一种基于重组贻贝粘蛋白的组织粘合剂及其应用

技术领域

本发明属于医用组织粘合剂技术领域，特别是涉及一种基于重组贻贝粘蛋白的组织粘合剂及其应用。

背景技术

医用组织粘合剂因其具有操作简便、无创粘合、即时密封和止血作用、可有效缩短手术时间等显著优势，获得了医疗领域的广泛关注，并逐渐成为传统手术缝合线的有效辅助或替代手段。

组织粘合剂的通常是指在生理条件下，某些高分子或蛋白通常利用各种反应性基团来实现与组织官能团的共价交联，反应性基团通常包括NHS酯，氰基丙烯酸酯，醛类，邻苯二酚，异氰酸酯和叠氮化物。除了共价相互作用之外，还可以利用物理纠缠、氢键和疏水相互作用等非共价相互作用来产生组织粘附，可以与共价相互作用协同工作以实现牢固的粘附力。通过共价相互作用与非共价相互作用力，使得材料与组织在生理条件下形成粘附，代替手术缝合线，用于体表或体内的缝合。

现有的医用组织粘合剂有四大类：1、基于合成聚合物的粘合剂，包括基于氰基丙烯酸酯，聚乙二醇，聚氨酯和聚酯的粘合剂，作为一种合成高分子材料，用于局部组织创伤的闭合时，它释放的毒性降解产物引起的生物不相容性极大地限制了在体内的应用；2、基于蛋白质的粘合剂，包括纤维蛋白胶，明胶和白蛋白粘合剂，其固化速度较慢、机械强度差、粘结强度小以及可能造成病毒感染等；3、基于多糖的粘合剂，包括壳聚糖、藻酸盐、葡聚糖和透明质酸形成的组织粘合剂，与蛋白质类粘合剂面临相似的困境；4、受活的非哺乳动物生物体启发的粘合剂，包括贻贝、壁虎、蜘蛛和植物等，此类成分提取难度大，转化前景低。其中贻贝粘蛋白的获取途径主要为海洋紫贻贝足部提取，受原材料及提取工艺的限制，获取贻贝粘蛋白纯品的效率及产量较低，极大的限制了贻贝粘蛋白的应用。利用生物技术手段进行重组类贻贝粘蛋白的发酵生产成为现下技术突破的一个重要方向。

发明内容

基于此，为解决现有技术中存在的至少一种技术问题，本发明提出一种基于重组贻贝粘蛋白的组织粘合剂及应用。

一种基于重组贻贝粘蛋白的组织粘合剂，所述组织粘合剂由重组贻贝粘蛋白和聚乙二醇活性酯组成，所述重组贻贝粘蛋白为厚壳贻贝Mytilus coruscus的Mcfp-5成熟肽两端融合紫贻贝Mytilus edulis的Mefp-1肽段，得到的重组贻贝粘蛋白rMfp151。

重组贻贝粘蛋白(Recombinant mussel adhesive protein)是指采用重组DNA技术，对编码所需天然贻贝粘蛋白的基因进行遗传操作和修饰，利用质粒将目的基因带入宿主细胞(细菌、酵母等)中表达并翻译，经发酵、修饰、纯化等工艺制备而成贻贝粘蛋白，易于量产，能够降低从天然贻贝中提取的成本，并且可以避免不同物种带来的免疫原性。重组贻贝粘蛋白rMfp151其表达水平高、羟化率高、纯化较简单、粘性高，一方面能够改善其他蛋白胶如明胶、白蛋白、纤维蛋白等粘合强度低的问题。更重要的是，重组贻贝粘蛋白rMfp151能够更好的促进组织再生，对于组织粘合后的创伤部位再生也有一定的促进作用。相比之下，氰基丙烯酸酯类组织粘合剂降解后易产生毒性，不利于组织再生。聚乙二醇活性酯可以增加溶解度和稳定性，减少粘蛋白的免疫原性，抑制带电分子在修饰表面的非特异性结合。引入后可以进一步提高系统粘度，改善其粘合强度，促进创面愈合。

