可生物降解的共聚物和其纳米纤维支架

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2020年4月23日提交的美国临时专利申请第63/014,484号的权益，所述美国临时专利申请的全部内容特此通过引用并入本文。

美国政府支持声明

本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号HL114038和HL136231在政府支持下进行的。政府拥有本发明的某些权利。

背景技术

可生物降解的聚合物广泛用于生物医学应用，如组织工程化支架、药物释放微米/纳米颗粒和植入物。然而，对于此类应用中的许多应用，通常需要合理的高分子量(HMW)以将此类聚合物加工成期望的物理形式和/或具有期望的机械和功能特性。不幸的是，合成HMW聚合物(如100kDa以上)通常需要高温，延长的反应时间段和昂贵的专用反应容器。

发明内容

本公开的一方面提供了一种可生物降解的共聚物，其包括以下结构：

其中每个R

本公开的另一方面提供了一种内酯聚合的方法，所述方法包括：将以下混合：(a)包括内酯单体和溶剂的冷却的混合物，所述混合物的温度为约-30℃至约-110℃；以及(b)基于单体的总摩尔，任选地在溶剂中的约0.01mol％至约5mol％的胍衍生物，以形成内酯聚合物，其中混合时，基于溶剂的总体积，内酯单体的浓度为约15w/v％或更低。

本公开的另一方面提供了一种纳米纤维支架，其包括本公开的可生物降解的共聚物、聚螺丙交酯或其组合。

本公开的另一方面提供了一种使组织再生的方法，所述方法包括将本公开的纳米纤维支架植入在组织中。

附图说明

图1A-1E描绘了聚螺丙交酯(PSLA)和前体单体螺丙交酯的表征：图1A示出了CDCl

图2A-2C描绘了可以被后修饰的本公开的PSLA/PLLA管状纳米纤维支架的制造；图2A示出了使用在心轴上退火的糖模板用于制造管状多孔和互连网络的制造方法；图2B示出了高度多孔、互连和纳米纤维的PSLA/PLLA层的概述和SEM表征；并且图2C示出了聚(己内酯)(PCL)致密层的可视化，所述致密层是静电纺丝的以提供增强的机械支撑。

图3A-3G描绘了本公开的PSLA/PLLA纳米纤维支架的后修饰和表征；图3A示出了通过硫醇-烯点击化学用肝素对共聚物的PSLA进行的后修饰方案；图3B示出了展示修饰前后变化的FTIR光谱图；图3C示出了管状支架后修饰的SEM可视化；图3D示出了PLLA的共焦图像；图3E示出了用FITC-PEG-SH修饰的PSLA的共焦图像；图3F示出了随着肝素浓度的增加亲水性的变化相对于PLLA、未修饰的PSLA和经修饰的PSLA薄膜的水滴形状、接触角量化以及比较的变化；并且图3G示出了描绘每个接触角的曲线图。

图4A-4C描绘了肝素缀合后本公开的PLLA/PSLA支架的降解和质量损失；图4A示出了与肝素缀合的PLLA/PSLA支架在第3周开始分解，所有其它组在实验结束时完好无损，而PLLA支架示出最小的降解；图4B示出了与没有肝素缀合的PLLA和PLLA/PSLA支架相比，由于PLLA/PSLA支架上的肝素缀合导致的支架质量损失随时间的量化；并且图4C示出了第0天支架的SEM表征和第35天支架降解。

图5A-5H描绘了植入的支架术后的各种图像以及术后时间对内径的曲线图。图5A和5B示出了本公开的植入的支架的手术图像(图5A：植入后立即；图5B：术后3个月)；图5C-5E示出了本公开的纳米纤维血管支架在大鼠腹主动脉介入植入物之前(图5C)、术后3个月(图5D)和天然大鼠腹主动脉(图5E)的形态；图5F和5G示出了植入的支架在术后3个月的超声图像；并且图H是3个月期间天然主动脉与组织工程化血管(TEBV)的比较曲线图。

图6A描绘了通过H&E染色比较本公开的植入的支架的吻合处和中间部位的血管平滑肌重建；(A，B)术后1周从支架吻合部位放大10倍和40倍；(C，D)术后1周从支架中间部位放大10倍和40倍；(E，F)术后2周从支架吻合部位放大10倍和40倍；(G，H)术后2周从支架中间部位放大10倍和40倍；(I，J)术后1个月从支架吻合部位放大10倍和40倍；(K，L)术后1个月从支架中间部位放大10倍和40倍；(M，N)术后3个月从支架吻合部位放大10倍和40倍；(O，P)术后3个月从支架中间部位放大10倍和40倍；图B示出了(Q，R)从大鼠的天然主动脉放大10倍和40倍。(比例尺：对于A、C、E、G、I、K、M、O、Q＝400um；对于B、D、F、H、J、L、N、P、R＝40um)。

图7描绘了在植入1个月和3个月后在本公开的植入的支架的部位处血管细胞外基质重建的比较；(A，B)通过马森三色染色(Masson trichrome staining)从大鼠的天然主动脉放大10倍和40倍；(C，D)通过伟郝夫范吉森染色(VerhoeffVan Gieson staining)从大鼠的天然主动脉放大10倍和40倍；(E，F)通过马森三色染色在术后1个月从植入的支架放大10倍和40倍；(G，H)通过伟郝夫范吉森染色在术后1个月从植入的支架放大10倍和40倍；(I，J)通过马森三色染色在术后3个月从植入的支架放大10倍和40倍；(K，L)通过伟郝夫范吉森染色在术后3个月从植入的支架放大10倍和40倍。(比例尺：对于A、C、E、G、J、K＝400um；对于B、D、F、H、J、L＝40um)。

图8A-8C描绘了平滑肌细胞标志物SM22的免疫荧光染色，表明术后1个月和术后3个月本公开的支架中的平滑肌细胞浸润和大鼠主动脉重建；图8A是荧光染色，其中，A)示出了SM22在大鼠天然主动脉中的荧光染色；B)示出了在术后1个月植入的支架中SM22的荧光染色；并且C)示出了在术后3个月植入的支架中SM22的荧光。图8B示出了DAPI，其中，D)DAPI示出了大鼠天然主动脉中的细胞核；E)DAPI示出了术后1个月植入的支架中的细胞核；并且F)DAPI示出了术后3个月植入的支架中的细胞核。图8C示出了荧光和DAPI的合并图像，其中G)是大鼠天然主动脉中的荧光和DAPI的合并图像；H)是术后1个月植入的支架中的荧光和DAPI的合并图像；并且I)是在术后3个月植入的支架中的荧光和DAPI的合并。(比例尺＝40um)。

图9描绘了本公开的植入的支架的内皮标志物vWF的免疫组织化学染色；A)大鼠天然主动脉；B)术后2周；C)术后1个月；D)术后3个月。(比例尺＝40um)。

具体实施方式

本文提供了可生物降解的共聚物、制作可生物降解的共聚物的方法以及由其制成的纳米纤维支架。本文所公开的可生物降解的共聚物可以包括以下结构：

本公开的可生物降解的共聚物可以提供一个或多个优点，包含但不限于：1)具有高分子量，适于为支架提供必要的机械完整性以用于活体，例如血管移植；和/或2)具有如体外生物降解等足够的生物降解，其中例如本文所公开的可生物降解的共聚物可以在10mL的1M PBS，pH 7.4中降解，并且在37℃下温育，从而导致20-25％的质量损失或更多。

本文还提供了内酯聚合的方法。如用于制备本公开的可生物降解的共聚物的内酯聚合的方法可以包括两个步骤。第一步骤(步骤(a))可以包括将溶剂中的单体混合物冷却到约-30℃至约-110℃以形成冷却的混合物。第二步骤(步骤(b))可以包括将冷却的混合物与胍衍生物混合以形成可生物降解的聚合物，其中在第二步骤中，基于溶剂的总体积，单体的浓度为约15w/v％或更少，如约0.1w/v％至约15w/v％、约1w/v％至约15w/v％、约3w/v％至约15w/v％、约3w/v％、约5w/v％、约7.5w/v％、约10w/v％、约12.5w/v％或约15w/v％。

