温度响应型双光子MOF基荧光探针及其制备方法与应用

技术领域：

本发明涉及荧光探针技术领域，具体涉及一种温度响应型双光子MOF基荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术：

癌症是正常细胞在各种致癌因子的作用下，细胞增长和增殖的调控发生严重紊乱而形成的局部肿块。目前的临床治疗方式以放疗、化疗以及手术切除为主，不可避免地会造成正常组织损伤、破坏自身免疫系统并且具有较高的复发率。因此，探索新型的癌症治疗方式迫在眉睫。

随着科学技术的发展，光热治疗(photothermal therapy，PTT)作为一种新型的肿瘤光疗手段引起了广泛的关注。光热治疗是利用光、射线、微波等作为发热源，辐照光热试剂(Photothermal Agents，PTAs)，PTAs吸收能量后通过热量的转变方式使组织局部升温，对耐热性差的细胞产生杀伤作用而达到治疗的作用。与放疗和化疗等传统癌症治疗相比，光热治疗具有侵入性更小、特异性更强的优点。但在该过程中可能会出现过高或过低的温度，对周围正常组织造成热损伤或无法完全消除肿瘤细胞。因此，如何在原位确定光热温度以完全消除肿瘤而不对周围正常组织造成热损伤是实现最有效PTT的关键问题之一。荧光测温法是一种无创、快速响应、高灵敏度的测量细胞内温度的方法，但其进一步临床应用仍然面临着细胞毒性、光漂白和紫外光激发的细胞内自体荧光干扰等问题。因此，需要进一步研究和改进荧光测温法来克服这些挑战，以实现其在临床上的应用。

在光热治疗中，外加激光需要穿透层层组织后才能到达目标靶点，因此光与组织之间的相互作用对其疗效具有很大影响。光在穿过组织的过程中会发生光的反射、光的散射和光的吸收，这些相互作用取决于组织的光学特性和光的波长。与紫外光和可见光相比，近红外(Near-Infrared，NIR)区域被称为生物窗口，其在组织中的穿透能力更强，吸收/散射较少，穿透深度更深，是最适合用于PTT的光频率。因此，设计具有近红外区光激发荧光特性的荧光温度传感器是实现高效PTT的有利选择。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种温度响应型双光子MOF基荧光探针的制备方法，以MOF-199作为纳米载体，同时装载光热剂金纳米棒(Au NRs)和温度响应型吡啶盐分子(B)，实现实时温度引导下的无创治疗。其中，MOF-199可在酸性肿瘤微环境中降解，释放出的铜离子能够与过表达的H

本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：

本发明的目的之一是提供一种温度响应型双光子MOF基荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)吡啶盐分子的制备：

a、将4-甲基吡啶、碘甲烷与六氟磷酸银反应，得到中间体；

b、将中间体与4-(N,N-二乙基)氨基苯甲醛反应，得到吡啶盐分子；

(2)Au NRs的制备：

a、将溶解于水中的四氯金酸、还原剂和表面活性剂搅拌混合，得到种子溶液；

b、将溶解于水中的四氯金酸、硝酸银、表面活性剂和抗坏血酸搅拌混合，得到生长液；

c、向生长液中加入种子溶液，静置反应，得到Au NRs；

(3)荧光探针的制备：

将MOF-199与吡啶盐分子搅拌混合，然后加入Au NRs，继续搅拌，最后加入保护剂，得到荧光探针。

优选地，所述4-甲基吡啶、碘甲烷、六氟磷酸银的摩尔比为1:(1～1.5):0.4。

优选地，所述中间体与4-(N,N-二乙基)氨基苯甲醛的摩尔比为1:1。

优选地，所述四氯金酸(HAuCl

优选地，所述四氯金酸与硝酸银、表面活性剂、抗坏血酸的摩尔比为0.01:0.096:200:1.87。

优选地，所述还原剂为硼氢化钠(NaBH

优选地，所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基二甲基苄基氯化铵(DDBAC)、十二烷基三甲基氯化铵(DTAC)中的至少一种。

优选地，所述MOF-199、吡啶盐分子、Au NRs、保护剂的质量比为1:1:(0.004-0.01):3。

优选地，所述保护剂为有机相变材料。保护剂的作用是防止室温下配体(吡啶盐分子)泄露。进一步优选地，所述有机相变材料为石蜡、脂肪酸、脂肪酸酯、醇类化合物中的至少一种。进一步优选地，所述醇类化合物为十二醇、十四醇、十六醇、十八醇、聚乙二醇中的至少一种。

优选地，所述MOF-199是由摩尔比为3:2的硝酸铜和苯-1,3,5-三羧酸盐(BTC)合成得到。

本发明的目的之二是提供一种根据所述制备方法制备得到的温度响应型双光子MOF基荧光探针。

本发明所述温度响应型双光子MOF基荧光探针的尺寸为200nm左右，可以通过增强的渗透和保留效应聚集在肿瘤部位，为肿瘤治疗奠定物质基础。

本发明的目的之三是提供所述温度响应型双光子MOF基荧光探针在制备近红外激发温度响应型肿瘤治疗药物中的应用。

本发明的目的之四是提供所述温度响应型双光子MOF基荧光探针在制备肿瘤光热-化学联合治疗试剂中的应用。

本发明所述温度响应型双光子MOF基荧光探针的工作原理：

首先，本发明所述温度响应型双光子MOF基荧光探针在近红外区激光照射下，可将光能转化为热能实现诱导肿瘤细胞死亡能力，并且在近红外区激光照射下其荧光强度与体系温度具体良好的线性关系，能够实现光热治疗过程中的温度监测。

