17型人源化胶原蛋白及其蛋白支架、填充材料及应用

技术领域

本发明涉及17型人源化胶原蛋白技术领域，具体涉及17型人源化胶原蛋白及其蛋白支架、填充材料及应用。

背景技术

XVII型胶原蛋白（COL17，17型胶原蛋白），又称HemidesmosomesFraction4（HD4），是一种含有1497个氨基酸的跨膜蛋白，其N端位于细胞质中，C端位于细胞外基质中。COL17在细胞外基质中有15个胶原结构域，并且表位在紧密排列的非胶原第16A（NC16A）结构域内紧密排列。以两种形式存在：一种是由180kDa的COL17A1链的同源三聚体跨膜分子，另一种是3个120kDa的多肽不溶性胞外域通过弗林蛋白酶介导的蛋白水解可以从细胞表面脱落。与其他跨膜胶原家族成员类似，COL17的胞外域可以被解联蛋白和金属蛋白酶从细胞表面裂解，有趣的是，胞外域脱落发生在含有BPautoAb的主要表位的NC16A结构域内。COL17的NC16a结构域含有血球样表位的免疫优势表位。目前已经克隆了整个人类COL17基因，并阐明了其内含子—外显子组织，该基因包含56个不同的外显子，是一种在10号染色体的长臂上间隔约52kb的基因组。它编码多肽α1（XVII）链，有胞内球状结构域，跨膜片段和细胞外含有15个独立的胶原亚结构域，其中最大的由242个氨基酸组成。

研究表明，将COL17导入表皮可以帮助组织保持更年轻的状态，并且该现象及规律也适用于老年动物。这些发现可以帮助研究者更好地认识表皮细胞的分裂能力及其在哺乳动物不同阶段的调节机制，现已确定COL17是控制小鼠和人类皮肤中表皮细胞分裂的关键分子。可见，COL17具有十分重要的开发价值。

发明内容

为此，本发明提供了17型人源化胶原蛋白及其蛋白支架、填充材料及应用。

本发明目的之一提供一种重组表达17人源化胶原蛋白的表达载体，其携带有如SEQ ID NO.1所示的目的基因。

具体的，该表达载体为重组质粒pPIC9K-COL17，所述目的基因插入至 pPIC9K的多克隆位点并形成AOX1启动子、α信号肽基因、目的基因和AOX1终止子的表达单元。

本发明的目的之一提供一种重组表达17人源化胶原蛋白的表达载体的构建方法，其包括：将 pPIC9K 及 PCR 扩增产物片段 COL3-17，使用Hi Fi DNA Assembly CloningKit 试剂盒将酶切产物与PCR 扩增产物连接，将连接产物转化至大肠杆菌Match1 T1 感受态细胞内，在含有氨苄青霉素（100 μg/mL）的 LB 固体平板上生长，挑取单克隆，pPIC9K 通用引物 PCR 鉴定是否含有目的基因，从单克隆菌株中提取表达载体。

本发明的目的之一提供一种重组17人源化胶原蛋白工程菌株，其为转入了所述表达载体的毕赤酵母。

本发明的目的之一提供一种重组17人源化胶原蛋白工程菌株的构建方法，其包括：将所述表达载体 pPIC9K-COL17使用限制性内切酶

本发明的目的之一提供一种重组17人源化胶原蛋白的制备方法，其包括：制备上述的表达载体；根据所述表达载体制备上述的基因工程菌株；将所述基因工程菌株接种至YPD培养基中并补充甲醇至0.5%诱导发酵；收获发酵上清液，经亲和层析收获目的蛋白。

本发明的目的之一提供一种三维大孔蛋白支架的构建方法，其包括：将50目石蜡微球加入模具中，移入预热的烘箱中在50℃加热60min后室温冷却；用蒸馏水将所述17型人源胶原蛋白配制成10%的溶液；用蒸馏水将丝素蛋白分别配制成10%溶液；用蒸馏水将纳米级羟基磷灰石粉末制成10%的匀浆溶液；将上述3种液体按照等体积混合，在超声振荡器中混匀后加到模具中，真空抽吸后移入-80℃冰箱4h，在无水乙醇中浸泡2h使蛋白结晶，以正己烷提取石蜡微球后剩余的即为三维大孔支架。

