高效核酸酶生产酵母工程菌的构建及应用

技术领域

本发明涉及基因工程和蛋白质工程领域，具体地涉及一种高效核酸酶生产酵母工程菌的构建及应用。

背景技术

随着生物医药的发展，重组蛋白在制药工业上运用越来越广泛，不仅能直接用于治疗，也是关键的生物试剂，是创新药研发的核心原料。利用微生物生产重组蛋白是一种经济、高效的方式，但在微生物生产重组蛋白的过程中仍然会存在很多难题。比如：在细胞内重组表达目的蛋白的过程中，核酸就是一类常见的杂质分子，它不仅能增加裂解液的粘度，影响下游的纯化层析；过量的核酸还将导致纯化产品的核酸污染，从生物制药的角度来说，一定长度的宿主DNA片段残留具有致癌的风险。所以在重组蛋白生产过程中，控制核酸的含量至关重要。

来源于灵杆菌的商品化核酸酶(例如Benzonase核酸酶)由于具有较高的催化效率，是生物化学和药物制剂领域重要的核酸污染控制用酶。目前，核酸酶的重组表达多在原核系统中进行，然而核酸酶的细胞内重组表达往往存在对宿主细胞的高毒性，从而导致宿主很难生长或者以无活性的包涵体形式表达。有研究(例如CN113234704A)表明通过加入可溶标签解决部分包涵体问题，但是这样的操作会引入标签蛋白，导致重组蛋白的比酶活偏低。另外一些研究(例如US5173418A)尝试使用大肠杆菌分泌表达，但由于分泌效率较低，仍无法有效解决胞内产物难以收获和纯化的问题。此外，由大肠杆菌引入的内毒素也增加了后续对蛋白的纯化操作上的难度。也有研究(例如CN109852633A)表明可以使用芽孢杆菌进行分泌表达核酸酶，但因存在潜在的污染风险，不易放大生产。因而，利用原核系统表达核酸酶存在较大技术障碍。

仍需要一种改进的核酸酶生产系统，其能够克服传统表达系统对宿主细胞毒性高、核酸酶比酶活低、后续纯化步骤繁琐等问题，提供高效核酸酶生产。

发明内容

发明人经长期研究发现并构建了一种高效核酸酶生产酵母工程菌。该酵母工程菌能够克服核酸酶表达对宿主细胞的毒性问题，以高分泌效率生产高效核酸酶，且易于纯化，具有广阔的应用前景。

一方面，本文提供一种源自灵杆菌核酸酶的变体核酸酶，其具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。

另一方面，本文提供所述变体核酸酶的编码多核苷酸。

另一方面，本文提供一种酵母表达载体，其含有本文所述变体核酸酶的编码多核苷酸。

另一方面，本文提供一种宿主细胞，其选自：

(a)染色体中整合有所述变体核酸酶的编码多核苷酸的细胞；和

(b)含有所述酵母表达载体的细胞。

另一方面，本文提供一种酵母工程菌，其包含所述变体核酸酶的编码多核苷酸。

另一方面，本文提供一种构建酵母工程菌的方法，其包括：将所述变体核酸酶的编码多核苷酸引入酵母菌。

另一方面，本文提供一种制备所述变体核酸酶的方法，其包括：

(i)在适于表达的条件下，培养本文所述的酵母工程菌，使其表达所述变体核酸酶；和，

(ii)从所述酵母工程菌的培养物纯化变体核酸酶。

另一方面，本文提供所述变体核酸酶用于控制核酸污染的用途。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。

图1显示了根据本发明说明性实施例中pJAG–s1-M-NucA质粒经过Sac I酶切线性化后的电泳胶图。泳道从左至右分别为：分子梯标，质粒pJAG–s1-M-NucA，Sac I酶切质粒pJAG–s1-M-NucA的线性化片段。

