显微螺旋相衬成像方法及系统

技术领域

本发明涉及一种显微螺旋相衬成像方法及系统，属于相衬成像领域。

背景技术

在光学显微领域，为了实现对透明样品非染色原位成像，通常使用相差显微技术、微分干涉相差显微技术、螺旋相衬成像技术等。对上述技术具体说明如下：

1)相差显微镜是利用环形照明光源与物镜后焦面的环形相差环，来实现参考光与物体散射光的相位强度重新分布，获得物体散射边界强度增强的现为效果，达到观察透明样品的边缘的目的。

2)微分干涉相差显微镜，是利用一对渥拉斯顿棱镜，将入射偏振光源分离成辐照在样品微小剪切位移位置的两个正交偏振分量，而后再重组使之重合后相干成像，实现探测样品相位变化的功能。

3)为实现与1)中的相差显微镜利用空间滤波技术实现边界增强功能外，同时实现2)中的微分干涉相差显微镜实现浮雕像的效果，frey A.Davis等人于2000年在Imageprocessing with the radial Hilbert transform:theory and experiments中提出了一种基于4f系统的螺旋相衬成像系统。该系统是利用一对共焦的透镜，在成像光路的共焦傅里叶面使用带有螺旋相位的空间光调制器进行滤波，从而最终在输出面实现边界凸显或者浮雕像的效果。但是若需要在显微系统中实现该功能需要在成像过程中加入额外的透镜进行傅里叶变换，会导致成像分辨率下降的问题，以及对现有显微镜结构进行改造等不便。

上述问题是在实现螺旋相衬成像过程中应当予以考虑并解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的显微螺旋相衬成像方法及系统避免了通常情况下引入额外的傅里叶透镜带来的分辨率下降问题，且无需对显微镜进行改造。

本发明的技术解决方案是：

一种显微螺旋相衬成像方法，用于在显微镜成像面实现边界增强或浮雕像效果，来观测低衬度差样品的形貌相位差异，包括以下步骤，

S1、构建螺旋相差物镜，螺旋相差物镜包括依次设置的共轭成像透镜组和螺旋相位片，共轭成像透镜组为任意满足共轭成像规律的成像透镜组；

S2、由步骤S1得到的螺旋相差物镜，布置显微螺旋相衬成像系统，显微螺旋相衬成像系统包括依次设置的光源、聚光镜、螺旋相差物镜、目镜和拍照记录系统；

S3、调整螺旋相差物镜中的螺旋相位片位置，使螺旋相位片所在平面为系统光源发出的背景光经过聚光镜后的会聚点所在平面的共轭面，获得调整后的显微螺旋相衬成像系统；

S4、将透明样品置于聚光镜与螺旋相差物镜之间，调节聚光镜，当光源发出的背景光经过聚光镜后的会聚点在共轭面的成像与螺旋相位片中心重合时，在螺旋相差物镜的成像面获得边界增强效果的实像；当光源发出的背景光经过聚光镜后的会聚点在共轭面的成像偏离螺旋相位片中心，且螺旋相位片中心仍落在会聚点在共轭面成像的内部时，在螺旋相差物镜的成像面获得浮雕效果的实像；

S5、步骤S4获得的实像再经过目镜第二次放大，即可在观测面获得两次放大后的具有边界增强或浮雕效果的虚像。

进一步地，步骤S1中，螺旋相位片的透射系数

进一步地，步骤S3中，使螺旋相位片所在平面为光源发出的背景光经过聚光镜后的会聚点所在平面的共轭面，具体为，光源发出的背景光经过聚光镜后的会聚点所在平面与物平面和共轭成像透镜组的物方主平面的距离分别为Δ和R，像方主平面距离螺旋相位片和螺旋相位片与成像面的距离分别为d