在其中一些实施例中，所述重组贻贝粘蛋白浓度为100-200mg/mL，所述聚乙二醇活性酯浓度为50-100mg/mL。

在一些实施例中，所述重组贻贝粘蛋白为工程大肠杆菌发酵得到，成本较低。

在一些实施例中，所述聚乙二醇活性酯的重均分子量为5 000-10 000。

在一些实施例中，所述聚乙二醇活性酯为四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯、四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯、双端聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯或双端聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯中的任意一种。优选地，所述聚乙二醇活性酯为四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯或四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯，含有的活性基团更多。

在一些实施例中，所述组织粘合剂的凝胶时间为90-120s。

在一些实施例中，所述组织粘合剂的搭接-剪切拉伸承载强度为0.2-0.25MPa。

本发明的的另一方面还提供了上述组织粘合剂在医用组织粘合药物中的应用。

具体地，将所述药物中的重组贻贝粘蛋白和聚乙二醇活性酯混合后，在1分钟内迅速涂抹于需要粘合的位置，施加1-2N的压力，待医用粘合剂固化完成后撤去压力，完成组织粘合。

在一些实施例中，分别将所述重组贻贝粘蛋白和聚乙二醇活性酯溶解于生理盐水，然后等体积均匀混合。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的组织粘合剂通过选择重组贻贝粘蛋白和聚乙二醇活性酯组合，解决了天然贻贝粘蛋白成本高的问题，另外配合聚乙二醇活性酯，通过优化组分，得到的组织粘合剂，粘合速度快且粘结强度高，而且具备良好的细胞相容性，生物安全性，可快速促进伤口愈合。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关实施例对本发明进行更全面的描述。实施例中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例和对比例中所用的重组贻贝粘蛋白为厚壳贻贝Mytilus coruscus的Mcfp-5成熟肽两端融合紫贻贝Mytilus edulis的Mefp-1肽段，得到的重组贻贝粘蛋白rMfp151；通过工程工程大肠杆菌发酵得到，购买自广州暨南大学医药生物技术研究开发中心有限公司。具体可以参考专利文件CN 116693692 A公开的方法制备。

其他所用试剂，如非特别说明，均为市售可得；以下实施例所用方法，如无特别说明，均为常规方法可实现。

各实施例和对比例的配方组分如表1所示。

表1各实施例及对比例配方组分

实施例1

(1)将400mg重组贻贝粘蛋白溶解在1mL生理盐水中；将200mg分子量为5000的四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯溶解在1mL生理盐水中。

(2)将步骤(1)中溶解的重组贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯溶液等体积均匀混合，在1分钟内迅速涂抹于需要粘合的位置，施加1-2N的压力，待粘合剂固化完成后撤去压力，完成组织粘合。

实施例2

(1)将400mg重组贻贝粘蛋白溶解在1mL生理盐水中；将200mg分子量为5000的四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯溶解在1mL生理盐水中。

(2)将步骤(1)中溶解的重组贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯溶液等体积均匀混合，在1分钟内迅速涂抹于需要粘合的位置，施加1-2N的压力，待粘合剂固化完成后撤去压力，完成组织粘合。

实施例3

(1)将400mg重组贻贝粘蛋白溶解在1mL生理盐水中；将200mg分子量为10000的四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯溶解在1mL生理盐水中。

(2)将步骤(1)中溶解的重组贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯溶液等体积均匀混合，在1分钟内迅速涂抹于需要粘合的位置，施加1-2N的压力，待粘合剂固化完成后撤去压力，完成组织粘合。

实施例4

(1)将400mg重组贻贝粘蛋白溶解在1mL生理盐水中；将200mg分子量为10000的四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯溶解在1mL生理盐水中。