本文还提供了纳米纤维支架。本文所公开的纳米纤维支架可以包括本公开的可生物降解的共聚物、聚螺丙交酯或其组合。纳米纤维支架可以用于使组织再生的方法。使组织再生的方法可以包括将本公开的纳米纤维支架植入在组织中。

受益于前述描述和相关联附图中呈现的教导的所公开的化合物和方法所属领域的技术人员将想到本文所公开的许多修改和其它实施例。因此，应理解，本公开不应限于所公开的具体实施例，并且修改和其它实施例旨在被包含在所附权利要求的范围内。尽管本文采用了具体术语，但其仅用于一般性和描述性意义，而不是出于限制的目的。

还应当理解，本文所使用的术语仅为了描述具体方面，而并非旨在进行限制。如说明书和权利要求中所使用的，术语“包括”可以包含以下方面：“基本上由...组成”和“由...组成”。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语均具有与所公开的组合物和方法所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含有。在本说明书和随后的权利要求书中，将参考应在本文中定义的若干术语。

如对于本领域技术人员将显而易见的是，在阅读本公开时，本文描述和说明的单独实施例中的每一个均具有离散的组成部分和特征，所述组成部分和特征可以在不偏离本公开的范围或精神的情况下易于与任何其它若干实施例的特征分离或组合。任何所叙述的方法都可以按所描述的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序执行。

定义

如本文所使用的，术语“烷基”是指含有一至二十二个碳原子(例如，一至二十个碳原子或一至十个碳原子)的直链和支链饱和烃基。术语C

如本文所使用的，术语“环烷基”是指含有五至十二个碳原子，例如五至十、五至八个碳原子或五至七个碳原子(例如，5、6、7、8个碳原子)的脂肪族单环或多环烃环。术语C

如本文所使用的，术语“杂环烷基”与环烷基类似地定义，不同之处在于，环含有一个至四个独立地选自氧、氮和硫的杂原子。具体地说，术语“杂环烷基”是指总共含有五至二十个原子，例如五至十五个原子、五至十二个或五至十个原子的环，其中这些原子中的1个、2个、3个或4个原子是独立地选自由氧、氮和硫组成的组的杂原子，并且环中其余的原子是碳原子。杂环烷基环的非限制性实例包含哌啶、吡唑烷、四氢呋喃、四氢吡喃、二氢呋喃和吗啉。本文所述的杂环烷基可以是单独的，或与另一个杂环烷基、环烷基、芳基和/或杂芳基稠合。在一些实施例中，本文所描述的杂环烷基包括一个氧环原子(例如，环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基和四氢吡喃基)。杂环烷基可以包含一个或多个不饱和键，但不是芳香族的。除非另有说明，否则杂环烷基可以是未经取代的或经取代的杂环烷基。

如本文所使用的，术语“烯基”与“烷基”定义相同，不同的是含有至少一个碳-碳双键，并且具有两至三十个碳原子，例如两至二十个碳原子或两至十个碳原子。术语Cn意指烯基具有“n”个碳原子。例如，C

如本文所使用的，术语“环烯基”与“环烷基”定义相同，不同的是含有至少一个碳-碳双键并且含有三至二十个碳原子(例如，3、4、5、6、7、8、10、12、14、15、16、17、18、19或20个碳原子)。术语C

如本文所使用的，术语“芳基”是指单环或多环(例如，稠合双环和稠合三环)碳环芳香族环系统。术语C

如本文所使用的，术语“杂芳基”是指具有总共五至二十个环原子的单环或多环芳香族环系统(例如，具有总共5-12个环原子的单环芳香族环)，其中这些原子中的1个、2个、3个或4个原子是独立地选自由氧、氮和硫组成的组的杂原子，并且环中其余的原子是碳原子。除非另有说明，否则杂芳基环可以是未经取代的或被一个或多个(并且具体地说，一至四个)取代基取代，所述取代基选自例如卤基、烷基、烯基、OCF

如本文所使用的，术语“环状基团”是指包括环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烯基、杂环烯基或其组合的任何环结构。除非另有说明，否则环状基团可以是未经取代的或经取代的环状基团。如本文所使用的，术语“双环基团”是指包含两个、三个或更多个环的环状基团，其可以包含共享至少两个键和三个原子的杂原子。双环基团可以是例如金刚烷基、降冰片基、十氢萘基、八氢-1H-茚基、双环[2.2.2]辛基、八氢戊烯基等。在实施例中，双环基团可以包含碳-碳双键官能团。

如本文所使用的，术语“羟基(hydroxy)”或“羟基(hydroxyl)”是指“-OH”基团。如本文所使用的，术语“硫醇”是指“-SH”基团。

如本文所使用的，术语“羧基(carboxy)”或“羧基(carboxyl)”是指-C(＝O)OH基团并且术语“羧酸酯”是指-C(＝O)O-基团。羧酸酯基团可以与碱金属或碱土金属阳离子缔合。

如本文所使用的，术语“卤基”定义为氟、氯、溴和碘。术语“卤代烷基”是指被至少一个卤原子取代的烷基，并且包含全卤化烷基(即，所有氢原子被卤原子取代)。

如本文所使用的，术语“氨基”是指-NH

如本文所使用的，术语“酯”是指-C(＝O)-O-R基团，其中R基团是烷基、环烷基、芳基等。

如本文所使用的，术语“经取代的”，当用于修饰化学官能团时，是指官能团上的至少一个氢基团被取代基取代。取代基可以包含但不限于烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、杂环烷基、杂环烯基、醚、聚醚、硫醚、聚硫醚、芳基、杂芳基、羟基、氧基、烷氧基、杂烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酯、硫酯、羧基、氰基、硝基、氨基、酰胺基、乙酰胺和卤基(例如，氟、氯、溴或碘)。当化学官能团包含一个以上的取代基时，所述取代基可以结合到相同的碳原子上，或者结合到两个或多个不同的碳原子上。

当指示取代基任选地被取代时，这意指可用氢中的一个或多个可用氢被不同的部分取代。

如本文所使用的，术语“点击化学反应对”是指能够进行“点击化学”反应的一对互补官能团。如本文所使用的，“点击化学反应对的第一官能团”是指能够进行“点击化学”反应的一对互补官能团中的一个。通常，点击化学反应主要有四类：1)环加成；2)亲核开环；3)非羟醛型羰基化学；以及4)碳-碳多键加成。点击化学反应对可以是与上文示出的四类点击化学反应相容的一对互补官能团，如硫醇/烯烃、叠氮化物/炔烃、叠氮化物/烯烃、烯烃/四嗪、异腈/四嗪等。点击化学反应对的另外的实例可见于Wang等人，《药学研究(PharmRes.)》，2008，25(10)：2216-2230；Bowman等人，《先进功能材料(Adv.Funct.Mater.)》，2014，24，2572-2590；以及Jozwiak等人，《化学综述(Chem.Rev.)》，2013，113，4905-4979。

如本文所使用的，术语“可生物降解的(biodegradable)”、“生物降解(biodegradation)”或“生物降解(biodegrade)”是指聚合物降解成其组分亚基，或例如通过生化过程将聚合物消化成更小的非聚合亚基。在某些实施例中，生物降解可以通过酶促介导，在体内存在水(水解)和/或其它化学物质的情况下发生降解或两者兼而有之。

如本文所使用的，术语“内酯”是指含有酯基团作为环状基团的一部分的有机化合物。在实施例中，如本文所描述的内酯可以具有作为环状基团的一部分的一个或多个酯基团，如环状基团中的2个酯基团。当提及内酯时，其衍生物是指一种或多种含有环状基团的酯，所述环状基团被一个或多个如本文所定义的取代基取代。