图2显示了根据本发明说明性实施例中表达的变体核酸酶的SDS-PAGE电泳图。泳道从左至右分别为：分子量梯标，表达变体核酸酶的重组酵母克隆1发酵液上清，表达变体核酸酶的重组酵母克隆2发酵液上清，表达变体核酸酶的重组酵母克隆3发酵液上清，表达变体核酸酶的重组酵母克隆4发酵液上清，表达变体核酸酶的重组酵母克隆5发酵液上清。

图3显示了根据本发明说明性实施例中表达的变体核酸酶蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图。泳道从左至右分别为：分子量梯标，未纯化的变体核酸酶，纯化后的变体核酸酶。

图4显示了根据本发明说明性实施例中表达的变体核酸酶蛋白的糖基化分析。泳道从左至右分别为：分子量梯标，纯化后的变体核酸酶，经过PNGase F酶处理后的变体核酸酶，PNGase F酶。

具体实施方式

本申请中科技术语的含意与本领域技术人员的普遍理解一致，除非另做说明。本申请中，“一”或其与各种量词的组合既包括单数含意也包括复数含意，除非特别说明。本申请中，对于同一参数或变量，当给出多个数值、数值范围、或其组合予以说明时，相当于具体揭示了这些数值、范围端值以及由它们任意组合而成的数值范围。本申请中，任一数值不论是否带有“约”之类的修饰词，一律涵盖本领域技术人员能够理解的约略范围，例如正负10％、5％等。本文中，每一“实施方式”均同等地指代且涵盖了本申请各项方法和各项系统的实施方式。本申请中，任意实施方式中一项或多项技术特征可以与任何一个或多个其他实施方式中的一项或多项技术特征自由组合，由此得到的实施方式同样属于本申请公开的内容。

核酸酶是以核酸为底物，催化磷酸二酯键水解的一类酶。一般核酸酶可以分为DNA酶、RNA酶和非特异性核酸酶三类。其中非特异性核酸酶的专一性较低，能非特异性地降解几乎所有形式的核酸，包括单链、双链、线状、环状和超螺旋形式的DNA和RNA，且对核酸的序列没有要求。非特异核酸酶广泛存在于病毒，细菌，真菌和动物细胞等多种生物中。非特异核酸酶在很多生化过程中起重要作用，包括DNA的复制和修复；DNA/RNA的重组、成熟和编辑；宿主抵抗外来核酸分子等等。非特异性核酸酶在工业上主要用于生物制品中外源核酸的去除，提高安全性。同时，非特异核酸酶还能应用于新型生物消毒剂的研制，它能裂解细菌和病毒的核酸物质，从而达到消毒杀菌的目的。相比化学消毒剂，非特异核酸酶是一种理想的绿色环保消毒制剂，不污染环境，对机体无任何毒副作用。目前，已报道多种非特异性核酸酶，如牛胰岛DNase I，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)核酸酶和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescen)(又称灵杆菌)胞外核酸酶等。迄今，研究最多的非特异核酸酶是灵杆菌核酸酶。目前灵杆菌核酸酶已有商业化产品推出，包括例如默克公司(Merck)以商品名“Benzonase”市售的核酸内切酶，它作为一种工具在工业生产中被用于去除生物制品中的核酸污染。

目前，灵杆菌核酸酶的重组表达在原核系统中进行，然而其胞内重组表达往往对宿主细胞具有高毒性，从而导致宿主难以生长或以无活性的包涵体形式表达。人们已尝试对原核表达系统做出改进，但它们通常会引入诸如重组蛋白比酶活低、产物难以收获纯化，或存在潜在污染风险等的新问题。

发明人经长期研究，通过灵杆菌核酸酶的工程改造与表达宿主的探索筛选，发现并构建了一种高效核酸酶真核表达系统。该表达系统所用宿主除易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵优势外，还具备高效的蛋白修饰系统和蛋白分泌系统，其不仅能够克服核酸酶表达对宿主(例如原核宿主)带来的高毒性，而且能够以高分泌效率生产核酸酶变体，所产核酸酶变体具有高比酶活且易于纯化。该表达系统能够适用于大规模生产，且能够有效简化纯化工艺，提高纯化效率，降低胞内杂质的污染风险。