(2)将步骤(1)中溶解的重组贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯溶液等体积均匀混合，在1分钟内迅速涂抹于需要粘合的位置，施加1-2N的压力，待粘合剂固化完成后撤去压力，完成组织粘合。

对比例1

(1)将200mg重组贻贝粘蛋白溶解在1mL生理盐水中；将100mg分子量为5000的四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯溶解在1mL生理盐水中。

(2)将步骤(1)中溶解的重组贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯溶液等体积均匀混合，在1分钟内迅速涂抹于需要粘合的位置，施加1-2N的压力，待粘合剂固化完成后撤去压力，完成组织粘合。

对比例2

(1)将200mg重组贻贝粘蛋白溶解在1mL生理盐水中；将100mg分子量为5000的四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯溶解在1mL生理盐水中。

(2)将步骤(1)中溶解的重组贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯溶液等体积均匀混合，在1分钟内迅速涂抹于需要粘合的位置，施加1-2N的压力，待粘合剂固化完成后撤去压力，完成组织粘合。

对比例3：

(1)将200mg重组贻贝粘蛋白溶解在1mL生理盐水中；将100mg分子量为10000的四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯溶解在1mL生理盐水中。

(2)将步骤(1)中溶解的重组贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯溶液等体积均匀混合，在1分钟内迅速涂抹于需要粘合的位置，施加1-2N的压力，待粘合剂固化完成后撤去压力，完成组织粘合。

对比例4

(1)将200mg重组贻贝粘蛋白溶解在1mL生理盐水中；将100mg分子量为10000的四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯溶解在1mL生理盐水中。

(2)将步骤(1)中溶解的重组贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯溶液等体积均匀混合，在1分钟内迅速涂抹于需要粘合的位置，施加1-2N的压力，待粘合剂固化完成后撤去压力，完成组织粘合。

对比例5

(1)将400mg重组胶原蛋白溶解在1mL生理盐水中；将200mg分子量为5000的四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯溶解在1mL生理盐水中。

(2)将步骤(1)中溶解的重组贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯等体积均匀混合，在1分钟内迅速涂抹于需要粘合的位置，施加1-2N的压力，待粘合剂固化完成后撤去压力，完成组织粘合。

对比例6

(1)将400mg重组纤连蛋白溶解在1mL生理盐水中；将200mg分子量为5000的四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯溶解在1mL生理盐水中。

(2)将步骤(1)中溶解的重组贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯等体积均匀混合，在1分钟内迅速涂抹于需要粘合的位置，施加1-2N的压力，待粘合剂固化完成后撤去压力，完成组织粘合。

对比例7

(1)将400mg白蛋白溶解在1mL生理盐水中；将200mg分子量为5000的四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯溶解在1mL生理盐水中。

(2)将步骤(1)中溶解的重组贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯等体积均匀混合，在1分钟内迅速涂抹于需要粘合的位置，施加1-2N的压力，待粘合剂固化完成后撤去压力，完成组织粘合。

性能测试

1、凝胶时间表征

测试方法：依照实施例和对比例中的的比例分别溶解贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇活性酯，等体积混合后迅速滴加在旋转流变仪载物台上，随后用旋转流变仪以固定频率测量水凝胶的模量随时间变化曲线，以储能模量G’和损耗模量G”的交点定义为凝胶点，相应的时间记录为凝胶时间。结果如表2所示。

表2凝胶时间

结果表明，随着贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇活性酯的质量浓度增加，实施例1-4的凝胶时间明显短于对比例1-4，这是由于活性基团的数量增加，加快了凝胶过程。实施例1和对比例5的结果说明与相同质量浓度的四臂聚乙二醇活性酯反应时，凝胶时间差别不大。但不用分子量的四臂聚乙二醇活性酯，分子量在10000时的凝胶时间要明显要短于分子量为5000的凝胶时间。