进一步地，步骤S3中，调整后的显微螺旋相衬成像系统中，物平面与成像面的距离关系满足：

进一步地，步骤S4中，调节聚光镜后，物平面的光场分布、螺旋相位片所在平面的光场分布与成像面的光场分布分别为：

物平面的光场分布为：

其中，x

距离像方主平面d

其中，x

再经过距离d

E

其中，x

一种实现上述任一项所述的显微螺旋相衬成像方法的显微螺旋相衬成像系统，包括依次设置的光源、聚光镜、螺旋相差物镜、目镜和拍照记录系统，螺旋相差物镜包括共轭成像透镜组和螺旋相位片，共轭成像透镜组可以为任意满足共轭成像规律的成像透镜组，螺旋相位片所在平面为系统光源发出的背景光经过聚光镜后的会聚点所在平面的共轭面。

进一步地，聚光镜与螺旋相差物镜间设有滤色片。

本发明的有益效果是：该种显微螺旋相衬成像方法及系统，通过将螺旋型相位片加装于系统光源发出的背景光经过聚光镜后的会聚点的共轭面，即可在不引入额外的进行傅里叶变换的透镜以及避免对显微镜进行结构改造的前提下在正常显微镜系统的拍照或记录系统中，获得类似径向剪切干涉对比成像(微分干涉)的浮雕效果或相衬成像中的边界增强的显微图像，可用于观测低衬度差样品的形貌相位差异，避免了引入额外透镜带来的分辨率下降以及需要对显微镜进行结构改造的问题。

附图说明

图1是本发明实施例显微螺旋相衬成像方法的流程示意图；

图2是螺旋相差物镜的原理说明示意图；

图3是显微螺旋相衬成像系统的说明示意图；

图4是实施例中透明样品采用肿瘤细胞样品在10倍物镜的普通明场显微系统和显微螺旋相衬成像系统下观察到的图像对比图，其中，(a)是使用10倍物镜的普通明场显微系统观察到的肿瘤细胞样品图片，(b)是使用10倍螺旋相差物镜的显微螺旋相衬成像系统观察到的肿瘤细胞样品图片，且光源会聚点在共轭面的成像与螺旋相位片中心重合，(c)是使用10倍螺旋相差物镜的显微螺旋相衬成像系统观察到的肿瘤细胞样品图片，且光源会聚点在共轭面的成像偏离螺旋相位片中心；

图5是实施例中光源会聚点在共轭面的成像与螺旋相位片中心重合时，透明样品采用肿瘤细胞样品在显微螺旋相衬成像系统下观察到的图像；其中，(a)是使用20倍螺旋相差物镜的显微螺旋相衬成像系统观察到的肿瘤细胞样品图片，(b)是使用40倍螺旋相差物镜的显微螺旋相衬成像系统观察到的肿瘤细胞样品图片；

图6是实施例中透明样品采用未染色植物根茎切片在10倍物镜的普通明场显微系统和显微螺旋相衬成像系统下观察到的图像对比图；其中，(a)是使用10倍物镜的普通明场显微系统观察到的未染色植物根茎切片的图片，(b)是使用10倍螺旋相差物镜的显微螺旋相衬成像系统观察到的未染色植物根茎切片的图片，且光源会聚点在共轭面的成像与螺旋相位片中心重合，(c)是使用10倍螺旋相差物镜的显微螺旋相衬成像系统观察到的未染色植物根茎切片的图片，且光源会聚点在共轭面的成像偏离螺旋相位片中心；

图7是实施例中透明样品采用硅藻样品在10倍物镜的普通明场显微系统和显微螺旋相衬成像系统下观察到的图像对比图，其中，(a)是使用10倍物镜的普通明场显微系统观察到的硅藻样品的图片，(b)是使用10倍螺旋相差物镜的显微螺旋相衬成像系统观察到的硅藻样品的图片，且光源发出的背景光经过聚光镜后的会聚点在共轭面的成像与螺旋相位片中心重合；

其中：1-光源，2-聚光镜，3-共轭成像透镜组，4-螺旋相位片，5-目镜，6-拍照记录系统，7-透明样品，8-滤色片；

31-共轭成像透镜组的物方主平面，32-共轭成像透镜组的像方主平面。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明的优选实施例。