本发明的目的之一提供一种采用上述制备方法制得的蛋白支架。

本发明的目的之一提供一种采用上述制备方法制得的填充材料。

本发明的目的之一提供上述重组17人源化胶原蛋白在医用填充材料中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果之一：

本发明首次利于17人源化胶原蛋白的目的基因进行体外重组表达，构建了重组表达载体和基因工程菌株。该基因工程菌株在甲醇诱导下能够于胞外高效表达17型人源化胶原蛋白，便于大规模收获和制备该种重组17型人源化胶原蛋白。

本发明首次利于该重组17型人源化胶原蛋白制备成了一种三维大孔支架。该三维大孔支架内部具有均匀排列的大孔结构，连通性好。并且该三维大孔支架具有良好的机械性能，在40℃放置4个月后仍然具有优良的弹性性能，是一种十分优良的填充材料。

本发明利于该重组17型人源化胶原蛋白制备成的三维大孔支架进行体外培养兔脂肪干细胞和兔耳软骨细胞，发现其无细胞毒性，具有良好的生物相容性。并且将体外培养的兔耳软骨细胞与支架复合物移植至裸鼠皮下后，于体内逐渐形成更加成熟的再生软骨组织，再次说明了该三维大孔支架具有作为体内填充材料的应用前景。

附图说明

图1为质粒pUC57-COL17的PCR扩增产物（泳道1）和酵母菌株GS115/pPIC9K-COL17PCR验证（泳道2）的凝胶电泳图。

图2为表达载体pPIC9K-COL17的BglⅡ、BamHⅠ酶切产物的凝胶电泳图。

图3为重组17型胶原蛋白镍柱纯化的SDS-PAGE结果图；M：#26616 蛋白 Marker；1：发酵上清；2：穿过峰；3：使用 10% Buffer B 洗脱之后回收洗脱下来的溶液，含有目的蛋白。

图4为三维大孔蛋白支架的微观图。

图5为实验组和对照组分别提供的三维大孔蛋白支架于4℃和40℃放置4个月弹性模量再循环压缩试验结果图。

图6为实验组（A）和对照组（B）分别提供的三维大孔蛋白支架的再生软骨组织H-E染色图。

图7为实验组（A）和对照组（B）分别提供的三维大孔蛋白支架的再生软骨组织番红O（safranin-O）染色图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

实施例1 人源17型胶原蛋白在毕赤酵母中的重组表达及鉴定

1、材料与方法

（1）菌株与质粒

菌株毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115，美国 Invitrogen 公司；大肠杆菌（Escherichia coli）Match1 T1，美国Invitrogen 公司；质粒pPIC9K，美国Invitrogen 公司。pUC57质粒，V012363#，上海纽普生物。

（2）试剂

限制性核酸内切酶 BglⅡ、BamHⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ，美国 Thermo FisherScientific 公司；高保真 DNA 扩增酶 Prime STAR HS DNA Polymerase （premix）、T4连接酶，购于日本 TaKaRa 公司；HiFi DNA Assembly Cloning Kit 试剂盒，美国 NEB 公司；Dream Taq Green PCR Master Mix、DNA marker（200 bp Ladder、DL 5000 和 26616Protein Marker），美国Thermo Fisher Scientific 公司；质粒小提试剂盒、琼脂 糖凝胶回收试剂盒，Magen 公司。重组Anti-Collagen XVII抗体[EPR18614] ，ab184996，美国ABcam公司；His-tag 二抗，广州捷倍斯生物科技有限公司。牛血清白蛋白，北京索莱宝科技有限公司；核酸凝胶回收试剂盒，广州美基生物科技有限公司。

2、方法

（1）目的基因的表达框合成

NCBI 数据库中获得人源17型胶原蛋白α1链的编码胞内蛋白的基因CDS序列（GenBank: BC004478.2）作为表达片段（如SEQ ID NO.1所示），将全基因合成后序列送往南京金斯瑞生物科技有限公司，全基因合成后克隆至质粒pUC57，得到含有人源17型胶原蛋白编码基因的重组质粒pUC57-COL17。