2、搭接-剪切拉伸承载强度

测试方法：依照《YY/T 0729.2-2009组织粘合剂粘接性能试验方法第1部分：搭接-剪切拉伸承载强度》进行。具体操作如下：

依照实施方式中的比例分别溶解贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇活性酯，等体积混合后涂抹于依照《YY/T 0729.2-2009组织粘合剂粘接性能试验方法第1部分》中规定的尺寸裁剪的新鲜猪皮上，随后以1～2N的力对粘接部分进行压迫，直至固化完成。随后将试样条置于试验机的夹具内，使受力方向为试样的长轴方向。使十字头以5mm/min的速度对试样加载至破坏。记录破坏时的载荷。结果如表3所示。

表3搭接-剪切拉伸承载强度

实施例1-4中，由于活性基团更多，与组织间的粘结强度更高。由于重组贻贝粘蛋白的作用，实施例1-4的搭接-剪切拉伸承载强度比对比例5-7的更高，而且加入四臂聚乙二醇活性酯可以起到协同提高强度的作用。

3、体外细胞毒性试验

测试方法：依照《GB/T 16886.5-2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》进行。具体操作如下：

依照实施方式中的比例分别溶解贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇活性酯，等体积混合后待完全凝胶，随后依照《GB/T 16886.5-2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》规定的浸提方法对水凝胶浸提24小时，收集浸提液。以小鼠成纤维细胞系L929为试验对象，将其接种于96孔板，贴壁后换用浸提液培养24小时，随后利用CCK-8法测量吸光度，计算细胞存活率。以正常培养的L929细胞作为空白对照，存活率下降到<空白的70％，则具有潜在的细胞毒性。结果如表4所示。

表4潜在细胞毒性

所有的实施例和对比例均不存在细胞毒性，证明本发明制备的基于重组贻贝粘蛋白的组织粘合剂具备良好的细胞相容性。

4、刺激与皮肤致敏试验

测试方法：依照GB/T 16886.10-2017医疗器械生物学评价第10部分：刺激与皮肤致敏实验进行。具体操作如下：

将健康新西兰兔在试验4小时前在动物背部脊柱两侧除去10×15cm的被毛，用作试验和观察部位。依照实施方式中的比例分别溶解贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇活性酯，等体积混合后涂抹于2.5×2.5cm的试验区域，待完全凝胶。接触4小时后，用湿润的纱布小心去除凝胶，在除去凝胶后1、24、48和72小时记录各接触部位情况，依照皮肤反应记分系统对刺激进行记分。结果如表5所示。

表5皮肤反应记分和兔原发性刺激指数类型

所有的实施例和对比例均不存在皮肤致敏反应，生物安全性好。

5、皮肤损伤愈合实验

测试方法：将健康SD大鼠在试验4小时前在动物背部脊柱两侧除去4×6cm的被毛，用作试验和观察部位。用聚维酮碘对试验部位进行消毒后，用手术刀片对皮肤全层造成长度2厘米的损伤。依照实施方式中的比例分别溶解贻贝粘蛋白和四臂聚乙二醇活性酯，等体积混合后涂抹于损伤中部和周围2.5×0.5cm的试验区域，待完全凝胶。记录创面愈合时间。结果如表6所示。

表6创面愈合时间

实施例1-4和对比例5-7的结果表明，重组贻贝粘蛋白能够更快地促进伤口愈合，在相同的蛋白质量浓度下，相比于重组胶原蛋白、白蛋白、重组纤连蛋白等，创面愈合时间由12天或10天，缩短到7天，效果显著。另外实施例1-4和对比例1-4的结果也表明，重组贻贝粘蛋白含量越高，促进作用越明显。

综上，可以看出本发明实施例的组织粘合剂的各项性能指标相对于对比例的其他比例或重组蛋白类型，均有改善，尤其是实施例3和4，特别是实施例3各方面性能均有显著改善，凝胶时间在90-120s内，强度0.25MP，细胞相容性良好，无毒无过敏，而且创面愈合时间缩短到7天。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。