除非另有所指，否则在本文的公开内容的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”以及类似的指代词应被解释为涵盖单数和复数两者。除非本文中另外指明，否则本文中对值范围的叙述仅旨在充当单独地提及落入所述范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值并入本说明书中，如同在本文中单独叙述一样。除非另外指示，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用旨在更好地阐明本文的公开内容，并且不是对本文的公开内容的范围的限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为将任何未要求保护的要素指示为是实践本文的公开内容所必不可少的。

可生物降解的共聚物

本文所公开的可生物降解的共聚物可以包括以下结构：

其中x和y中的每一个是整数；条件是当孪位R

通常，每个R

通常，孪位R

通常，R

通常，每个Ar

通常，x和y中的每一个可以是整数。应当理解，x和y中的每一个的绝对值描述了共聚物的聚合度。因此x和y的实际值没有特别限制，条件是当孪位R

通常，可生物降解的共聚物的重均分子量没有特别限制。例如，可生物降解的共聚物的重均分子量可以为约1kDa或更大、或约5kDa或更大、或约10kDa或更大、或约15kDa或更大、或约20kDa或更大、或约25kDa或更大、或约35kDa或更大。在实施例中，可生物降解的共聚物的重均分子量可以为约1kDa至约2000kDa、或约5kDa至约2000kDa、或约5kDa至约1500kDa、或约5kDa至约1250kDa、或约5kDa至约1000kDa、或约10kDa至约2000kDa、或约20kDa至2000kDa、或约30kDa至2000kDa、或约35kDa至约2000kDa、或约35kDa至约1500kDa、或约35kDa至约1250kDa、或约35kDa至约1000kDa、或约50kDa至约2000kDa、或约50kDa至约1500kDa、或约50kDa至约1000kDa、或约100kDa至约1500kDa、或约100kDa至约1000kDa、或约100kDa至约500kDa、或约100kDa至约350kDa、或约150kDa至约1000kDa、或约150kDa至约500kDa、或约150kDa至约350kDa。在实施例中，可生物降解的共聚物的重均分子量为5kDa或更大。在实施例中，可生物降解的共聚物的重均分子量为35kDa或更大。在实施例中，其中孪位R

通常，如本文所描述的可生物降解的共聚物的多分散性指数可以为约1至约2.5。在实施例中，本文的可生物降解的共聚物可以有利地具有约1至约2.2、或约1至约2、或约1至约1.8、或约1.2至约2、或约1.2至约2的多分散性指数。例如，本文的可生物降解的共聚物的多分散性指数可以为约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.8、约2或约2.2。多分散性指数根据本领域众所周知的GPC(Mw)方法测定。例如，可以将聚合物样品溶解于如THF等合适的溶剂中，并且Shimadzu GPC或等效物可以与如Shimadzu-LC LabSolutions或等效物等合适的软件一起使用，以分析本文所使用的聚合物的Mw、Mn和PDI。

在本公开的可生物降解的共聚物中，R

在实施例中，每个R

内酯聚合的方法

本公开进一步提供了一种用于内酯聚合的方法，如用于制备本公开的可生物降解的共聚物。所述方法也可以有利地用于制备均聚物。所述方法可以包括两个或更多个步骤，第一步骤(步骤(a))包括：将单体混合物冷却到约-30℃至约-110℃以形成冷却的混合物；并且第二步骤(步骤(b))包括：将冷却的混合物与基于单体混合物的总摩尔，约0.01mol％至约5mol％的胍衍生物混合，以形成内酯聚合物，其中步骤(b)的混合物的浓度小于约10w/v％。在实施例中，本文所描述方法的第一步骤或第二步骤可以进一步包括溶剂。在实施例中，单体、胍衍生物或两者的混合物可以包括溶剂。

已发现如本文所公开的内酯聚合的方法是有利的，因为如本文所公开的可生物降解的共聚物等所形成的聚合物可以是定义的聚合物，并且任选地具有高重均分子量(例如，35kDa或更大、50kDa或更大、或100kDa或更大)的定义的聚合物。如本文所使用的，“定义的聚合物”是指具有目标分子量的特定分子量(在约5kDa内)并且具有低PDI(例如，小于2或小于1.8)的聚合物。通过调节所述方法的一个或多个参数，如温度、单体浓度、粘度、催化剂负载和/或引发剂负载，可以有利地调整所述方法以提供指定重均分子量。例如，对于给定的单体浓度、反应粘度和催化剂/引发剂负载，可以通过降低反应温度(例如，-80℃)来实现较高分子量的聚合物，并且可以通过使用较温暖的温度(例如，-50℃)来实现相对较低分子量的聚合物。

通常，单体混合物可以包括至少一种内酯或其衍生物。在实施例中，单体混合物包括第一内酯或其衍生物。如本文所使用的，内酯或其衍生物可以是适合本领域普通技术人员的任何内酯。在实施例中，第一内酯或其衍生物可以选自由以下组成的组：

(“螺丙交酯”)、/>

在实施例中，单体混合物可以进一步包括第二内酯或其衍生物。在实施例中，第一内酯可以选自由以下组成的组：

制备内酯聚合物的方法可以包含将单体的混合物冷却至约-30℃或更低的温度以形成冷却的混合物。在实施例中，单体的混合物可以被冷却到约-30℃至约-200℃、或约-30℃至约-160℃、-30℃至约-110℃、或约-30℃至约-100℃、或约-30℃至约-90℃、或约-30℃至约-80℃、或约-50℃至约-100℃、或约-50℃至约-80℃的温度。例如，所述温度可以为约-30℃、约-40℃、约-50℃、约-60℃、约-70℃、约-80℃、约-90℃、约-100℃、约-110℃、约-120℃、约-130℃、约-150℃、约-160℃、约-200℃。冷却的混合物的温度没有特别限制，并且可以是低于-30℃的任何温度，条件是混合物中的单体在冷却的混合物的温度下不从溶剂中沉淀出来，胍衍生物在在冷却的混合物的温度下至少部分地溶于溶剂中，并且在冷却的混合物的温度下，生长的聚合物链至少部分地溶于溶剂中。在实施例中，可以将单体的混合物和溶剂冷却，例如在冷却浴中，持续适合将单体的混合物和溶剂冷却到期望温度的任何时间量，如约10分钟或更长时间。例如，可以将单体的混合物冷却约10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、1小时、2小时或更长时间。用于将混合物冷却到约-30℃至-160℃的温度的冷却浴在本领域中是众所周知的。

制备内酯聚合物的方法包括将冷却的混合物与胍衍生物混合。在实施例中，胍衍生物可以由式(I)的结构：

通常，胍衍生物在冷却的混合物的溶剂中具有pKa。在不旨在受理论约束的情况下，据信，随着胍衍生物的pKa增加，所得聚合物可以获得更高的分子量。发现具有相对较高pKa的胍衍生物如1，5，7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(TBD)或7-甲基-1，5，7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(MTBD)，相对于具有较低pKa的胍衍生物如1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)或1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)，产生重均分子量较高(例如，200kDa或更大)，多分散性指数低(例如，1.8或更低)的内酯聚合物，当所有其它条件(例如，单体、溶剂等)保持不变时，所述具有较低pKa的胍衍生物示出较低的重均分子量(例如，小于150kDa)或较高的多分散性指数(例如，2或更高)。

在实施例中，基于单体的混合物的总摩尔，胍衍生物可以以约0.01mol％至约10mol％、或约0.01mol％至约5mol％、或约0.01mol％至约3mol％、或约0.01mol％至约2mol％、或约0.01mol％至约1mol％、或约0.05mol％至约0.2mol％、或约0.01mol％至约0.2mol％的量存在。例如，基于单体的混合物的总摩尔，胍衍生物可以以约0.01mo1％、0.05mol％、0.1mol％、0.2mol％、0.3mol％、0.5mol％、1mol％、2mol％、3mol％、5mol％或10mol％的量存在。

