一种高酸碱耐受的融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种高酸碱耐受的融合蛋白及其制备方法和应用。

技术背景

各种细菌中已分离出几种对免疫球蛋白(Ig)具有固有亲和力的蛋白质。这些分子包括从金黄色葡萄球菌中提取的蛋白A，来自c群链球菌蛋白G；它们都含有55-76个重复的氨基酸残基，能够介导Ig结合。蛋白A为金黄色葡萄球菌细胞壁的免疫球蛋白结合蛋白，它包含5个与免疫球；蛋白A除可以特异性的同IgG的Fc区域结合，还可以同IgG的Fab区域结合。蛋白G为链球菌细胞壁的免疫球蛋白结合蛋白，它包含3个与IgG特异性结构的串联的结构域。同样，蛋白G也具有部分结合Fab的CH1结构域的特性。

蛋白A、蛋白G是微生物来源的天然蛋白质，可以和哺乳动物的免疫球蛋白结合，蛋白G不仅与Fc区域结合，还与人类IgG1同型的CH1结构域结合。因此，与蛋白A相比，它具有更广泛的应用。蛋白质A、G在与荧光色素、酶或金颗粒偶联时保持其功能的能力，使它们成为ELISA、免疫组织化学、流式细胞术和电子显微镜中极有价值的检测试剂。

基于这些特性，蛋白A、蛋白G在纯化抗体、免疫沉淀、有效的去除或减少非特异性背景等领域具有巨大优势。蛋白A、蛋白G与不同的免疫球蛋白的结合能力并不一样，它们受到后者的来源及亚类的影响。市面上的单独的蛋白A或者蛋白G，无法满足对大部分种源的免疫球蛋白的结合，则造成纯化抗体的类型比较单一。若单独的蛋白A或者蛋白G代替二抗，广泛应用于免疫化学等领域则可能造成检测结果的稳定性降低。若应用于分子科研领域，则可能不完全去除某些实验结果背景，造成结果的误判。

公开号为CN102676562A、名称为《一种对抗体具有广谱吸附能力的融合蛋白制备方法及应用》的专利文献，公开了通过基因工程手段，将蛋白A和蛋白G的基因进行融合表达得到的融合蛋白，兼具蛋白A和蛋白G优点，具有可以与人不同亚类免疫球蛋白G选择性结合，对血液中白蛋白等非免疫球蛋白物质的非特异性吸附低的优势。

发明内容

针对上述存在的技术局限性，本发明提出了一种高酸碱耐受的融合蛋白及其制备方法和应用；其克服了背景技术中提到的不足和缺陷。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的发明点是提供一种融合蛋白PA-G，所述融合蛋白PA-G融合了蛋白A和蛋白G的Ig优势结合域，融合蛋白PA-G的氨基酸序列为如SEQ ID NO.1所示的序列，或与SEQID NO.1所示序列具有90％以上同源性且具有相同功能的序列。

SEQ ID NO.1所示氨基酸序列为：

AQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGE AQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAGGGGSGGGGSGGGGSDTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPEVIDASELTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPEVIDASELTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTEMVC*。

本发明的第二个发明点是提供了编码上述融合蛋白PA-G的基因，所述编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO.2所示的序列，或与SEQ ID NO.2所示序列具有90％以上同源性的序列。

SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为：

gctcagcacgatgaagcgcagcagaacgcattctatcaagttctgaacatgccgaacctgaacgcagatcag cgtaatggctttatccagtctctgaaagacgatccgtctcagagcgctaacgtgctgggtgaggcacaaaaactgaacgactcccaggcgccgaaagccgacgcacaacagaataacttcaacaaggatcagcagtccgcattctacgagattctgaacatgccaaatctgaatgaagcacaacgtaacggtttcatccagagcctgaaagatgacccgtcccagtctaccaacgtcctgggcgaagcgaaaaaactgaacgaatcccaggcaccgaaagcagacaacaactttaacaaggaacagcagaacgcattctatgaaattctgaacatgccgaacctgaacgaagaacagcgcaacggttttatccagagcctgaaagatgatccgtctcagtctgcaaacctgctgtccgaggctaaaaaactgaatgaaagccaggctccgaaggctgacaacaagttcaacaaagaacagcagaacgcgttctatgaaatcctgcacctgccgaacctgaacgaagagcagcgtaacggttttattcagtctctgaaagatgacccgtctcagagcgctaacctgctggcggaggcgaagaaactgaatgacgcgcaggcgcctaaagcggataacaaattcaacaaagaacagcagaacgcattttatgaaatcctgcacctgccgaacctgacggaagaacagcgtaacggctttatccagtctctgaaagatgacccgtctgtgagcaaagaaatcctggctgaggcgaaaaaactgaacgacgctggtggtggtggttccggtggtggtggtagcggtggtggtggtagcgacacctataaactgatcctgaacggtaagactctgaaaggtgaaaccaccaccgaagcagttgatgccgcaacggcggaaaaagtcttcaaacagtacgctaacgacaacggtgtcgatggcgaatggacctatgacgacgcgaccaaaacctttaccgttaccgaaaaaccggaagtaattgatgcgagcgagctgactcctgctgtgacgacctacaagctggtaatcaacggtaaaaccctgaaaggcgaaaccacgaccgaagcagttgatgcagcgaccgccgaaaaagtttttaagcagtacgcgaacgacaacggcgtagacggcgagtggacctacgacgatgcgaccaaaaccttcactgttaccgaaaaaccggaagttatcgatgcgtctgaactgaccccggctgtaactacctacaaactggtgatcaacggcaagaccctgaaaggcgaaactactaccaaagcagtagacgcagaaactgctgaaaaagcttttaagcagtacgcgaacgataacggtgtagatggcgtttggacttacgacgatgccactaaaactttcaccgttacggaaatggtgtgctaa。