一方面，本文提供一种核酸酶，其为灵杆菌核酸酶的变体，在本文中也称为“变体核酸酶”。本文中，术语“变体”指“变体蛋白”意指天然不存在的蛋白质，其通过遗传工程改造或随机突变获得，即，经工程改造的蛋白质。所述变体核酸酶为非特异性核酸酶。

所述变体核酸酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)基于灵杆菌核酸酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)经氨基酸突变生成。具体地，所述氨基酸突变包括：由丙氨酸替换原始氨基酸序列第22位的天冬酰胺(N22A)，和，由丙氨酸替换原始氨基酸序列第34位的天冬酰胺(N34A)，氨基酸残基位置编号基于灵杆菌核酸酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，所述变体核酸酶具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。

灵杆菌核酸酶的氨基酸序列：

MADTLESIDNCAVGCPTGGSSNVSIVRHAYTLNNNSTTKFANWVAYHITKDTPASGKTRNWKTDPALNPADTLAPADYTGANAALKVDRGHQAPLASLAGVSDWESLNYLSNITPQKSDLNQGAWARLEDQERKLIDRADISSVYTVTGPLYERDMGKLPGTQKAHTIPSAYWKVIFINNSPAVNHYAAFLFDQNTPKGADFCQFRVTVDEIEKRTGLIIWAGLPDDVQASLKSKPGVLPELMGCKN(SEQ ID NO:1)。

变体核酸酶的氨基酸序列：

MADTLESIDNCAVGCPTGGSS

应理解，变体核酸酶可基于灵杆菌核酸酶的氨基酸序列通过本领域已知的遗传修饰方法而获得。在一些实施方式中，变体核酸酶可通过对灵杆菌核酸酶进行定点突变以引入所需氨基酸替换而获得。在一个示例性实施方式中，定点突变可包括：通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向灵杆菌核酸酶的编码多核苷酸引入所需氨基酸替换(例如包括N22A和N34A)的对应密码子以获得经修饰编码多核苷酸，并表达该经修饰编码多核苷酸而获得。在另一些实施方式中，变体核酸酶也可通过人工合成含有所需氨基酸替换密码子的变体核酸酶的编码多核苷酸，并表达该变体核酸酶的编码多核苷酸来获得。

在一些实施方式中，所述变体核酸酶是在酵母中表达获得的。在一些实施方式中，所述变体核酸酶是在选自下组的酵母中表达获得的：毕赤酵母、酿酒酵母、多型汉逊酵母及其任意组合。

在一些实施方式中，所述变体核酸酶具有至少1.8×10

在一些实施方式中，与市售Benzonase核酸酶(例如默克公司市售的Benzonase核酸酶)的比酶活相比，所述变体核酸酶的比酶活提高至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少160％、至少170％，或至少180％。

另一方面，本文提供所述变体核酸酶的编码多核苷酸。

另一方面，本文提供一种酵母表达载体，其含有本文所述变体核酸酶的编码多核苷酸。

在一些实施方式中，所述酵母表达载体包括但不限于：酿酒酵母表达载体、毕赤酵母表达载体和多型汉逊酵母表达载体。在一些实施方式中，所述酵母表达载体是毕赤酵母表达载体。

在一些实施方式中，所述酵母表达载体包括但不限于：pJAG–s1载体、pPICZ载体、pPICZα载体、pPIC9k载体、pPIC9k-His载体、pGAPZA载体、pGAPZαA载体、pGAPZαA载体、pAO815载体、pPIC9载体、pPIC6A载体、pPIC6αA载体、pAUR123载体、pRS303TEF载体、pRS304载体、pRS305载体、pRS306载体、pY13TEF载体、pY14TEF载体、pY15TEF载体、pY16TEF载体和pYES2载体等。在一些示例性的实施方式中，所述酵母表达载体为含有所述变体核酸酶的编码多核苷酸的pJAG–s1载体。