（2）目的基因重组表达载体的构建

以合成的质粒 pUC57-COL17为模板，使用引物对（F:ATGGATGTAACCAAGAAAAACAAACGAG，如SEQ ID NO.2所示；R:TCGGGTGGATGGGGACGCACT，如SEQID NO.3所示）扩增目的基因片段，得到 DNA片段 COL-17。

以上反应均使用 Prime STAR HS DNA Polymerase（premix）的 50 μL 反应体系，反应条件：98 ℃ 5 min，98 ℃ 10 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，共 30 个循环；72 ℃ 10min。扩增完毕后，用琼脂糖凝胶电泳进行检测，并用广州美基生物科技有限公司的核酸凝胶回收试剂盒切胶回收。

（3）重组胶原蛋白单基因表达载体 pPIC9K-COL3-17的构建

将 pPIC9K 及 PCR 扩增产物片段 COL3-17，使用Hi Fi DNA Assembly CloningKit 试剂盒将酶切产物与PCR 扩增产物连接，将连接产物转化至大肠杆菌Match1 T1 感受态细胞内，在含有氨苄青霉素（100 μg/mL）的 LB 固体平板上生长，挑取单克隆，pPIC9K 通用引物 PCR 鉴定是否含有目的基因。挑选阳性转化子送生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定。

（4）重组胶原蛋白工程菌株的构建及诱导表达

重组质粒 pPIC9K-COL17用限制性内切酶

（5）重组17型胶原蛋白的诱导表达、鉴定

将重组胶原蛋白工程菌株接种到 10 mL YPD 培养基内，30 ℃ 250 r/min 培养16~20 h，在 OD600达到 10 左右时，接种至 BMGY 培养基使初始 OD600 为 0.2，30 ℃，250 r/min 培养 16 h~20 h；控制起始 OD600为 1，将菌体离心取上清，转移至50 mL的BMMY培养基30 ℃，250 r/min 培养，每隔24 h 取样，同时补充甲醇至0.5%，诱导发酵 120h。

亲和层析：将重组毕赤酵母的发酵液 6 000 r/min离心 10 min；得到上清液，将上清液通过 0.22 μm 的滤膜过滤，用镍柱（5 mL His-Trap，GE）亲和层析纯化，收集不同洗脱峰的洗脱液，通过 SDS-PAGE 电泳检测后，将相应蛋白洗脱液过夜透析，冷冻干燥备用。

通过 SDS-PAGE 电泳鉴定目的蛋白表达情况。电泳结束后，转膜至 PVDF 膜上，封闭液封闭 1 h，用 His-tag 抗体一抗 37 ℃孵育 1 h，二抗孵育 1 h，TBST 洗涤 3 次，ECL 显色，凝胶成像仪曝光。

2、结果

如图1所示，以质粒pUC57-COL17为模板，PCR扩增得到片段COL-17（462bp）。目的片段与载体按照摩尔比3:1用HiFiDNAAssemblyCloningKit进行无缝连接，构建表达载体pPIC9K-COL-17（单串联表达载体），经DNA测序验证无突变，成功构建重组质粒。将上述步骤得到的pPIC9K-COL17质粒使用BglⅡ、SalⅠ酶切，回收COL-17表达框。

如图2所示，使用BglⅡ、BamHⅠ酶切验证表达质粒，得到含有抗氨苄青霉素编码的骨架片段1、含有卡那霉素抗性编码的片段2及COL17的表达框片段。

将表达质粒使用SalⅠ内切酶线性化，使用电击法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，在MD平板上筛选阳性转化子，提取基因组DNA经过PCR凝胶电泳鉴定。

如图1所示，预期转入pPIC9K-COL17的酵母菌株会分别在0.46kb有特异性条带，与预期的目的片段大小一致，得到表达重组胶原蛋白单串联表达菌株GS115/pPIC9K-COL17。

将转化子在BMGY培养基培养1d之后，离心取沉淀，转移至BMMY培养基，使得菌体浓度达到原来的2.5倍，以达到模拟高密度发酵的目的。30℃、250r/min条件下发酵3d后，取发酵上清通过镍柱亲和层析，并将洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图3所示，泳道3是纯化之后的蛋白样品，条带大小为16ku左右，与理论一致。

