一种特异性引物对及其在球托霉菌鉴定中的应用

技术领域

本发明属于微生物鉴定技术领域，具体涉及一种特异性引物对及其在球托霉菌鉴定中的应用。

背景技术

球托霉菌属(Gongronella)真菌，分类于小克银汉霉科(Cunninghamellaceae)，包括Gongronella butleri等。该属真菌一般在20-30℃下生长较为迅速，主要分布在温带及亚热带地区。它能够与猕猴桃、番茄等喜温农作物建立共生关系，长期稳定地定殖在农作物根际，通过分泌碱性磷酸酶及调节农作物根际微生物群落组成等方式高效活化土壤养分、帮助农作物拮抗病原真菌如尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)等促生机制，促进农作物生长；在农业科技领域，因Gongronella对土壤中有效氮和有效磷较敏感，常被用于测定土壤中氮或磷的储存量；此外，它能够利用玉米秸秆、玉米芯及麦麸等农林废弃物快速制备，成本低廉，实现了农林废弃物的资源再利用；同时在生物修复及工业应用等领域也有着广泛的应用。因此，将Gongronella开发成真菌肥料符合我国农业绿色发展的需要，具有巨大的生态效益、社会效益和经济效益。

建立一种快速鉴定球托霉菌的方法，将有利于迅速评估土壤肥力。球托霉菌的分离及鉴定主要依赖稀释涂布法结合管家基因测序的方法。但该方法耗时长，工作量大且不易获得目的菌株，这使得球托霉菌属的鉴定具有一定的偶然性和随机性。随着分子生物学的快速发展，基于序列测序的方法已经被广泛用于鉴定目的菌株。通过对目的菌株进行DNA提取，使用真菌通用引物扩增目的片段，然后对其测序得到的目的片段进行鉴定，但该方法特异性不强，特别是含有相似真菌属的混合DNA样本，目前尚无引物从混合DNA样本中直接扩增出球托霉菌属的18S rDNA部分序列，给土壤中球托霉菌的检测研究带来了困难。

公布号为CN108148768A的中国专利申请文献，公开了一株球托霉菌菌株及其应用，属于微生物应用技术领域。该菌株为球托霉菌w5菌株，保藏编号为CCTCC：M2017787。该专利将球托霉菌w5孢子配成菌剂，在植物种子萌发并长出2对真叶后，对植物进行根系浇灌，所制得的球托霉菌菌剂可以有效促进植物幼苗的生长，提高作物的抗病能力，在农业生产过程中具有应用潜力。但该专利并没有提及如何快速准确的鉴定球托霉菌。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于如何解决现有技术中鉴定球托霉菌操作繁琐、耗时长、准确性差的问题。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

一种特异性引物对，其由序列为5′-GGGGTGCTTTACGGCACTC-3′的正向引物和序列为5′-AGCCCCGAAAGACTGCACC-3′的反向引物组成。

SEQ ID No:1：5′-GGGGTGCTTTACGGCACTC-3′；

SEQ ID No:2：5′-AGCCCCGAAAGACTGCACC-3′。

说明：将上述正向引物命名为18s9F，反向引物命名为18s9R。

有益效果：本发明通过提出一种特异性的引物对，将其应用于球托霉菌鉴定中，可从混合DNA品中准确的扩增出球托霉菌的目的序列片段，减少了鉴定步骤、缩短了鉴定时间、提高了鉴定的准确性。

本发明还提供一种上述特异性引物对在球托霉菌鉴定中的应用。

本发明的优点在于：

(1)本发明通过提出一种特异性的引物对，将其应用于球托霉菌鉴定中，可从混合DNA品中准确的扩增出球托霉菌的目的序列片段，减少了鉴定步骤、缩短了鉴定时间、提高了鉴定的准确性。

(2)本发明用于扩增球托霉菌的特异性引物可用来解决目前缺乏引物从混合DNA样品中直接扩增出具有球托霉菌属(Gongronella)遗传特性的18S rDNA部分序列的问题。

(3)本发明以特异性引物5′-GGGGTGCTTTACGGCACTC-3′作为正向引物，与5′-AGCCCCGAAAGACTGCACC-3′为反向引物配对使用，即可从各类样品DNA中直接扩增出长度约为547bp的球托霉菌目的片段。

附图说明

图1为实施例1中18s9F/18s9R引物特异性干法验证图；

图2为实施例2中18s9F/18s9R引物对Gongronella sp.w5、Mucor circinelloides等8种属真菌DNA扩增产物的凝胶电泳图；

图3为实施例2中18s9F/18s9R引物对Ganoderma lucidum 77002等5种属真菌DNA扩增产物的凝胶电泳图；

图4为实施例2中18s9F/18s9R引物对Gongronella butleri等2种属真菌DNA扩增产物的凝胶电泳图；

图5为实施例3中18s9F/18s9R引物对混合真菌DNA扩增产物的凝胶电泳图；

图6为实施例4中18s9F/18s9R引物对土壤样品DNA扩增产物的凝胶电泳图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