在一些实施方式中，所述酵母表达载体通过将变体核酸酶的编码多核苷酸克隆进入空白载体而获得。在一些实施方式中，变体核酸酶的编码多核苷酸被整合至启动子的下游。在一些实施方式中，合适的启动子的示例包括但不限于：AOX1启动子、GAP启动子、ADH启动子等。在一些实施方式中，所述酵母表达载体包含α-因子信号肽编码序列。

另一方面，本文提供一种宿主细胞，其选自：

(a)染色体中整合有所述变体核酸酶的编码多核苷酸的细胞；和

(b)含有所述酵母表达载体的细胞。

在一些实施方式中，所述宿主细胞选自：原核细胞、真核细胞，及其组合。在一些实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。在另一些实施方式中，所述宿主细胞是酵母细胞。在一些实施方式中，所述酵母细胞包括但不限于：酿酒酵母细胞、毕赤酵母细胞和多型汉逊酵母细胞。

另一方面，本文提供一种酵母工程菌，其包含所述变体核酸酶的编码多核苷酸。

在一些实施方式中，所述酵母工程菌表达所述变体核酸酶。在一些实施方式中，所述酵母工程菌表达并分泌所述变体核酸酶。

另一方面，本文提供一种构建酵母工程菌的方法，其包括：将所述变体核酸酶的编码多核苷酸引入酵母菌。

在一些实施方式中，所述酵母菌可包括但不限于：酿酒酵母、毕赤酵母和多型汉逊酵母。在一些实施方式中，所述酵母菌为毕赤酵母BG10。

在一些实施方式中，所述构建酵母工程菌的方法可包括：将所述变体核酸酶的编码多核苷酸转染、转化或转导至酵母菌。

另一方面，本文提供一种制备所述变体核酸酶的方法，其包括：

(i)在适于表达的条件下，培养本文所述的酵母工程菌，使其表达所述变体核酸酶；和，

(ii)从所述酵母工程菌的培养物纯化变体核酸酶。

在一些实施方式中，所述变体核酸酶在AOX1启动子的控制下进行转录和表达。在一些实施方式中，所述变体核酸酶在α-因子信号肽的作用下分泌表达至培养基中。在一些实施方式中，所述变体核酸酶在甲醇诱导下表达。

在一些实施方式中，步骤(ii)中的纯化包括从酵母工程菌的培养物收集上清液。

在一些实施方式中，所述纯化包括对步骤(ii)中收集的上清液进行过滤、超滤、渗滤、离子交换中的一项或多项操作。

在一些实施方式中，所述制备所述变体核酸酶的方法的步骤(ii)不包括收菌、洗菌、细胞裂解、澄清中的一项或多项操作。在一些实施方式中，所述制备所述变体核酸酶的方法的步骤(ii)不包括收菌、洗菌、细胞裂解、澄清中的任一项操作。本文中所用术语“澄清”意指固液分离操作，例如，使细胞培养物中的固体(包括细胞和细胞碎片等)与液体(例如上清液)分离的操作。

由于本发明的酵母工程菌能将所述变体核酸酶表达分泌至培养基中，所述变体核酸酶的纯化仅需要收集培养上清液、精细纯化、超滤/渗滤3项操作，纯度即能达到90％以上。相较而言，采用原核生物表达系统的核酸酶纯化至少需要进行收菌、洗菌、细胞裂解、澄清、粗分离、精细纯化、超滤/渗滤7项操作。采用本申请的酵母工程菌制备变体核酸酶大幅减少了下游纯化操作的步骤。

另一方面，本文提供所述变体核酸酶用于控制核酸污染的用途。

在一些实施方式中，所述核酸污染为产品或环境中的核酸污染。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