可以将冷却的混合物与胍衍生物混合，持续约5分钟至约72小时、约10分钟至约48小时、约15分钟至约24小时、约30分钟至约24小时、约45分钟至约24小时、约1小时至约24小时、或约5小时至约24小时、或约12小时至约24小时、或约18小时至约24小时。例如，可以将冷却的混合物与胍衍生物混合，持续约1小时、5小时、10小时、12小时、15小时、18小时、20小时或24小时。在实施例中，混合可以在1小时至24小时的范围内。随着混合长度的减少，单体混合物向聚合物的转化百分比通常会降低。随着混合长度的增加，单体混合物向聚合物的转化百分比通常会增加并且所得聚合物的分子量增加。随着混合长度增加超过约24小时，可能发生另外的聚合，然而24小时后分子量增加通常小于重均分子量的5％、小于3％或小于1％。在与胍衍生物混合期间，冷却的混合物的温度维持在±5℃内。

在其中单体的混合物至少包含第一内酯单体和第二内酯单体的实施例中，第一内酯单体和第二内酯单体可以作为混合物提供并且与胍衍生物同时混合。在此类实施例中，所得共聚物可以是无规共聚物。在其中单体的混合物至少包含第一内酯单体和第二内酯单体的实施例中，第一内酯单体和第二内酯单体可以以逐步的方式与胍衍生物混合。在此类实施例中，所得共聚物可以是嵌段共聚物。

在实施例中，单体的混合物在溶剂中提供。在实施例中，胍衍生物可以在溶剂中提供。当单体的混合物和胍衍生物在溶剂中提供时，单体的混合物的溶剂和胍衍生物的溶剂可以相同或不同。在实施例中，单体的混合物的溶剂和胍衍生物的溶剂相同。在实施例中，单体的混合物的溶剂和胍衍生物的溶剂不同。本文方法的溶剂可以包括任何一种或多种适合于在冷却的混合物的温度下将胍衍生物至少部分地溶解于溶剂中的有机溶剂。如本文所使用的，术语“部分可溶”意指基于化合物的总摩尔，至少3mol％的化合物可溶于溶剂中。例如，基于胍衍生物的总摩尔，至少3mol％、至少5mo1％、至少7.5mol％、至少10mol％、至少15mo1％或至少20mol％的胍衍生物可溶于溶剂中。在实施例中，单体的混合物在冷却的混合物的温度下基本上可溶于溶剂中。在实施例中，可生物降解的聚合物在所述冷却的混合物的温度下至少部分地可溶于所述溶剂中。在实施例中，所述可生物降解的聚合物在所述冷却的混合物的温度下基本上可溶于所述溶剂中。如本文所使用的，术语“基本上可溶”是指基于单体的混合物或可生物降解的聚合物的总摩尔，单体的混合物或可生物降解的聚合物分别至少75mol％可溶于溶剂中。在实施例中，溶剂可以包括非质子溶剂。在实施例中，溶剂可以包括二氯甲烷(DCM)、氯仿、二氯乙烯、四氢呋喃、甲苯、乙酸乙酯、丙酮或其组合。

在其中胍衍生物在溶剂中提供的实施例中，与胍衍生物一起提供的溶剂的体积相对于单体混合物的溶剂的体积通常可忽略不计，使得添加胍衍生物和单体混合物不会导致冷却的混合物的温度升高。

通常，在步骤(b)中，基于溶剂的总体积，单体的浓度可以为约15w/v％或更低。有利地，已发现将第二步骤(步骤(b))中的单体浓度保持为低(即，小于10w/v％)可以促进高分子量聚合物的形成。在实施例中，步骤(b)的混合物的浓度可以为约0.001w/v％至约10w/v％、或约3w/v％至约8w/v％、或约0.1w/v％至约5w/v％、或约0.1w/v％至约2w/v％。例如，步骤(b)的混合物的浓度可以为约0.001w/v％、或约0.01w/v％、或约0.1w/v％、或约1w/v％、或约2w/v％、或约3w/v％、或约5w/v％、或约8w/v％、或约10w/v％。随着溶剂中单体的浓度增加超过约10w/v％，反应的粘度增加，使得聚合物链的移动受到限制，从而抑制了聚合物链端与其它聚合物链端接触，这是所必需的以便连接聚合物链并产生高分子量聚合物。随着溶剂中单体的浓度降低低于约0.01w/v％，示出反应速率显著减慢或不发生，因为单体与催化剂和其它单体接触的机会显著降低。例如，发现当溶剂中单体的浓度为约1w/v％时，可以获得重均分子量为约80kDa的聚合物，并且随着单体的浓度降低低于约1w/v％，重均分子量同样降低。

在实施例中，步骤(b)可以进一步包括引发剂。在实施例中，引发剂可以包括丙醇胺、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸2-羟乙酯、苄醇、炔丙醇、溴化丙醇、2，2-双(溴甲基)-1，3-丙二醇、季戊四醇、季戊四醇三丙烯酸酯或其组合。在实施例中，引发剂可以包括包含羟基(-OH)的化合物，例如双官能聚乙二醇，其中双官能聚乙二醇包括羟基(-OH)。有利地，包括羟基的化合物可以进一步包含点击化学反应对的第一官能团，使得所述化合物可以引发聚合并且为聚合物链提供点击化学对的第一官能团，所述第一官能团随后可以被官能化。

在测试本文所提供的方法期间，出乎意料地发现步骤(b)中的低温(例如，-30℃或更低)和低浓度的单体(例如，小于10w/v％)提供了具有高分子量(即，35kDa或更大)和低多分散性指数(即，1.8或更低)的有利内酯聚合物。可以调整本文所提供的方法以控制内酯聚合物的重均分子量。已发现，对于步骤(b)中浓度在约5w/v％至约10w/v％范围内的混合物，随着反应温度的降低，内酯聚合物的重均分子量增加。例如，当除反应温度以外的所有条件恒定时，当冷却的混合物的温度为-80℃并且步骤(b)中单体的浓度为5w/v％时，形成重均分子量为350kDa的内酯聚合物，并且当冷却的混合物的温度为-50℃并且步骤(b)中单体的浓度为5w/v％时，形成重均分子量为200-225kDa的内酯聚合物。

在实施例中，在本文所描述的方法中形成的如本文所公开的可生物降解的共聚物等内酯聚合物的重均分子量可以为约1kDa至约2000kDa、或约5kDa至约2000kDa、或约5kDa至约1500kDa、或约5kDa至约1250kDa、或约5kDa至约1000kDa、或约10kDa至约2000kDa、或约20kDa至2000kDa、或约30kDa至2000kDa、或约35kDa至约2000kDa、或约35kDa至约1500kDa、或约35kDa至约1250kDa、或约35kDa至约1000kDa、或约50kDa至约2000kDa、或约50kDa至约1500kDa、或约50kDa至约1000kDa、或约100kDa至约1500kDa、或约100kDa至约1000kDa、或约100kDa至约500kDa、或约100kDa至约350kDa、或约150kDa至约1000kDa、或约150kDa至约500kDa、或约150kDa至约350kDa。在实施例中，内酯聚合物的重均分子量可以为约35kDa、约50kDa、约75kDa、约100kDa、约125kDa、约150kDa、约175kDa、约200kDa、约250kDa、约300kDa、约350kDa、约400kDa、约500kDa、约750kDa、约1000kDa、约1250kDa、约1500kDa或约2000kDa。

本公开的方法可以进一步包括在将冷却的混合物与胍衍生物混合之后混合包括单体和溶剂的第二混合物。在实施例中，第二单体混合物可以包括与冷却的混合物相同或不同的单体。在实施例中，冷却的混合物包含第一内酯或其衍生物和第二内酯或其衍生物，并且第二单体混合物包括第一内酯或其衍生物。在实施例中，冷却的混合物包含第一内酯或其衍生物和第二内酯或其衍生物，并且第二单体混合物包括第二内酯或其衍生物。在实施例中，冷却的混合物包含第一内酯或其衍生物和第二内酯或其衍生物，并且第二单体混合物包括第三内酯或其衍生物。在其中所述方法进一步包含混合包括单体和溶剂的第二混合物的实施例中，包括单体和溶剂的第二混合物可以(i)在添加之前冷却到冷却的混合物的温度和/或(b)以使得冷却的混合物的温度不升高的速率添加。