本发明的第三个发明点是提供了一种重组表达载体，所述的重组表达载体中插入有上述的基因。

可选地，上述一种重组表达载体，所述表达载体为pET系列载体，优选为pET-32a表达质粒、pET-26b表达质粒或pET-28a表达质粒，最优选为pET-28a表达质粒。

本发明的第四个发明点是提供了一种重组表达融合蛋白PA-G的重组菌株，由上述的重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞得到的重组菌株。

可选地，上述的一种重组表达融合蛋白PA-G的重组菌株，所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL21感受态细胞、大肠杆菌rosetta感受态细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞；优选为大肠杆菌BL21感受态细胞。

本发明的第五个发明点是提供了一种制备上述融合蛋白PA-G的方法，所述方法是利用上述的重组菌株发酵制备所述的融合蛋白PA-G。

可选地，上述的制备方法，包括以下步骤：利用表达载体pET-28a构建含有所述融合蛋白PA-G基因的重组表达载体；以该载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过培养、筛选得到能够表达所述融合蛋白PA-G的重组菌株；重组菌株培养后，IPTG诱导蛋白表达，分离并纯化所表达的融合蛋白PA-G。

本发明的第六个发明点是提供了所述的融合蛋白PA-G在抗体纯化、免疫沉淀、拓展酸碱耐受性方面的应用。

在抗体纯化应用中，基于现在流行的单克隆抗体(mAbs)形成了临床试验中最大的生物制药类别，其数量正在迅速增加，有效的使宿主细胞蛋白、细胞培养基添加剂、DNA和内毒素从单抗制剂中去除，才能让蛋白质安全地应用于人体治疗。

在免疫沉淀应用中，可利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白，用以识别鉴定某种或某一类蛋白。

在扩展酸碱耐受性应用中，则是加大了适应极性物质的特性阈值、以及扩大对所使用的缓冲液的pH的范围。

本发明的第七个发明点是提供了所述的融合蛋白PA-G的编码基因、所述的重组表达载体、所述的重组菌株在抗体纯化、免疫沉淀、拓展酸碱耐受性方面的应用。

与现有技术相对比，本发明具有以下优点：

本发明公开一种具有免疫球蛋白结合能力的融合蛋白PA-G，其是为了克服现有的蛋白A、蛋白G不能覆盖全部的不同亚型种源的免疫球蛋白，且为具有更加良好理化特性而构建的融合蛋白，此融合蛋白包括Protein A、Protein G两个蛋白的Ig优势结合域，并且对其序列的密码子使用偏好性、5'区域优化(翻译起始效率)、DNA重复序列、mRNA二级结构、GC含量、SD序列、排除指定的限制性内切酶位点进行优化后翻译表达，在其对Protein AG的蛋白表达条件及纯化条件的优化下所得的蛋白PA-G不仅具有比蛋白A、蛋白G更扩大的生物学特性势，如对于不同种属、亚型的免疫球蛋白均具有较好亲和力和较快的结合效率。且通过耐酸碱性研究实验发现：融合蛋白PA-G最主要的是对pH的耐受性更宽，应用前景和应用范围更为广阔。