在Genbank数据库中分别下载Gongronella 18S rDNA、Cunninghamellaceae18SrDNA、Mucoromycotina 18S rDNA与Other 18S rDNA(真菌系统发育树上主要分支)，将Gongronella 18S rDNA分别与Cunninghamellaceae 18S rDNA、Mucoromycotina 18SrDNA、Other 18S rDNA(真菌系统发育树上主要分支)进行序列比对，比对结果发现两个在Gongronella中相对保守但在其他真菌中相对可变的两段序列。两段序列分别是相对可变区1(GGGGTGCTTTACGGCACTC)和相对可变区2(GGTGCAGTCTTTCGGGGCTGATGATCTCT)，根据相对可变区1和相对可变区2设计Gongronella种属特异性引物18s9F/18s9R。

将本实施方式设计出的引物18s9F/18s9R使用SILVA SSU r138 RefNR数据库对其进行特异性干法验证，结果如图1所示，所有匹配真菌均属于Gongronella。从图1中可以看出本实施方法用于扩增球托霉菌的特异性引物18s9F/18s9R是能够准确匹配出球托霉菌的。

实施例2：

分别以Gongronella butleri、Gongronella sp.w5、Absidia glauca、Ganodermalucidum77002、Trametes hirsuta AH28-2、Coprinopsis cinerea FA2222、Fusariumgraminearum、Fusarium solani、Mucor circinelloides、Absidia repens、Phycomycesblakesleeanus、Rhizopussp.、Absidia corymbifera、Rhizopus corymbifera、Syncephalastrum sp.15个属真菌DNA为模板进行引物18s9F/18s9R的特异性验证试验。

PCR扩增体系为：1μL上述真菌DNA模板(约30ng)、2μL正向引物18s9F(0.3nM)、2μL反向引物18s9R(0.3nM)、25μL 2×Easy Taq，灭菌双蒸水补足至50μL。

PCR扩增反应条件为：预变性98℃，2min，变性98℃，10s，退火60℃，15s，延伸72℃，36s，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

将本实施例扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2-4所示，图2-4中Trans2k Plus II DNA Marker目的条带为500bp，ck为不含DNA空白对照的扩增结果。从图2-4中可以看出本实施方式用于扩增球托霉菌的特异性引物18s9F/18s9R能够准确的扩增出球托霉菌的目的序列片段，而未能从其他真菌DNA和空白对照中扩增出DNA片段。

实施例3：

将Gongronella butleri、Gongronella sp.w5、Absidia glauca、Ganodermalucidum77002、Trametes hirsuta AH28-2、Coprinopsis cinerea FA2222、Fusariumgraminearum、Fusarium solani、Mucor circinelloides、Absidia repens、Phycomycesblakesleeanus、Rhizopus sp.、Absidia corymbifera、Rhizopus corymbifera、Syncephalastrum sp.15个属真菌DNA进行等比例混合，以混合后的真菌DNA为模板进行引物18s9F/18s9R的特异性验证试验。

PCR扩增体系为：1μL上述真菌DNA模板(约30ng)、2μL正向引物18s9F(0.3nM)、2μL反向引物18s9R(0.3nM)、25μL 2×Easy Taq，灭菌双蒸水补足至50μL。

PCR扩增反应条件为：预变性98℃，2min，变性98℃，10s，退火60℃，15s，延伸72℃，36s，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

将本实施例扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示，图5中Trans2k Plus II DNA Marker目的条带为500bp，1号泳道为不含球托霉菌的真菌混合DNA的扩增结果，2号泳道为含有球托霉菌(Gongronella butleri和Gongronella sp.w5)的真菌混合DNA的扩增结果，3号泳道为含有球托霉菌(Gongronella butleri)的真菌混合DNA的扩增结果，4号泳道为含有球托霉菌(Gongronella sp.w5)的真菌混合DNA的扩增结果，ck为不含DNA空白对照的扩增结果。从图5中可以看出本实施方式用于扩增球托霉菌的特异性引物18s9F/18s9R能够准确的扩增出球托霉菌的目的序列片段，而未能从其他真菌DNA和空白对照中扩增出DNA片段。

实施例4：

以Gongronella sp.w5为例，在12份相同土壤中分别浇灌0个孢子/cm

PCR扩增体系为：1μL DNA模板(约30ng)、2μL正向引物18s9F(0.3nM)、2μL反向引物18s9R(0.3nM)、25μL 2×Easy Taq，灭菌双蒸水补足至50μL。

PCR扩增反应条件为：预变性98℃，2min，变性98℃，10s，退火60℃，15s，延伸72℃，36s，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图6所示，图6中Trans2k Plus II DNA Marker目的条带为500bp，ck为不含DNA空白对照的扩增结果。从图6中可以看出本实施方式用于扩增球托霉菌的特异性引物18s9F/18s9R能够准确的从所有土壤样品DNA中扩增出球托霉菌的目的序列片段。

随机挑选每立方厘米土壤中浇灌80个孢子以及750个孢子对应泳道获得的DNA片段为模板，按照上述PCR扩增体系和扩增反应条件进行第二轮球托霉菌的目的序列片段扩增，纯化产物后测序，测序结果为：序列长度约为547bp，并且经blast分析，为球托霉菌(Gongronella)的特异序列(参见SEQ ID No:3)。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。