实施例2 蛋白支架及填充材料的制备及性能分析

1、材料与仪器

Ⅰ型胶原酶、CCK8、转化生长因子β1（TGF-β1）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、纳米级羟基磷灰石（Sigma公司），50目石蜡微球（上海永华石蜡有限公司），兔脂肪干细胞（湖南欣瑞生物科技有限公司），成骨诱导液（包含10n/mL TGF-β1、100ng/mL IGF-1、50μg/mL抗坏血酸、40μg/mL L-脯氨酸、6.25μμg/mL 胰岛素、6.25μg/mL转铁蛋白、6.25ng/mL硒酸、100μg/mL丙酮酸钠、３００μg/mL L-谷氨酰胺、10%FBS和1%青霉素-链霉素混合溶液），兔Ⅰ型胶原ELISA试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司），链霉亲和素-生物素复合物免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），S-4800扫描电子显微镜（Hitachi公司），SkyScan1174micro CT（Bruker公司）。

2、方法

（1）三维大孔蛋白支架的构建

将50目石蜡微球加入模具中，表面给予合适的压力压平，移入预热的烘箱中在50℃加热60min后室温冷却。

用蒸馏水将上述实施例1纯化后的人源17型胶原蛋白配制成10%的溶液。

用蒸馏水将丝素蛋白分别配制成10%溶液。

用蒸馏水将纳米级羟基磷灰石粉末制成10%的匀浆溶液。

将上述3种液体按照等体积混合，在超声振荡器中混匀后加到模具中，真空抽吸后移入-80℃冰箱4h，在无水乙醇中浸泡2h使蛋白结晶，以正己烷提取石蜡微球后剩余的即为三维大孔支架。

作为对照：将10%的丝素蛋白溶液和纳米级羟基磷灰石溶液等体积于磨具中混合后，于无水乙醇汇总浸泡2h使蛋白结晶，以正己烷提取石蜡微球后剩余的即为三维大孔支架。

（2）三维大孔蛋白支架机械性能分析

取部分支架样本进行CT扫描，使用ImageJ软件从扫描图片中选择50个以上孔隙，观察支架结构并计算支架结构的平均孔径和支架孔隙率，支架孔隙率＝[1－（支架总体积－支架结构体积）／支架总体积］×100%。

将支架样本放入PBS中浸泡24h，置于MTF-100力学加载装置加力平台上，以0.5mm/min进行压缩测试，计算支架的弹性模量，弹性模量＝（截面的载荷／截面面积）／（支架压缩前后高度差值／支架原始高度。

在循环压缩试验中，试样被压缩到最大应变60%，并循环10次。每组测量3个平行样品。

（3）热稳定性评估

对干燥状态下的三维大孔蛋白支架分别于4℃和40℃放置4个月，再次检测样品的平均孔径、支架孔隙率和弹性模量。

3、结果

如图4所示，支架内部可见均匀排列的大孔结构，连通性好。实验组的支架孔径为348.2±43.6μm，孔隙率为79.4±5.2%，弹性模量为106.75±22.95kPa。对照组的支架孔径为168.5±29.4μm，孔隙率为73.9±4.8%，弹性模量为69.42±6.36kPa。

经4℃放置4个月后，实验组的支架孔径为359.9±46.4μm，孔隙率为82.6±3.9%，弹性模量为98.49±7.36kPa。对照组的支架孔径205.4±21.8μm，孔隙率为76.4±5.3%，弹性模量为64.36±6.2kPa。

经40℃放置4个月后，实验组的支架孔径为367.3±37.1μm，孔隙率为84.2±4.5%，弹性模量为96.67±5.21kPa。对照组的支架孔径232.1±24.3μm，孔隙率为86.4±5.3%，弹性模量为32.36±4.9kPa，其内部孔径和孔隙率变大，支架结构存在坍塌情况，并且弹性模量急剧下降，说明对照组的三维大孔蛋白支架的热稳定性较差。

如图5所示，实验组三维大孔蛋白支架无论在4℃和40℃放置4个月后，其弹性模量能得到较佳的恢复，而对照组在40℃放置4个月后其弹性模量降低较多。再次说明，实验组的三维大孔蛋白支架热稳定更佳。