附图说明

图1为本发明融合蛋白PA-G(Protein AG)的蛋白表达条件优化图；其中，泳道M：100kDa彩色预染蛋白；泳道1～4：诱导时间均为2h，诱导剂浓度分别1、0.8、0.4、0.2mmol/L；泳道5～8：诱导时间均为3h，诱导剂浓度分别1、0.8、0.4、0.2mmol/L；泳道9～12：诱导时间均为4h，诱导剂浓度分别1、0.8、0.4、0.2mmol/L；泳道13：诱导时间为1h，诱导剂浓度为1mmol/L。

图2为本发明融合蛋白PA-G(Protein AG)的蛋白表达形式分析图；其中，泳道M：100kDa蛋白Maker。

图3为本发明融合蛋白PA-G(Protein AG)的蛋白纯化条件优化图；其中，泳道M：120kDa蛋白Maker。

图4为本发明融合蛋白PA-G(Protein AG)与山羊抗小鼠(IgG)结合的ELISA数据图。

图5为本发明融合蛋白PA-G(Protein AG)耐酸碱的SDS-PAGE检测结果图。

图6为本发明融合蛋白PA-G(Protein AG)耐酸碱的ELISA数据结果图。

图7为本发明所构建的表达载体质粒结构图。

图8为本发明融合蛋白PA-G的蛋白质二、三级结构示意图。

图9为本发明融合蛋白的基因序列优化图，显示了密码子适应指数(CAI)、同义密码子相对使用度(RSCU)以及GC含量的前后对比。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。本文中所使用的试剂和仪器均商购可得，所涉及的表征手段均可参阅现有技术中的相关描述，本文中不再赘述。

为了进一步了解本发明，下面结合最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

重组Protein AG的高效表达及耐酸碱的应用验证实验：

1、实验材料：蛋白Maker，Tiangen(天根生化科技(北京)有限公司)；考马斯亮蓝，GenScript(金斯瑞生物科技股份有限公司)；蛋白上样缓冲液，Biosharp(白鲨，兰杰柯科技有限公司)；HRP标记羊抗鼠，碧云天(碧云天生物技术有限公司)。

2、实验方案：

重组Protein AG的高效表达及耐酸碱的应用验证方法，包括以下步骤：

A、Protein AG基因克隆及载体质粒的构建：

为实现Protein AG高耐酸碱性及继承Protein A、Protein G的生物学优势特性，设计优化Protein AG的基因，并通过苏州金唯智生物科技有限公司常规合成基因SPAC，添加5'(BamHI)and 3'(XhoI)，将基因通过5'BamHI and 3'XhoI克隆至载体pET-28a(+)(Kanamycin)，构建质粒SPAC in pET-28a(+)，制备1份mini-scale重组质粒DNA并分成1管和1管甘油菌。

B、Protein AG的蛋白表达条件优化：

为实现目的蛋白的最优表达效果及最佳的可溶性表达形式，运用控制变量法对原核表达的诱导条件进行优化，将实验条件变成两组，在诱导温度不变的情况下，分别是诱导时间、IPTG的浓度。

C、Protein AG的蛋白表达形式分析验证：

为实现Protein AG蛋白的表达形式趋向于可溶，验证其表达形式分析后，是否更改其表达条件趋向于可溶，使其不需要复性。由于包涵体蛋白质仅仅具有正确的一级氨基酸序列，不能形成正确的空间三维结构，不具备它应有的生物活性。所以让目标蛋白质由包涵体变成可溶性的表达。

D：Protein AG的纯化条件优化及蛋白纯度、浓度验证：

为实现大量纯化Protein AG，统一纯化工艺，使其能够批量生产，因而在纯化的过程中，对其裂解时间、洗脱浓度进行优化后统一工艺。再应用蛋白BCA测定法测定浓度，以便后续实验。

E：直接ELISA法初步评价Protein AG与IgG的结合能力：

Protein AG与IgG的结合能力可以应用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)实验来初步评价，其直观的数据可表明Protein AG与IgG的结合能力的强弱。

F：Protein AG耐酸碱性的应用研究：

为探究Protein AG耐酸碱性，使其直观的表现出对于酸性、碱性的耐受性，设计出两个实验，分别是十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE)检测、以及ELISA检测。SDS-PAGE检测可直观看出Protein AG酸碱性的梯度实验下是否有降解，而ELISA检测数据可以表明在酸碱性的梯度实验下对的IgG结合能力的强弱。

实施例2

Protein AG基因克隆及载体质粒的构建：

采用DNA全序列合成法来人工合成Protein AG核苷酸序列和对应的氨基酸序列，核苷酸序列为SEQ ID NO.2，氨基酸序列为SEQ ID NO.1。将Protein A与Protein G的Ig优势结合域的氨基酸序列进行结合，即Protein A+linker+Protein G，linker序列如SEQ IDNO.3所示；并在C端加一个半胱氨酸，其设计用于单点连接耦合以进行固定，加入酶切位点BamHI和XhoI与pET-28a(+)表达载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，该质粒命名为SPAC-28a。