实施例

一种显微螺旋相衬成像方法，用于在显微镜成像面实现边界增强或浮雕像效果，来观测低衬度差样品的形貌相位差异，如图1和图2，包括以下步骤，

S1、构建螺旋相差物镜，螺旋相差物镜包括依次设置的共轭成像透镜组和螺旋相位片4，共轭成像透镜组采用为任意满足共轭成像规律的成像透镜组；

步骤S1中，螺旋相位片4的透射系数

S2、由步骤S1得到的螺旋相差物镜，布置显微螺旋相衬成像系统，显微螺旋相衬成像系统包括依次设置的光源1、聚光镜2、螺旋相差物镜、目镜5和拍照记录系统6；

S3、调整螺旋相差物镜中的螺旋相位片4位置，使螺旋相位片4所在平面为系统的光源1发出的背景光经过聚光镜后的会聚点所在平面的共轭面，获得调整后的显微螺旋相衬成像系统；

步骤S3中，使螺旋相位片4所在平面为成像系统的光源1发出的背景光经过聚光镜后的会聚点所在平面的共轭面。具体为，光源1发出的背景光经过聚光镜后的会聚点所在平面与物平面和共轭成像透镜组的物方主平面31的距离分别为Δ和R，共轭成像透镜组的像方主平面32距离螺旋相位片4和螺旋相位片4与成像面的距离分别为d

步骤S3中，调整后的显微螺旋相衬成像系统中，物平面与成像面的距离关系满足：

S4、将透明样品7置于聚光镜2与螺旋相差物镜之间，调节聚光镜2，当光源1发出的背景光经过聚光镜2后的会聚点在共轭面的成像与螺旋相位片4中心重合时，在螺旋相差物镜的成像面获得边界增强效果的实像；当光源1发出的背景光经过聚光镜2后的会聚点在共轭面的成像偏离螺旋相位片4中心时，螺旋相位片4中心仍落在光源1发出的背景光经过聚光镜2后的会聚点在共轭面成像的内部，在螺旋相差物镜的成像面获得浮雕效果的实像。

步骤S4中，调节聚光镜后，物平面的光场分布、螺旋相位片4所在平面的光场分布与成像面的光场分布分别为：

物平面的光场分布

其中，x

物光经过共轭成像透镜组3后，在与像方主平面32距离d

其中，x

此时该平面为物平面的傅里叶面，光场复振幅分布为透射函数傅里叶变换乘二次相位因子，在此平面放置螺旋相位片4。再经过距离d

E

其中，x

S5、步骤S4获得的具有边界增强或者浮雕效果的实像E

成像效果以拓扑核l＝1为例，螺旋相位片4的中心对称区域相位差为π。因此均匀的背景辐照光源1，会聚于螺旋相位片4的中心，受到相差π的调制，在成像面成相消的暗背景。而有相位差异的样品产生的物光，其在光源1共轭面则不分布于螺旋中心奇点，故在成像面呈现明亮的像，此成像效果与利用4f系统实现螺旋相衬成像中的边界增强效果保持一致。

该种螺旋相衬成像方法及系统，通过将螺旋型相位片加装于系统光源1发出的背景光经过聚光镜2后的会聚点所在平面的共轭面，即可在拍照记录系统6中获得类似径向剪切干涉对比(微分干涉)的浮雕效果或相差成像系统中的边界增强的显微图像，能够在保持原有显微镜放大倍数和分辨率的前提下观测低衬度样品的形貌相位差异。

一种实现上述任一项所述的显微螺旋相衬成像方法的显微螺旋相衬成像系统如图3，包括依次设置的光源1、聚光镜2、螺旋相差物镜、目镜5和拍照记录系统6，螺旋相差物镜包括共轭成像透镜组3和螺旋相位片4，螺旋相位片4所在平面为光源1发出的背景光经过聚光镜2后的会聚点所在平面的共轭面。可在聚光镜2与透明样品7间设置滤色片8，以提高光源相干性以获得更好的成像效果。