在一些实施例中，所述方法可以包括：(a)将第一内酯或其衍生物、第二内酯或其衍生物和溶剂冷却到约-30℃至约-110℃的温度以形成冷却的混合物；(b)将冷却的混合物与基于单体的总摩尔，任选地在溶剂中的约0.01mol％至约5mol％的胍衍生物混合，并且使冷却的混合物与胍衍生物在约-30℃至约-100℃的温度下反应约1小时至约24小时，其中混合后，基于溶剂的总体积，单体的浓度小于约10w/v％；以及(c)将第一内酯或其衍生物的第二部分和/或第二内酯或其衍生物混合到(b)的混合物中并且使第一内酯或其衍生物和/或第二内酯或其衍生物在约-30℃至约-100℃的温度的温度下反应约1小时至约24小时，其中基于溶剂总体积，(c)的混合物的单体浓度小于10w/v％，以形成本公开的内酯共聚物。

在一些实施例中，所述方法可以包括：(a)将第一内酯或其衍生物和溶剂冷却到约-30℃至约-110℃的温度以形成冷却的混合物；(b)将冷却的混合物与基于单体的混合物的总摩尔，任选地在溶剂中的约0.01mol％至约5mol％的胍衍生物混合，并且使冷却的混合物与胍衍生物在约-30℃至约-100℃的温度下反应约1小时至约24小时，其中混合后，基于溶剂的总体积，单体的浓度小于约10w/v％；以及(c)将第二内酯或其衍生物混合到(b)的混合物中并且使第二内酯或其衍生物在约-30℃至约-100℃的温度下反应约1小时至约24小时，其中基于溶剂总体积，(c)的混合物的单体浓度小于10w/v％，以形成本公开的内酯共聚物。

在一些实施例中，所述方法可以包括：(a)将第一内酯或其衍生物和溶剂冷却到约-30℃至约-110℃的温度以形成冷却的混合物；(b)将冷却的混合物与基于单体的混合物的总摩尔，任选地在溶剂中的约0.01mol％至约5mol％的胍衍生物混合，并且使冷却的混合物与胍衍生物在约-30℃至约-100℃的温度下反应约1小时至约24小时，其中混合后，基于溶剂的总体积，单体的浓度小于约10w/v％；以及(c)将第二内酯或其衍生物混合到(b)的混合物中并且使第二内酯或其衍生物在约-30℃至约-100℃的温度下反应约1小时至约24小时，其中基于溶剂的总体积，(c)的混合物的单体浓度小于约10w/v％；以及(d)将第一内酯或其衍生物的第二部分、第二内酯或其衍生物的第二部分、第三内酯或其衍生物或其组合混合到(c)的混合物中并且使反应在约-30℃至约-100℃的温度下持续约1小时至约24小时，其中基于溶剂总体积，(d)的混合物的单体浓度小于10w/v％，以形成本公开的内酯共聚物。

在实施例中，本文制备内酯聚合物的方法在惰性气氛下进行。如本文所使用的，术语“惰性气氛”是指基本上不含氧气的气氛。惰性气氛可以包含例如惰性气体气氛，如N

纳米纤维支架

本公开还提供了纳米纤维支架。纳米纤维支架可以包括本公开的可生物降解的共聚物、聚螺丙交酯(PSLA)或其组合。在实施例中，纳米纤维支架可以进一步包括聚丙交酯(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(丙交酯-共-乙醇酸)(PLGA)、聚羟基丁酸酯(PHB)、聚(羟基戊酸酯)(PHV)、聚(羟基丁酸酯-戊酸酯)(PHBV)、聚(二噁烷酮)(PDS)、聚己内酯(PCL)、聚(甘油-共-癸二酸酯)或其组合。在实施例中，纳米纤维支架可以进一步包括聚丙交酯，如聚(L-丙交酯)、聚(D-丙交酯)、聚(DL-丙交酯)或其组合。在实施例中，纳米纤维支架可以进一步包括聚(L-丙交酯)。

为了满足对容易获得的小直径血管移植物的临床需求，纳米纤维支架(例如，仿生管状支架)被开发用于快速原位血管再生。在实施例中，通过硫醇-烯点击化学将生物分子共价连接到本公开的聚合物的主链上可以赋予纳米纤维支架期望的功能。在实施例中，肝素可以缀合在纳米纤维支架上，以便在原位植入时防止血栓形成。通过控制共价连接的肝素的量，能够调节管状支架的物理特性，从而在保持多孔和纳米纤维形态的同时实现可调的润湿性和降解速率。在一些实施例中，本文所公开的纳米纤维支架可以用作能够产生小直径血管的有效血管移植物。

在实施例中，纳米纤维支架可以包括本公开的可生物降解的共聚物和PLA。如本文所使用的，通常，相对于可生物降解的共聚物的量，随着PLA的量增加，聚合物堆叠越有序，这可以促进纤维形成和结晶度增加以及纳米纤维支架的结构完整性。在不旨在受理论约束的情况下，据信因为可生物降解的共聚物的降冰片烯环是庞大的取代基，共聚物的存在可能破坏PLA聚合物链的堆叠，并且在高共聚物水平下最终会阻止纳米纤维结构的形成。因此，应当理解，本公开的可生物降解的共聚物和PLA可以以任何相对量提供，条件是(i)可生物降解的共聚物的相对量足够低，不会干扰PLA堆叠和纤维形成，并且(ii)可生物降解的共聚物的相对量足够高，以实现纳米纤维支架期望的足够快的降解速率。因为纳米纤维支架通过水解切割进行生物降解，所以可以通过改变纳米纤维支架的亲水性来调整支架的生物降解性，例如，通过用亲水性基团对纳米纤维支架的PSLA进行官能化。增加纳米纤维支架的亲水性可以增加纳米纤维支架的生物降解速率，因为亲水性基团促进水与支架的接触，促进水解裂解和降解。在实施例中，本公开的可生物降解的共聚物和PLA(可生物降解的共聚物∶PLA)以约1∶1至约1∶100的摩尔比存在。在实施例中，本公开的可生物降解的共聚物和PLA可以以约1∶5至约1∶100、约1∶5至约1∶50或约1∶5至约1∶30或约1∶5至约1∶20或约1∶5至约1∶10的摩尔比存在。例如，本公开的可生物降解的共聚物和PLA可以以约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9、约1∶10、约1∶12、约1∶15、约1∶20、约1∶25、约1∶30、约1∶40、约1∶50、约1∶75或约1∶100的摩尔比存在。通常，当本公开的可生物降解的共聚物和PLA以小于约1∶5的摩尔比提供时，纳米纤维支架的结晶度较低并且不形成纤维结构，并且当本公开的可生物降解的共聚物和PLA以大于约1∶100的摩尔比提供时，所得纳米纤维支架的亲水性降低，并且因此纳米纤维支架的生物降解性降低。

在实施例中，纳米纤维支架可以包括PSLA。在实施例中，纳米纤维支架可以包括PSLA和聚丙交酯(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(丙交酯-共-乙醇酸)(PLGA)、聚羟基丁酸酯(PHB)、聚(羟基戊酸酯)(PHV)、聚(羟基丁酸酯-戊酸酯)(PHBV)、聚(二噁烷酮)(PDS)、聚己内酯(PCL)、聚(甘油-共-癸二酸酯)或其组合。在实施例中，纳米纤维支架可以包括PSLA和PLA，如聚(L-丙交酯)(PLLA)。在实施例中，PSLA和PLA可以以约1∶8至约8∶1、或约1∶5至约5∶1、或约1∶3至约3∶1、或约1∶2至约2∶1的比率存在。例如，PSLA和PLA可以以约1∶10、约1∶8、约1∶5、约1∶3、约1∶2、约1∶1.5、约1∶1、约1.5∶1、约2∶1、约3∶1、约5∶1、约8∶1或约10∶1的比率存在。