实施例3：三维大孔蛋白支架作为填充材料的应用验证

1、主要实验试剂与仪器

脱氧核糖核酸酶（DNase）、核糖核酸酶（RNase）、抑肽酶、Tris-HCl、TritonX-100（Sigma，美国）；SF（苏州丝美特生物技术有限公司）；乙二醇二缩水甘油醚（ethyleneglycoldiglycidylether，EGDE）、N,N,N',N'-四甲基乙烯二胺（TEMED；上海麦克林生化科技股份有限公司）；高糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶、青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液（Gibco，美国）；胎牛血清、磷酸盐缓冲液（PBS；Hyclone，美国）；DNA定量试剂盒（Invitrogen，美国）；组织糖胺多糖（glycosaminoglycan，GAG）定量试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司）；胶原定量试剂盒（南京建成科技有限公司）。扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope，SEM；ZeissGemini300，德国）；力学分析仪（Instron-5542，美国）；激光共聚焦显微镜（LeicaTCSSP5，德国）；真空冷冻干燥机（上海亿倍实业发展有限公司）；全自动冷冻研磨仪（上海净信实业发展有限公司）。兔原代耳软骨细胞（IF鉴定），货号：AW-YCR024，5×10

2、方法

（1）三维大孔蛋白支架生物相容性评估

将兔脂肪干细胞以成骨诱导液培养7天后，按照10

（2）细胞接种

将原代兔耳软骨细胞经复苏和传代培养，收集第2代兔耳软骨细胞制备成6×10

（3）支架的细胞毒性

为了测定多孔支架的细胞毒性，将软骨细胞以2×10

（4）再生软骨组织学检测

将体外培养的兔耳软骨细胞与支架复合物植入裸鼠皮下体内培养5周后取出，将标本以4%多聚甲醛固定48h，常规脱水、透明，石蜡包埋并进行组织切片（厚度为5μm），随后行H-E染色及番红O（safranin-O）染色，观察再生软骨组织的组织结构和细胞外基质的分泌及分布情况。

（5）生化成分定量检测

采用AlcianBlue法检测再生软骨组织中的GAG含量，首先根据标准品浓度梯度绘制标准曲线，按照酶标仪比色结果（波长520nm）与标准曲线计算样本GAG含量。以样本碱水解法检测再生软骨的总胶原含量，根据酶标仪比色结果（波长550nm）与计算公式得到样本中总胶原的含量。采用hoechst33258染色法进行DNA定量检测，根据DNA标准品浓度梯度绘制标准曲线后，按照酶标仪检测结果（激发光为480nm，发射光为520nm）与标准曲线，计算样本中DNA含量。

（6）统计学分析

数据采用GraphPadPrism软件（Version8.0，美国）进行统计学分析。定量资料以x±s表示，2组数据比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

对支架浸提液的细胞毒性分析进一步验证了实验组的细胞增殖明显高于完全培养基的对照组，表明ACM-SF多孔支架对于软骨细胞没有毒性作用。细胞支架复合物植入裸鼠体内后，随着体内培养时间的延长，逐渐形成更加成熟的再生软骨组织。图6所示，在植入体内5周后，2组再生组织中均能观察到软骨细胞的腔隙结构和软骨特异性细胞外基质沉积，而实验组支架中的软骨细胞分布更加均匀，并形成了成熟的软骨组织；而对照组中基质间空隙部分较明显。

体内8周后，对照组与实验组的DNA含量分别为（15.82±0.18）ng/mg和（21.32±0.36）ng/mg；总胶原含量分别为（0.32±0.05）μg/mg和（0.63±0.06）μg/mg；GAG含量为（16.43±0.67）μg/mg和（19.32±0.85）μg/mg。两组的DNA含量、GAG含量和总胶原含量相比均具有显著差异。由此说明，本实验中，实验组的体内更快地形成了正常的软骨样组织。

由此说明，本发明利用重组的17型人源化胶原蛋白，采用物理和化学交联的方法合成了具有双网络结构的三维大孔支架，形成交联网络，使高孔隙率的多孔支架形成相互连接的蜂窝状结构，有利于细胞的黏附、生长和存活。并且，该三维大孔支架能为气体和营养交换以及废物代谢提供途径，从而对组织发育起着关键的作用。综上所述，该三维大孔支架能够有效保证组织工程软骨的体内再生。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。