一种猪精液低温保存用稀释剂及其制备方法

技术领域

本发明属于动物繁殖技术领域，涉及猪精液保存用稀释剂，尤其涉及一种猪精液低温保存用稀释剂及其制备方法。

背景技术

猪人工授精技术是用人工器械采集公猪精液并对精液进行品质检查和稀释后，再用器械将精液注入发情母猪生殖道内，以代替公猪自然交配的一种配种方法。20世纪80年代在世界范围内迅速普及，目前在使用比较广的欧洲和北美等地区，普及率已超过80％，是进行科学养猪、实现养猪生产现代化的重要手段。它有如下优点：(1)节省公猪，并减少每头公猪的使用次数，克服时间和区域差异，可以方便地适时配种；(2)节省人力、物力、财力，提高经济效益，减少疾病的传播；(3)提高配种率，由于可以利用显微镜、密度仪等仪器对精子质量进行监控，有效提高了配种受胎率，并可及时调整精子质量较差的公猪；(4)增加遗传性能优良的公猪的利用率，扩大良种覆盖率，有利于品种改良和联合育种。在开展猪的人工授精工作中，必须配制公猪精液的稀释液，以便稀释保存。

在生猪繁殖生产中，常温保存的猪精液有效保存期一般为3-5天，这样在一定程度上限制了优质公猪精液的有效利用率。冷冻保存的猪精液，其保存时间长，但解冻后的精子活力较低，导致其受胎率、产仔数降低。相反，用常温保存的猪精液进行人工输精，其繁殖率与自然交配相近，但因保存温度高，精子代谢相对超低温冷冻保存时明显增强，能量消耗过快致使精子体外存活时间缩短，精液有效利用期只有3-5天，致使优质种公猪精液利用率大大降低。

如何在确保受胎率及产仔数的同时，又能延长体外保存时间，最大限度利用优质种公猪资源，是目前养殖业亟待解决的关键问题。猪精液体外保存时，温度直接影响精子的代谢以及存活寿命，而与保存温度相适应的稀释保存剂的配制是人工授精涉及到的关键性技术之一。

研究表明，体外保存过程中，精子活力、存活时间以及质膜、顶体完整率等质量特性直接影响人工输精的受胎率。猪精子与其它哺乳动物的精子类似，在超低温冷冻保存过程中，精子对低温损伤及氧化损伤的抗性较弱，致使精子活力下降，质膜完整率及顶体完整率亦明显降低，人工授精的受孕率及胎仔数均低于自然繁殖(Watson，Anim Reprod Sci，2000，42：251～260.)。Petrunkina等(Theriogenology.2005)从理论上对动物精子冷冻保存作了进一步分析，认为在冻融过程中质膜结构发生变化引起精子的损伤，进而导致冻融精子的死亡或产生类似凋亡现象，从而引起母猪受胎率及产子数降低。理论上，4℃低温保存能够有效延长精液保存时间，避免精子的冷冻及解冻损伤，使精液利用率最大化。

发明内容

本发明为了解决现有技术中的针对低温(4℃-5℃)保存猪精液时所产生的不利因素，提供了一种猪精液低温保存用稀释剂及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种猪精液低温保存用稀释剂，按重量份数计，包括以下原料：葡萄糖25-50份、D-果糖1-10份、柠檬酸三钠2-15份、碳酸氢钠0.5-10份、柠檬酸1-15份、葡聚糖0.2-12份、乙二胺四乙酸二钠1-15份、N-乙酰基-半胱氨酸0.01-10份、盐酸多西环素0.1-5份，氟苯尼考0.01-1份、嗜热菌发酵物0.1-3份与超纯水1000份。

作为本发明的一种优选方案，包括以下原料：葡萄糖30-45份、D-果糖1-8份、柠檬酸三钠4-15份、碳酸氢钠0.5-8份、柠檬酸1-10份、葡聚糖0.5-8份、乙二胺四乙酸二钠1-8份、N-乙酰基-半胱氨酸0.05-5份、盐酸多西环素1-5份，氟苯尼考0.02-0.5份、嗜热菌发酵物0.1-1份与超纯水1000份。

作为本发明的一种优选方案，包括以下原料：葡萄糖35-40份、D-果糖2-5份、柠檬酸三钠4-10份、碳酸氢钠1-4份、柠檬酸2-6份、葡聚糖1-5份、乙二胺四乙酸二钠1-4份、N-乙酰基-半胱氨酸0.1-2份、盐酸多西环素1-3份，氟苯尼考0.05-0.1份、嗜热菌发酵物0.1-0.5份与超纯水1000份。