如本文所公开的纳米纤维支架可以模制成对本领域普通技术人员而言任何合适的形状。在实施例中，纳米纤维支架的形状是管状的。在一些实施例中，管状纳米纤维支架可以设计成具有内层，所述内层是多孔的、互连的并且具有纳米纤维架构，这为宿主细胞侵袭和增殖提供了极好的微环境。

本文所公开的纳米纤维支架可以进一步包括选自由以下组成的组的官能化：抗凝剂、生长因子、激素、细胞粘附肽、受体、蛋白质、糖、脂质、矿物质或其组合。在实施例中，官能化可以是生长因子。在实施例中，生长因子可以是血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)或其组合。在实施例中，官能化可以是抗凝剂化合物。在实施例中，所述抗凝剂化合物包括肝素、硫醇化聚乙二醇(PEG-SH)、两性离子聚(羧基甜菜碱)、两性离子聚(磺基甜菜碱)、两性离子聚(半胱氨酸)、两性离子聚(磷脂酰胆碱)或其组合。在其中纳米纤维支架包括本公开的可生物降解的共聚物的实施例中，官能化可以与所述可生物降解的共聚物缀合。在其中纳米纤维支架包括PSLA的实施例中，功能化可以与所述PSLA缀合。基于PSLA单体单元的总摩尔，官能化可以以约1mol％至约50mol％的量存在。在实施例中，基于PSLA单体单元的总摩尔，官能化可以以约1mol％至约25mol％的量存在。功能化可以影响纳米纤维支架的接触角。在实施例中，可以以足以提供约20°至约90°的接触角的量提供官能化。通常，足以提供20°与90°之间的接触角的官能化量将取决于官能化的类型和官能化之前材料的接触角。在实施例中，纳米纤维支架包括本公开的可生物降解的共聚物和/或PSLA，官能化包括抗凝剂，并且基于螺丙交酯单体的总摩尔，足以提供20°与90°之间的接触角的抗凝剂的量可以是约0.001mol％至约100mol％。在一些实施例中，基于螺丙交酯单体的总摩尔，足以提供20°与90°之间的接触角的抗凝剂的量可以是约0.01mol％至约20mol％。在不旨在受理论约束的情况下，据信足以提供20°与90°之间的接触角的抗凝剂的量将取决于特定抗凝剂的大小和特定抗凝剂改变纳米纤维支架表面亲水性的能力。例如，对于由1g总聚合物(PSLA和PLA)制备的支架，在PSLA和PLA的比率为1∶1并且PSLA包括25mol％螺丙交酯修饰时，支架可以用10mg肝素(约1.66mol％)至100mg肝素(约16.6mol％)进行官能化，以提供20°与90°之间的接触角。由于对纳米纤维结构表面的亲水性的影响较小，预计分子量小于肝素的分子量的抗凝剂需要比肝素更多的修饰来实现相同的接触角。。

在实施例中，纳米纤维支架的接触角为约20°至约90°、或约30°至约80°、或约40°至约70°、或约50°至约60°、或约25°至约40°。具有低接触角(例如，20°至约90°)的纳米纤维支架可以提供有利的特性。通常，随着接触角降低低于约100°，表面的亲水性增加，并且在20°至约90°的范围内，相对于具有小于约20°且大于约90°接触角的表面的纳米纤维支架，纳米纤维支架的表面具有亲水性，所述亲水性有利地允许纳米纤维支架展示与周围水环境(例如，生物环境)的改进的相互作用。

如本文所公开的纳米纤维支架可以是多孔的。在实施例中，纳米纤维支架的孔径可以为约40μm至约600μm、或约60μm至约500μm、或约60μm至约450μm、或约60μm至约400μm、或约100μm至约400μm、或约150μm至约400μm。例如，孔径可以为约60μm、约70μm、约80μm、约90μm、约100μm、约150μm、约200μm、约250μm、约300μm、约350μm、约400μm、约450μm或约500μm。在不旨在受理论约束的情况下，据信随着孔径减小小于约60μm，则细胞在被接种时可以被捕获在支架的外层上，而不是渗入纳米纤维支架结构。有利地，可以控制孔径以提供适用于各种预期最终用途的纳米纤维支架。例如，其中纳米纤维支架旨在用于心血管组织，优选约60μm至约150μm的孔径。例如，其中纳米纤维支架旨在用于骨骼，优选约250μm至约425μm的孔径。纳米纤维支架的孔径可以基于以下中描述的方法调整：Wei，G.和Ma，P.X.(2006)，《生物医学材料研究杂志(J.Biomed.Mater.Res.)》，78A：306-315以及Wang等人，《生物材料(Biomaterials)》，第35卷，第32期，2014，第8960-8969页。

在实施例中，纳米纤维支架可以包括双层结构。在实施例中，所述双层结构包括多孔层和较少孔的可生物降解的共聚物外层，所述多孔层包括官能化的可生物降解的共聚物和/或PSLA、聚(L-乳酸)或其组合。在一些实施例中，双层结构包括多孔层和较少孔的可生物降解的共聚物外层，所述多孔层包括官能化的可生物降解的共聚物和PLLA，其中官能化的可生物降解的共聚物用如肝素等抗凝剂化合物官能化。在实施例中，所述纳米纤维支架可以包括双层结构并且以管状形式提供，使得所述双层结构包括内层，所述内层包括多孔层，所述多孔层包括所述官能化的可生物降解的共聚物和PLLA，并且外层包括较少孔的可生物降解的共聚物外层。

与其它支架相比，纳米纤维支架可以有利地在生物环境中快速降解(例如，约1个月后40％的质量损失)(图4A-4C)。在实施例中，所述纳米纤维支架的总质量损失在37℃的温度下储存在磷酸盐缓冲盐水中30天后可以为约40％或更多。在实施例中，所述纳米纤维支架的总质量损失在37℃的温度下储存在磷酸盐缓冲盐水中30天后为约50％或更多。

在实施例中，纳米纤维支架可以是血管移植物。在实施例中，纳米纤维支架可以用于脊髓、软骨、肌肉、骨骼或其组合。在实施例中，纳米纤维支架可以用于骨骼再生。在实施例中，纳米纤维支架是无细胞的或不含培养的细胞。如本文所使用的并且除非另有说明，“不含培养的细胞”或“无细胞”是指未用培养的细胞处理的纳米纤维支架。在实施例中，纳米纤维支架包含培养的细胞。在实施例中，纳米纤维支架是无细胞的或载有细胞的并且纳米纤维支架是血管移植物。在实施例中，血管移植物不含培养的细胞。先前的方法需要使用培养的细胞来创建用于心脏和外周血运重建手术的小直径组织工程化血管。由于通常需要血管时的立即性，此类包含培养的细胞的血管移植物不适用于大多数临床应用。如本文所公开的纳米纤维支架等无细胞组织工程化血管移植物允许消除细胞培养所需的过多的前置时间，并且能够立即植入。

本文进一步提供了一种使组织再生的方法，所述方法包括将本公开的纳米纤维支架植入在组织中或连接到组织。在组织中植入支架的方法是本领域众所周知的。本文所公开的使组织再生的方法可以具有一个或多个优点，包含但不限于，允许天然细胞在短时间段内(例如，约一周)渗透到支架中，提供血管的内皮细胞和平滑肌细胞的完全再生，提供天然样细胞外基质和/或支架的可调整降解速率或其组合。在实施例中，有利的是调整如本文所公开的纳米纤维支架以随着细胞移入并沉积细胞外基质蛋白(例如，弹性蛋白和胶原蛋白)而降解，使得细胞以天然方式构建血管。如果纳米纤维支架在细胞浸润时没有开始降解，则细胞将没有足够的空间来重塑和沉积健康血管所需量的任何另外的细胞外基质蛋白。在实施例中，功能性血管可以通过本文所公开的纳米纤维支架由身体再生，所述纳米纤维支架是生物相容的、抗凝血的、不含培养的细胞并且具有可调整的降解速率。在不旨在受理论约束的情况下，据信纳米纤维支架可以在支架内具有出色的细胞迁移(例如，在1个月可以看到自然组织形成开始)，这得益于高度多孔和互连的架构。从历史上看，原位血管组织工程化期间的弹性蛋白生产一直是一项重大挑战。在实施例中，本文所公开的方法可以有利地在包含纳米纤维支架的工程化血管中提供分泌的具有天然样结构的大量胶原蛋白和弹性蛋白。通过提供大小为细胞提供用以沉积细胞外基质蛋白的过量空间的孔和通过在细胞浸润时支架降解，纳米纤维支架有利地促进大量胶原蛋白和弹性蛋白的沉积。