其次，本发明所述温度响应型双光子MOF基荧光探针在肿瘤酸性微环境中解离产生的Cu

再者，光热治疗过程中的温度升高能够加速类芬顿反应的进行，从而实现光热治疗与化学动力学治疗协同作用，更高效地诱导肿瘤细胞死亡。

本发明的有益效果是：本发明提供的荧光探针制备方法具有原料易得、成本低、易于操作的特点，并且制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针具有较好的生物相容性和较低的暗毒性，能够实现光热-化学联合治疗，从而更高效地诱导肿瘤细胞死亡。

附图说明：

图1为本发明实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针的扫描电子显微镜图(SEM)和透射电子显微镜图(TEM)；

图2为本发明实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针在不同激发波长下的双光子激发荧光光谱图；

图3为本发明实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针在900nm激光激发时不同温度下的双光子激发荧光光谱图(a)以及温度与荧光强度的线型关系图(b)；

图4为本发明实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针在不同浓度(a)、不同激发功率(b)和冷却阶段-ln(θ)与时间的线性关系图(c)；

图5为本发明利用亚甲基蓝检测实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针分解H

图6为本发明实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针在513nm和900nm激光照射下不同时间(0s，30s，60s)的共聚焦显微成像图(a)以及根据荧光强度和温度变化线性关系计算的温度(b)；

图7为本发明利用MTT法测定不同条件下的细胞存活率。

具体实施方式：

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和图示，进一步阐述本发明。

实施例1

温度响应型双光子MOF基荧光探针的制备：

1、吡啶盐分子的合成

a、称取4-甲基吡啶(9.3g，0.1mol)和碘甲烷(21.6g，0.15mol)于室温下在甲苯中搅拌4h，然后回流反应30min，过滤，乙醚洗涤，得到黄色固体。向黄色固体中加入六氟磷酸银(25.3g，0.1mol)，回流反应30min，过滤，收集滤液，浓缩，得到中间体。

b、量取10mL无水乙醇加入50mL圆底烧瓶中，称取中间体(0.59g，5mmol)和4-(N,N-二乙基)氨基苯甲醛(0.89g，5mmol)，加入数滴哌啶，80℃下回流搅拌10h，得到红色溶液，利用乙醇重结晶，真空干燥，得到吡啶盐分子。

2、MOF-199的制备

将硝酸铜水溶液(0.9mL，0.1M)、十六烷基三甲基溴化铵水溶液(9.6mL，0.1M)、BTC三乙胺盐水溶液(0.6mL，0.1M)加入到15mL乙醇和15mL去离子水的混合溶液中，剧烈搅拌10min，离心，乙醇洗涤，冷冻干燥，得到MOF-199。

3、Au NRs的制备

a、种子溶液的制备：向CTAB水溶液(10.0mL，0.10M)中加入HAuCl

b、生长液的制备：向CTAB水溶液(50mL，0.1M)中加入AgNO

4、温度响应型双光子MOF基荧光探针的制备

称取5mg MOF-199和5mg吡啶盐分子加入到5mL去离子水中，室温下搅拌6h，再加入5mL Au NRs分散液，继续搅拌6h，然后加入15mg十四醇，继续搅拌3h，离心，甲醇洗涤，真空干燥，得到温度响应型双光子MOF基荧光探针。

采用扫描电子显微镜和透射电子显微镜对实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针进行形貌表征，如图1所示。从图1可以看出，实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针的尺寸约为200nm。

在不同激发波长下对实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针进行双光子激发荧光表征，如图2所示。从图2可以看出，实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针具有优异的双光子吸收性能。

在不同温度下对实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针进行双光子激发荧光表征，如图3所示。从图3可以看出，实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针的双光子激发荧光强度随着温度的升高逐渐降低，具有良好的线性关系。

实施例2

体外光热转换效率的检测：

将不同浓度(0、50、100和150μg/mL)的实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针加入到2mL的超纯水中，分别置于900nm激光(1W/cm

从图4可以看出，在900nm激光照射下，探针浓度为150μg/mL时，当激光密度为1.2W/cm

实施例3

通过Cu

配制包含10μg/mL亚甲基蓝、100μM过氧化氢和150μg/mL实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针的溶液，用665nm处吸光度变化监测体系中产生的·OH诱导MB降解速率，结果见图5。

从图5可以看出，实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针在900nm激光照射下，可以实现高效的Cu

实施例4

细胞内温度监测能力

分别用513nm和900nm激光照射实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针孵育的Hep G2细胞，每隔30s获取一次荧光结果，通过荧光强度变化以及荧光强度与温度的线性关系来监测细胞内温度，结果见图6。

从图6可以看出，实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针能够作为温度探针进行细胞内温度的实时监测。

实施例5

诱导细胞死亡能力

采用溴化甲基噻唑蓝四氮唑(MTT)法研究实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针诱导细胞死亡能力。实验前，在96孔板中培养Hep G2细胞，然后将细胞培养基与不同浓度的温度响应型双光子MOF基荧光探针(0、50、100、150、200、250μg/mL)混合孵育8h，然后用激光(900nm，1W/cm

从图7可以看出，在黑暗条件下，细胞的存活率在90％以上，说明实施例1制备的温度响应型双光子MOF基荧光探针具有较低的毒性；而在激光处理下，细胞存活率明显降低，说明激光诱导光热过程能够有效诱导细胞死亡。此外，在加入H

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。