在本发明中，本发明的猪精液低温保存用稀释剂，有提供能量代谢基础的糖类，离子中间载体，渗透压调节剂，保持精子活力的嗜热菌发酵物以及盐酸多西环素与氟苯尼考等多种成分。本发明的猪精液低温保存用稀释剂能够在低温条件下(4-5℃)为处于类似休眠状态的精子提供能量，用以维持正常的基础代谢活动；能够为处于低温环境中的猪精子提供适宜渗透压、pH内环境，保证精子的正常生理机能；具有良好的保持精子活力，减少氧化损伤和抑制细胞凋亡的作用；同时，可以在一定程度上减少由精子凝聚所引起的精子损伤，最大限度地保存每一个精子所携带的信息，减少精子凝聚对其受精能力的影响，降低精子凝聚对精子参数分析的干扰。嗜热菌发酵物具有较好的抗氧化能力。

作为本发明的一种优选方案，所述的嗜热菌发酵物通过以下方法制得：以葡萄籽与积雪草作为发酵底物，加入嗜热菌，进行发酵，发酵完成后经添加有机溶剂萃取，提取上清液并浓缩得到嗜热菌发酵物。

作为本发明的一种优选方案，所述嗜热菌包括嗜热栖热菌，嗜热链球菌，嗜热芽胞杆菌或海栖热袍菌中的一种。

作为本发明的一种优选方案，所述葡萄籽与积雪草的质量比为3-5:1。

作为本发明的一种优选方案，葡萄籽加入前经过粉碎，粉碎至粒径为3-5μm；积雪草加入前经过粉碎，粉碎至粒径1-2μm。

猪精液低温保存用稀释剂的制备方法，包括以下步骤：

1)按配方量称取葡萄糖、D-果糖、柠檬酸三钠、碳酸氢钠、柠檬酸、葡聚糖、乙二胺四乙酸二钠与N-乙酰基-半胱氨酸溶于超纯水中；

2)加入嗜热菌发酵物，盐酸多西环素与氟苯尼考，超声混合，得到猪精液低温保存用稀释剂。

作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，超声混合是在600～800W的功率下，超声10-30s。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明的猪精液低温保存用稀释剂在4℃条件下体外保存猪精液，既克服了超低温冷冻保存对精子造成的机械性损伤，又能避免17℃条件下体外保存精子寿命缩短的缺陷；

2)本发明的猪精液低温保存用稀释剂，具有良好的保持精子活力，减少氧化损伤和抑制细胞凋亡的作用；

3)本发明的猪精液低温保存用稀释剂在一定程度上减少由精子凝聚所引起的精子损伤，最大限度地保存每一个精子所携带的信息，减少精子凝聚对其受精能力的影响，降低精子凝聚对精子参数分析的干扰。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中所用的嗜热菌发酵物通过以下方法制得：以质量比为3-5:1的葡萄籽与积雪草作为发酵底物，加入嗜热栖热菌(嗜热栖热菌的添加量为葡萄籽与积雪草总重量的0.01％)，进行发酵，发酵温度60-80℃，时间2-10h，发酵完成后经添加有机溶剂萃取，提取上清液并浓缩得到嗜热菌发酵物；葡萄籽加入前经过粉碎，粉碎至粒径为3-5μm；积雪草加入前经过粉碎，粉碎至粒径1-2μm。

实施例1

本实施例提供了猪精液低温保存用稀释剂，按重量份计包括：葡萄糖35份、D-果糖2份、柠檬酸三钠4份、碳酸氢钠1份、柠檬酸2份、葡聚糖1份、乙二胺四乙酸二钠1份、N-乙酰基-半胱氨酸0.1份、盐酸多西环素1份，氟苯尼考0.08份、嗜热菌发酵物0.2份与超纯水1000份。

实施例2

本实施例提供了猪精液低温保存用稀释剂，按重量份计包括：葡萄糖40份、D-果糖5份、柠檬酸三钠10份、碳酸氢钠4份、柠檬酸6份、葡聚糖5份、乙二胺四乙酸二钠4份、N-乙酰基-半胱氨酸2份、盐酸多西环素3份，氟苯尼考0.05份、嗜热菌发酵物0.5份与超纯水1000份。

实施例3

本实施例提供了猪精液低温保存用稀释剂，按重量份计包括：葡萄糖32份、D-果糖3份、柠檬酸三钠8份、碳酸氢钠2份、柠檬酸4份、葡聚糖2份、乙二胺四乙酸二钠3份、N-乙酰基-半胱氨酸1份、盐酸多西环素2份，氟苯尼考0.1份、嗜热菌发酵物0.1份与超纯水1000份。

对比例1，与实施例1相同，唯一不同的是不加入嗜热菌发酵物。

对实施例1-3制得的猪精液低温保存用稀释剂与对比例1制得的保存用稀释剂，进行实验，表1是体外低温(4-5℃)保存7天后，精力活力参数值比较。从表1中可以看出，实施例1-3的精子MOT比例和PRO比例明显高于对比例1。

表1.精力活力参数结果

由表1可见，本发明的猪精液低温保存用稀释剂，具有良好的保持精子活力，减少氧化损伤和抑制细胞凋亡的作用；在一定程度上减少由精子凝聚所引起的精子损伤，最大限度地保存每一个精子所携带的信息，减少精子凝聚对其受精能力的影响，降低精子凝聚对精子参数分析的干扰。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。