该种显微螺旋相衬成像方法及系统，通过将螺旋相位片4加装于系统光源1发出的背景光经过聚光镜2后的会聚点所在平面的共轭面，即可在拍照记录系统6中观察到具有螺旋相衬成像的效果的图片，同时保持原有放大倍数与分辨率。该种螺旋相衬成像方法及系统，不同于通常使用4f系统实现螺旋相衬成像的光路，避免了在成像过程中加入额外的傅里叶透镜导致的成像分辨率下降以及需要对显微镜结构进行改造带来不便等问题。

实施例的该种显微螺旋相衬成像方法及系统进行实验验证如下：

将实施例的该种显微螺旋相衬成像系统集成于显微镜系统中用于实现透明样品7的显微螺旋相衬成像，如图3，将透明样品7置于聚光镜2与螺旋相差物镜之间，在聚光镜2与透明样品7间设置滤色片8，以下均利用徕卡DM2000显微镜进行架构。

图4是实施例中透明样品7采用肿瘤细胞样品在10倍物镜的普通明场显微系统和显微螺旋相衬成像系统下观察到的图像对比图，其中，(a)是使用10倍物镜的普通明场显微系统观察到的肿瘤细胞样品图片，(b)是使用10倍螺旋相差物镜的显微螺旋相衬成像系统观察到的肿瘤细胞样品图片，且光源会聚点在共轭面的成像与螺旋相位片中心重合，(c)是使用10倍螺旋相差物镜的显微螺旋相衬成像系统观察到的肿瘤细胞样品图片，且光源会聚点在共轭面的成像偏离螺旋相位片中心；在未经螺旋相位片4滤波的明场显微成像中，细胞图像衬度较差，如图4的(a)；而在使用10倍螺旋相差物镜的显微螺旋相衬成像系统下观察，当背景光经过聚光镜2后的会聚点在共轭面的成像与螺旋相位片4中心重合时，可观察到类似普通相差显微镜的边缘增强效果，如图4的(b)；当背景光经过聚光镜2后的会聚点在共轭面的成像偏离螺旋相位片4的中心时，则可以在成像面获得类似微分干涉的浮雕效果图，如图4的(c)。而当肿瘤细胞样品在20倍及40倍螺旋相差物镜的显微螺旋相衬成像系统下观察，得出的成像图片分别如图5的(a)和(b)所示，且背景光经过聚光镜2后的会聚点在共轭面的成像与螺旋相位片4中心重合，具有相同的边界增强效果。

图6是实施例中透明样品7采用未染色植物根茎切片在10倍物镜的普通明场显微系统和显微螺旋相衬成像系统下观察到的图像对比图；其中，(a)是使用10倍物镜的普通明场显微系统观察到的未染色植物根茎切片的图片，(b)是使用10倍螺旋相差物镜的显微螺旋相衬成像系统观察到的未染色植物根茎切片的图片，且光源会聚点在共轭面的成像与螺旋相位片中心重合，(c)是使用10倍螺旋相差物镜的显微螺旋相衬成像系统观察到的未染色植物根茎切片的图片，且光源会聚点在共轭面的成像偏离螺旋相位片中心。在未经螺旋相位片4滤波的明场显微成像中，平层显黑色网络状，如图6中的(a)所示。而在实施例的显微螺旋相衬成像系统中观察，当背景光经过聚光镜2后的会聚点在共轭面的成像与螺旋相位片4中心重合时，可看到边界增强的效果，如图6中的(b)所示；而当背景光经过聚光镜2后的会聚点在共轭面的成像偏离螺旋相位片4的中心时，可看到类似浮雕的效果图像，如图6中的(c)所示。

图7是实施例中透明样品7采用硅藻样品在10倍物镜的普通明场显微系统和显微螺旋相衬成像系统下观察到的图像对比图，其中，(a)是硅藻样品在使用10倍物镜的普通明场显微成像系统中观察到的图片，(b)是背景光会聚点在共轭面的成像与螺旋相位片中心重合时，硅藻样品在10倍螺旋相差物镜的显微螺旋相衬成像系统下观察到的图片。对于硅藻类样品，因其本身具有一定厚度，使用实施例的显微螺旋相衬成像系统的显微镜观察，立体感更为强烈。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。