SEQ ID NO.3：ggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagc。

实施例3

Protein AG的蛋白表达条件优化及表达形式分析验证：

从冰箱中取出SPAC-28a(BL21)，吸取5μl(1：1000)的Knan(100μg/ml)和50μl(1：100)的菌液至灭菌的5ml试管培养基中，37℃，200r/min过夜培养活化，至培养基浑浊。培养的SPAC-28a试管菌液转移到4支5mL培养基中，加入5μl Kana(卡那霉素)，200r，37℃培养2h左右，实时监测OD值，当OD600达到0.6～0.8时停止培养，取出该瓶。为实现目的蛋白的最优表达效果及最佳的可溶性表达形式，运用控制变量法对原核表达的诱导条件进行优化，将实验条件变成两组，在诱导温度不变的情况下，分别是诱导时间、IPTG的浓度。分别向4支5mL的菌液中加入1、2、4、5μl的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG(预先配制的1mmol/L的IPTG)。37℃，200r/min钟培养4小时，在1h、2h、3h、4h分别取样，收集菌体沉淀，4℃8000rpm离心5分钟。弃去上清，将菌体沉淀收集离心管中，用1×PBS重悬离心洗涤蛋白去上清，优化时可不做超声波破碎，取未诱导菌液做对照，取所有样品40μl加用5×蛋白上样缓冲液10μl于沸水中煮10min，混合取10μl的适量样品用12％ SDS-PAGE鉴定。同时设立未诱导菌液对照，SDS-PAGE检测。从图1可以看出该蛋白在诱导温度37℃，时间2、3、4h中都表达良好，在IPTG浓度0.4、0.8、1mmol/L中表达良好，该蛋白命名为Protein AG。之后诱导该蛋白可取时间3h、诱导剂浓度为0.8mmol/L表达。

实施例4

Protein AG的蛋白表达形式分析验证：

活化、扩培SPAC-28a(BL21)在500ml的培养基中，以诱导温度37℃、诱导时间3h、诱导剂浓度为0.8mol/L的条件下诱导该蛋白，弃去上清，将菌体沉淀收集离心管中，用1×PBS重悬离心洗涤蛋白去上清，用50ml菌体裂解液吹溶沉淀待超声波冰浴破碎。

冰浴破碎：功率250W超4s停4s破碎15-30min至破碎完全，菌液澄清透光。破碎后收集至50ml离心管中离心8000rpm离心5～10min，收集上清与沉淀。上清取40μl，沉淀用100μl1×PBS重悬取40μl各加入10μl蛋白上样缓冲液(5×)沸水煮10min瞬离，在12％ BT浓度的胶电泳。鉴别目的蛋白是在上清还是沉淀中。从图2中可以看出破碎后的PA/G蛋白上清中有明显的目的条带，Protein AG沉淀中有目的条带但其目的蛋白的含量远远低于上清中的含有量，且都位于58.5KD，即PA/G为可溶性的表达形式，无需对其低温诱导和改变其他诱导条件。

实施例5

Protein AG的纯化条件优化及蛋白纯度、浓度验证：

先用纯水分别将A1，A2，B1，泵冲洗，流速：2ml/min；用洗脱液(咪唑)充盈B1泵；用平衡液(1×PBS pH8.0 Buffer)平衡A2管路；冲洗平衡后切换A1上样，1ml/min，开始出现峰时收集流穿液；流穿液收集完成后，切换A2平衡管值，平衡后启动B1泵，调整梯度50mM、300mM、500mM梯度洗脱，2ml/min，收集洗脱液；收集完成后，A2管路清洗(平衡液)，A1泵用纯水清洗，保存柱子(20％乙醇水溶液)。分别取40μl的流穿液，50mM，300mM、500mM洗脱液加入10μl的5×loading buffer，煮样10分钟待检测。从图3实验结果表明，50mM的咪唑洗脱液能够下去大部分的杂蛋白和少量的PA/G蛋白，300mM的咪唑洗脱液能够将大部分的PA/G蛋白洗脱下来。对纯化下来的300mM的PA/G蛋白进行超滤，在1×pbs多次洗涤后，使其咪唑含量低于0.2mM，盐离子浓度在50～100mM之间。BCA测定超滤后的PA/G蛋白浓度，分别用超滤后原液，3倍稀释，9倍稀释。选用已知在线性关系内换算的的蛋白浓度为准，所得蛋白浓度为4.22mg/mL(至少＞1mg/mL)，总共5mL。最后蛋白在-20度保存，避免反复冻融，效期1年。