一、构建表达变体核酸酶基因的质粒和构建表达变体核酸酶重组酵母

获取灵杆菌非特异性核酸酶序列NucA，并进行定点突变成序列M-NucA(原始NucA序列见SEQ ID NO:1，突变后的氨基酸序列见SEQ ID NO:2)。将经突变的M-NucA基因克隆至pJAG–s1载体上，并转化至大肠杆菌中。该重组的大肠杆菌在含有LB+100μg/mL Amp的培养基中培养，扩增pJAG-s1-M-NucA质粒。随后，使用SacI内切酶线性化质粒。

图1显示了pJAG–s1-M-NucA质粒经过Sac I酶切线性化后的电泳胶图。泳道从左至右分别为：分子梯标，质粒pJAG–s1-M-NucA，Sac I酶切质粒pJAG–s1-M-NucA的线性化片段。

线性化质粒经过纯化后电转化至毕赤酵母BG10中，再使用YPD+1.5g/LG418抗性平板筛选出阳性重组酵母菌BG10/pJAG-s1-M-NucA。

二、酵母诱导表达变体核酸酶

将阳性重组酵母菌BG10/pJAG-s1-M-NucA单克隆接种于YPD培养基中，30℃，250rpm培养24h后，按照OD

变体核酸酶在启动子AOX1的控制下表达，在α因子信号肽的作用下分泌至培养基中。

图2显示了表达的变体核酸酶的SDS-PAGE电泳图，检测上清液蛋白质大小为为30Kda。泳道从左至右分别为：分子量梯标，表达变体核酸酶的重组酵母克隆1发酵液上清，表达变体核酸酶的重组酵母克隆2发酵液上清，表达变体核酸酶的重组酵母克隆3发酵液上清，表达变体核酸酶的重组酵母克隆4发酵液上清，表达变体核酸酶的重组酵母克隆5发酵液上清。

三、变体核酸酶小样纯化

收集发酵液上清，使用0.22μM滤膜过滤。使用10KDa超滤管对发酵液上清进行换液至50mM Tris-HCl，pH＝8.2中。随后处理商业的阴离子交换填料，使用50mM Tris-HCl，pH8.2平衡3次后，加入蛋白质样品，室温孵育60分钟后，离心去除上清液蛋白质。分别加入50mM Tris-HCl，pH 8.2清洗三次，50mM Tris-HCl，25mM NaCl pH 8.2清洗三次，使用50mMTris-HCl，100mM NaCl进行洗脱。洗脱后的蛋白质进行SDS-PAGE检测，根据灰度分析，蛋白质纯度可达92％(图3)。

图3显示了表达的变体核酸酶蛋白经纯化后的SDS-PAGE电泳图。泳道从左到右分别为：分子量梯标，未纯化的变体核酸酶，纯化后的变体核酸酶。

与传统的使用原核表达系统(例如大肠杆菌)表达核酸酶比较，后续纯化步骤由传统的收菌、洗菌、细胞裂解、澄清、粗分离、精细纯化、超滤/渗滤7步减少到收集上清液、精细纯化、超滤/渗滤3步，大幅减少了下游纯化操作步骤。

四、变体核酸酶的酶活分析

将在37℃，pH 8.0的反应条件下，于2.625mL反应体系中，于30分钟内使△A260吸收值变化1.0所用的酶量定义为一个活性单位U。据报道，核酸酶在终浓度1～2mmol/L Mg

测得变体核酸酶比酶活值为2.9×10

五、PNG酶F(PNGase F)分析核酸酶糖基化

在变性条件下对目标蛋白进行去糖基化，向目标蛋白中加入5％ SDS、1M DTT，100℃煮沸变性后加入0.5M磷酸钠缓冲液(pH 7.5)、10％Triton X-100、PNGase F，37℃孵育1h，然后对样品进行SDS-PAGE分析(图4)，结果表明本发明的变体核酸酶具有单一N-糖基化位点。

结果显示，采用本发明提供的酵母工程菌分泌表达变体核酸酶解决了核酸酶表达对宿主细胞的毒性问题，且生产变体核酸酶具有单一糖基化修饰、比酶活高，易纯化等优势，具有广阔的应用前景。