在实施例中，组织可以包括成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞或其组合。在实施例中，所述纳米纤维支架预先接种有细胞或在植入后被宿主细胞浸润。在实施例中，本文的纳米纤维支架可以被宿主细胞浸润。在实施例中，本文的纳米纤维支架可以在约一周内被宿主细胞浸润。

有利地，本文使组织再生的方法可以包含植入本公开的纳米纤维支架，其有利地促进细胞迁移、附着、增殖和平滑肌再生。有利地，本文使组织再生的方法可以设计为通过重建支架的细胞，调整支架的降解至组织再生。例如，降解速率可以通过改变如上文所描述的纳米纤维支架的亲水性来调整，这可以通过多种方式实现，包含但不限于改变PSLA聚合物中螺丙交酯单体的量，改变纳米纤维支架中聚螺丙交酯聚合物的量，改变纳米纤维支架的官能化量或其组合。特别地，对于给定的细胞类型，可以控制降解速率，使得支架的降解足够快以允许细胞空间移动到支架中并且重建组织，但不会快到在允许细胞有机会在结构支撑(即，纳米纤维支架)消失前占据组织环境和使其再生之前降解。纳米纤维支架的互连多孔结构可以有利地提供优异的细胞浸润和移动，促进完全内皮化和在植入部位处形成天然样细胞外基质。另外，有利地，使组织再生的方法可以包含本文本公开的官能化纳米纤维支架。在其中纳米纤维支架用如肝素等抗凝剂官能化的实施例中，使组织再生的方法是有利的，因为纳米纤维支架的疏水性聚合物不再与脉管系统中的血小板和蛋白质具有负相互作用并且不会发生血栓形成。相反，如肝素等抗凝剂防止血小板和蛋白质附着到纳米纤维支架的表面，使得不会发生血栓形成。进一步地，在其中纳米纤维支架用如肝素等亲水性官能化进行官能化的实施例中，使组织再生的方法可以提供一个或多个优点，如：1)与细胞产生积极的相互作用，这促进细胞与纳米纤维支架的结合；2)创建其中支架与植入物环境相容的环境，允许水/介质/流体可以在没有排斥的情况下移动通过支架，促进质量传输；或其组合。通过将有利的物理结构与纳米纤维支架的化学功能组合，优异的双层纳米纤维支架可以用于实现内皮化血管再生以及天然样富含胶原蛋白和富含弹性蛋白的细胞外基质。鉴于上述优点，本公开的纳米纤维支架适用于植入生物体内。

实例

材料和方法

L-丙交酯由

单体、聚合物和支架表征

核磁共振表征：通过溶解于氘代氯仿(CDCl

紫外-可见光谱法：所有形成的单体和聚合物的特征在于首先溶解于二氯甲烷(DCM)中并且使用石英比色皿获得200-700nm(至多示出350)的光谱(Hitachi U-2910或其等效物)。

傅里叶变换红外光谱法：单体、聚合物和经修饰的管状支架的特征在于将样品直接放置在金刚石晶体样品架上，以获得600-4000nm的光谱(Thermo-Nicolet IS-50或其等效物)。

扫描电子显微镜(SEM)观察：空支架用金溅射涂覆150秒，并且在扫描电子显微镜(JEOL JSM-7800FLV或其等效物)下观察。

凝胶渗透色谱法：将形成的聚合物溶解于无水四氢呋喃中，并且通过与聚苯乙烯标准品(Shimadzu GPC或其等效物)进行比较来测定聚合物的分子量。

实例1-可生物降解的共聚物的合成

螺[6-甲基-1，4-二噁烷-2，5-二酮-3，2′-双环[2.2.1]庚[5]烯]合成：

1-丙交酯是根据以下先前报告的方法进行修饰的：Hillmyer等人，《美国化学会志(JAm Chem Soc.)》，130(42)(2008)13826-7。简而言之，将1-丙交酯与n-溴代琥珀酰亚胺(NBS)(1.1当量)在苯(20％w/v)中合并并且加热至回流。逐滴添加溶解于苯中的过氧化苯甲酰并且通过薄层色谱法(TLC)监测反应直至完成。将反应真空过滤并浓缩并且将所得固体溶解于DCM中，在硫代硫酸钠溶液中洗涤并浓缩。将所述固体由乙酸乙酯和己烷重结晶两次，以得到白色晶体(3S，6S)-3-溴-3，6-二甲基-1，4-二噁烷-2，5-二酮(溴-丙交酯)。在氮气下将白色晶体溶解于烧瓶中的DCM中并且在冰浴中冷却。逐滴添加三乙胺(TEA)(1.1当量)，使其在0℃下反应1小时和在25℃下反应1小时。将反应用1M HCl洗涤三次并浓缩。将晶体通过硅胶液相色谱法进一步纯化并且在乙酸乙酯中重结晶，以得到白色晶体(6S)-3-亚甲基-6-甲基-1，4-二噁烷-2，5-二酮(亚甲基丙交酯)。向新蒸馏的环戊二烯(2.2当量)中添加亚甲基丙交酯(1当量)并且在氩气下在苯中回流过夜。将反应浓缩并且通过液相色谱法在50/50己烷∶DCM(r

实例2-开环聚合的一般程序

在反应烧瓶中，将来自实例1的螺丙交酯与L-丙交酯以1∶3摩尔比添加，并且通过标准真空/氮气处理将烧瓶吹扫三次，然后以5％w/v溶解于无水DCM中。将烧瓶冷却到-80℃，持续1小时，并且然后注入溶解在DCM中的0.5％mol TBD催化剂，使得溶液中单体的浓度维持在5％w/v。使反应在-80℃下反应24小时。形成的共聚物在乙醚中沉淀，重新溶解于DCM中并在乙醚中沉淀，并且在真空下储存。所得共聚物是无规共聚物并且在本文中称为聚(螺乳酸-共-乳酸)(PSLA)。使用NMR、UV-VIS和FTIR对单体和聚合物进行了彻底的表征(图1B-1E)。

因此，实例2展示了使用本公开的方法形成本公开的可生物降解的共聚物。

实例3-纳米纤维管状支架制造

使用利用糖模板和热诱导相分离(TIPS)的方法制造了具有良好纳米纤维架构和可调整物理特性如孔径、互连性、内径和壁厚的管状支架。

通过使用切割成5cm宽条的铝箔，以简便、经济和可重复的方法制造糖支架。将铝箔缠绕在具有期望外径(1.85mm)的金属棒上，并且然后将缠绕有铝箔的金属棒放入预制铝模具中。然后将预制果糖球沉积在预制铝模具内(图2A-2C)，同时将预制铝模具浸入己烷中以防止水分凝聚果糖糖球，随后加热以去除己烷。从铝模具和铝箔中取出果糖模具。糖模板球通过以下开发的乳液方法制备：Ma等人，《大分子生物科学(Macromol.Biosci.)》，12(7)(2012)911-9以及《先进药物输送评论(Adv.Drug Deliver Rev.)》，60(2)(2008)184-198。使用筛子分离糖球以回收直径范围为60-150μm的球。将具有期望内径(1.0mm)的心轴放置在中心，并且通过放置在37℃的培养箱中7分钟，随后真空干燥糖支架来使糖球退火至期望的互连性。

