW620、U87MG和NCI-H520，均表现出不同程度的抑制作用，且抗增殖活性均显著强于β-榄香烯和13,14-双氯-β-榄香烯，表明NO供体的引入，成功提高β-榄香烯的抗肿瘤作用。

表3.优选实施例化合物对3种人类癌细胞株抗增殖活性的IC

如表3所示，绝大部分化合物的抗增殖活性均显著强于β-榄香烯和13,14-双氯-β-榄香烯。对于SW620细胞系，实施例4、14的活性强于β-榄香烯110倍以上；对于U87MG细胞系，实施例2、4、5、6、9、10和22的抗增殖活性强于β-榄香烯250倍以上；对于NCI-H520细胞系，实施例2、4、10、14和22的活性强于β-榄香烯100倍以上。

3.抗脑恶性胶质瘤的体内抗肿瘤活性

3.1受试动物与实验设备

受试动物：

来源、种系、品系：BABLc/裸鼠，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。

实验动物生产许可证：SCXK(沪)2017-0005

合格证编号：20170005040021

实验动物使用许可证：SYXK(苏)2017-0040

日龄：4-5周

性别：雌性

动物数：每组5只，共15只。

实验仪器：

小动物活体三维成像系统

3.2模型的制备

收集培养的人脑胶质瘤U87MG-LUC细胞悬液，浓度为5X10

3.3分组与给药

细胞接种14天后，将动物随机分组，每组5只。同时，各组裸鼠开始给药，给药方案见组别及给药方案。实验结束后，随即处死裸鼠，手术剥取脑组织，拍照、称重。

3.4活体成像检测

每组选2只动物分别在给药前，给药1周，2周，3周后腹腔注射Luc荧光底物,100μL/只，10min后小鼠异氟烷麻醉，放置于仪器暗箱载物台上，进行活体成像检测，观察小鼠脑部原位瘤的荧光情况。

3.5实验结果

如图6和图7所示，β-榄香烯和实施例4给药3周后，小鼠恶性脑胶质瘤的生长得到有效抑制。模型组肿瘤体积持续增大(图6和图7A)，而β-榄香烯和实施例4治疗后，肿瘤体积持续受到抑制，明显小于模型组。从脑重来看，β-榄香烯和实施例4组的重量明显轻于模型组(图7B)，小鼠的生活和身体状况也明显优于模型组。另一方面，模型组胶质瘤的荧光强度持续快速增加，而β-榄香烯和实施例4组的荧光强度则急剧下降。在第一周，实施例4的抑制活性超过80％，明显高于β-榄香烯(>20％)。在第二周，β-榄香烯和实施例4均达到>80％的抑制。在给药的最后一周，实施例4阻止肿瘤生长>90％，表现出强效的抗恶性脑胶质瘤活性。总之，β-榄香烯和实施例4均显示出有效的治疗活性，但实施例4显示出比β-榄香烯更强的抑制作用。

以上结果表明NO供体的引入有效增强了β-榄香烯在体内的抗肿瘤作用，是基于β-榄香烯抗肿瘤药物研发的可行策略。

此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。