实施例6

直接ELISA法初步评价Protein AG与IgG的结合能力：

抗原包被:将Protein AG蛋白用CBS包被缓冲液稀释至1ppm，充分混匀。稀释完成后按100μL/孔添加到微孔板中，盖好封板膜，放到37℃恒温箱中反应两个小时或4℃过夜，取出，用1×洗涤液(pH7.4)洗涤1遍，250μL/孔，洗板无需浸泡等待。设置空白对照1孔(不包被Protein AG蛋白)、阴性对照2孔(包被Protein AG蛋白，但不使用HRP标记的IgG抗体)、3-6孔是包被Protein AG蛋白、7-8孔包被VP1-28a蛋白、9-10孔则是包被其他蛋白。

封板：用RAC封闭液，按200μL/孔添加到微孔板中，直接放到37℃中反应两个小时，取出直接拍干。

酶标二抗的结合：酶标抗体HRP标记的山羊抗小鼠(IgG)用1×PBS 5000倍稀释，每孔加入100μl，置恒温培养箱放37℃30min。洗板5次。

显色：加入底物显色液：每孔加入底物显色液，100μl/孔，置37℃恒温培养箱15min。

测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，5分钟内测定OD450 nm处吸光度值。

结果：从图4可知Protein AG蛋白与HRP标记的山羊抗小鼠(IgG)结合的能力显著。

实施例7

Protein AG耐酸碱性的应用研究：

十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE)：将Protein AG用0.01mol/L PBS(pH7.4)稀释到终浓度为(2mg/mL)，加入3倍体积不同pH值的生理盐水。分别设pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11、pH12，10个试验组，每组4管。将各个样品管置37℃保温在同一pH值组样品分别于1、2、3、4h取样一支待测。然后SDS-PAGE检测，是否会有降解条带。SDS-PAGE结果判读：从图5中可知在各PH值得PBS的作用下均未有降解条带，说明Protein AG短时间内比耐受过酸与过碱。

ELISA检测：将Protein AG用0.01mol/L PBS(pH7.4)稀释到终浓度1ppm。将100μL的Protein AG过夜4℃包被于ELISA板子上，进行5次PBST洗涤后，过夜4℃使用200μL BSA封闭液封板后，洗涤5次后，加入200μL未对应降解的pH3-pH12值的PBS，孵育1.5h，每个样品2个复孔。设置正常对照(未加PBS)、空白对照(正常封闭不加二抗)、阴性对照(正常封闭加二抗)。洗涤5次后，每孔直接加入HPR标记羊抗鼠2抗(1:5000)100μL显色10min，50μL终止液终止立即在酶标仪读值。

直接ELSIA实验结果判读：从图6可看出各PH值样品的PBS所测的平均OD值起伏不大，且PH3～12整体数据OD值的标准差值仅为0.188，其中PH值为7的样品的标准差值最小为0.022，PH值为11的样品的标准差值最大为0.197，说明Protein AG在各个PH值的PBS作用下，其ELSIA实验的数据差异性不大，进一步说明了Protein AG在pH3-pH12的范围内能够耐受。

各pH值的PBS影响下的OD值与正常实验下的得到的OD值对比，各pH值的PBS未能影响Portein AG与羊抗鼠2抗的结合。

结论：融合蛋白Protein AG在pH3-pH12的范围内能够耐受，并且没有降低与免疫球蛋白的结合能力。

本发明技术与背景技术部分提及的现有技术文献(CN102676562A)具有极大差别。本专利技术的制备方法通过基因合成手段来制备融合蛋白，不同之处在于在本技术中，还对此融合后的序列提前进行了改造和优化，包括但不限于：对5'区域优化(翻译起始效率)、相对同义密码子使用度(RSCU)、DNA重复序列、mRNA二级结构、GC含量、SD序列、排除指定的限制性内切酶位点等优化；这些改造和优化，能够使该基因序列的密码子适应指数(CAI)以及GC含量有所增加，CAI是对于该基因、在编码该蛋白的所有密码子相对于这条基因都使用最优密码子的情况下的适应系数；GC含量的增加则使得DNA的密度更高，在加热或加碱的情况下不易变性。也即是说，能够使得该基因序列翻译的蛋白能够适应极性物质的特性，扩大了所使用缓冲液的pH值范围，应用前景和应用范围更加广阔。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。