根据Ma等人开发的程序进行纳米纤维管状支架的TIPS形成，并且在以下中进行了描述：Ma等人，《Wires纳米医疗和纳米生物技术(Wires Nanomed Nanobi)》1(2)(2009)226-236以及Ma等人，《生物医学材料研究杂志》46(1)(1999)60-72。去除铝箔并且将糖模板浸入如实例2中制备的由50％PLLA(固有粘度为1.6dl/g)和50％PSLA组成的10％w/v聚合物溶液中，溶解于THF中，并且然后快速冷却到-80℃，以便进行相分离。将聚合物支架在此温度下维持24小时。在用90：10己烷与THF(15kV，10cm，2毫升/小时，通过旋转)的混合物刷涂聚合物支架后，立即将溶解于三氟乙醇(TFE)中的PCL静电纺丝到聚合物支架上。己烷∶THF混合物在刷涂后形成了粘性表面，静电纺丝PCL纤维可以在其中退火。然后将聚合物支架置于己烷中24小时以去除过量的THF和TFE，并且随后将其置于双蒸馏水(DDH2O)中以去除糖球。在糖被完全洗掉后，心轴很容易被去除，并且所得纳米纤维聚合物支架被切割成期望的长度。

因此，实例3展示了使用本公开的可生物降解的共聚物形成本公开的纳米纤维聚合物支架。

实例4-用抗凝剂分子进行表面修饰

如根据实例3制备的管状纳米纤维聚合物支架通过UV-光诱导的硫醇-烯点击化学用要缀合的期望分子进行修饰。在此实例中，要缀合的分子是抗凝剂、肝素。简而言之，将甲氧基-PEG-SH 2k(50mg)、用L-半胱氨酸修饰的肝素(100mg)和四甲基乙二胺(TEMED)溶解于DDH

薄膜的接触角测量

通过在硅表面上对10％聚合物溶液进行TIPS处理(如上文所描述)制造薄膜，以确定由于肝素缀合而导致的润湿性和亲水性变化。制造由(a)PSLA/PLLA共混物和(b)仅PLLA构成的薄膜，并且每种类型的亚部分随着肝素浓度的增加被进一步修饰，以产生具有以下渗透性的薄膜：PLLA无肝素、PLLA具有肝素(50mg)、PSLA/PLLA无肝素，其中肝素浓度增加10mg、50mg和100mg并且PEG575凝胶作为阳性对照，各自n＝3并且标准误差为±2°。使用双面胶带将膜附着到玻璃侧，并且利用Rame-Hart 200-F1接触角测角仪或等效物测量水滴的前进接触角。

与未修饰的PLLA(100°)和PLLA/PSLA共混物(110°)薄膜相比，肝素缀合薄膜示出增加的润湿性，其中接触角范围为25-40°。这表明肝素缀合材料的高度亲水性。具有50mg肝素和100mg肝素的两种薄膜能够分别在3分钟和1分钟后吸收水滴(图3F和3G)。

因此，实例4展示了呈本公开的纳米纤维管状支架形式的本公开的可生物降解的共聚物的官能化，以提供本公开的官能化可生物降解的共聚物和官能化纳米纤维管状支架。

实例5-“体外”降解

利用如上文所描述的制备的糖模板在

因此，实例5展示了本公开的共聚物和由其制备的支架相对于已知聚合物和支架的有利形态和生物降解。

实例6-管状支架的原位植入作为大鼠降主动脉的替代物

如实例3所描述的制备10mm长和1mm内径的可生物降解的共聚物支架，并且如实例4所描述的进行官能化。将可生物降解的共聚物支架原位植入2-4个月大、体重200-400g的斯普拉格-道利(Sprague Dawley)(SD)大鼠(马萨诸塞州波士顿的查尔斯河实验室(Charles River Laboratories，Boston，MA))作为腹主动脉介入移植物，以评估管状支架的活力和有效性并且确定体内重塑(图5A)。所有程序均获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会的批准。用氯胺酮(80mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)麻醉后，通过尾静脉静脉施用150单位/千克肝素。将动物置于加温垫(37℃)上的仰卧位，并且进行中线剖腹手术。使用两个微型夹子解剖和夹住肾下主动脉。在显微镜下使用9-0prolene缝合线以端到端中断的吻合模式植入血管支架。然后将腹部以多层闭合。每天两次皮下给予100单位/千克依诺肝素(Lovenox)用于抗凝。在1周、2周、1个月和3个月的预定时间处死大鼠。所有大鼠都存活到处死时间，其中没有血管出血、破裂或机械故障的迹象(图5B)。重要的是，没有血管变色，周围组织变黑，并且筋膜在再生血管周围生长，表明不存在坏死或免疫应答触发。另外，三个月时切除的组织看起来与天然脉管系统类似(图5C-图5E)。植入后，通过激光多普勒超声和超声成像观察支架的血流阻塞内径变化、壁大小变化以及任何出现的血栓形成问题(图5F和图5G)。通过这些方法，确定血液流动通畅，壁大小和内径几乎保持一致。另外，松散层(即，双功能纳米纤维支架的内层，如图2B中)在2周时开始降解，并且在1个月内开始重塑，如通过原位植入的移植物的直径略有增加所观察到的(图5H)。同样，确定原位植入的支架没有形成动脉瘤或增生。纳米纤维支架的内部，如图2B的中间图像所示，在本文中被称为“松散层”，所述松散层是指其较不致密、多孔和互连的性质。纳米纤维支架的外部，如图2C中最左侧的第一个图像所示，被称为“致密层”，所述致密层是指其高密度的聚合物。当提及本文所公开的纳米纤维支架的双层结构时，术语“内层”和“松散层”在本文中可互换使用。当提及本文所公开的纳米纤维支架的双层结构时，术语“外层”和“致密层”在本文中可互换使用。

原位移植物的多普勒和超声可视化和分析

在植入后1、2和3个月的预定时间，使用配备有RMV-704扫描头(空间分辨率40mm)(或等效物)的Vevo

重塑的组织工程化血管(TEBV)的组织学观察

在用含3.7％甲醛的PBS固定之前将TEBV用PBS洗涤，并且放置过夜以进行反应。随后将它们通过使用乙醇脱水，包埋在石蜡中，并且以5mm的厚度切片。将切片脱蜡，用一系列分级乙醇再水化，并且用H-E、马森三色和伟郝夫范吉森方法染色。

移植组织工程化血管的表征和评估

多孔且互连的支架在短短一周后被天然细胞浸润，导致聚合物降解和内层重塑。原位植入一个月后，支架内部大部分已降解，被天然细胞替代，形成复杂的组织构型(图6A和6B)。血管移植物在1周、2周、1个月和3个月时的苏木精和曙红染色(H&E)表明了支架设计对促进细胞浸润、迁移和增殖的有效性。通过这些图像，在支架内观察到增殖和迁移的细胞，并且组织形成有以层状方式定向的细胞，类似于天然脉管系统。使用马森的三色和伟郝夫范吉森染色方法说明了1个月和3个月时新形成的组织中胶原蛋白和弹性蛋白的沉积(图7)。染色表明，一个月后沉积了大量的胶原蛋白，并且三个月后沉积了大量的弹性蛋白，两种ECM蛋白均接近天然组织水平。免疫荧光染色用于说明平滑肌细胞分泌的SM22，即标志物蛋白，显示了占据重塑支架的细胞是平滑肌细胞。这表明平滑肌细胞已浸润支架并且在术后1个月和3个月使大鼠主动脉再生(图8A-8C)。血管移植物的内皮化对于长期存活和成熟组织的形成很重要。使用血管性血友病因子(vWf)进行免疫组织化学以表明支架内皮化能力的有效性，其中在2周时不完全内皮化并且在一个月和三个月时完全内皮化(图9)。本文合成的纳米纤维支架是第一组织工程化移植物，其能够在短短一周后被天然细胞浸润；具有支架的内部使得溶液中单体的浓度维持在5％w/v一个月和三个月。

因此，实例6表明了包含本公开的可生物降解的共聚物的本公开的纳米纤维支架的成功植入和根据本公开的方法的成功组织再生。