一种类肝素、低分子硫酸软骨素和低分子硫酸皮肤素的制备方法

技术领域

本发明涉及肝素废蛋白分离技术领域，具体涉及一种类肝素、低分子硫酸软骨素和低分子硫酸皮肤素的制备方法。

背景技术

类肝素是指天然的、合成的和半合成的化学结构上与肝素有一定程度的类似、具有抗凝血活性的酸性黏多糖类物质。具有抗血栓形成、消炎、止痛、改善患处血液循环、吸收渗出物、治愈水肿及浮肿促进组织修复等作用。临床适用于血管栓塞、静脉曲张、浅表静脉炎、淋巴腺炎、乳腺炎与软化癫痕。类肝素产品可作为生产舒洛地特，冠心舒等药物的原料，此类药物因安全有效受到患者的广泛认同。

从猪小肠粘膜经过离子交换以及分级沉淀生产肝素的过程中产生了大量的废蛋白，这是因为树脂吸附过程中树脂也吸附蛋白，副产物蛋白中除了大量蛋白以外，其余主要成分是硫酸乙酰肝素(类肝素)、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和少量残留肝素。但是由于其中的有效物质分离困难，故生产肝素后一般将这些副产物丢弃，造成资源浪费。

有鉴于此，提出本申请。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有技术中肝素废蛋白分离困难，分离出的类肝素纯度和效价等综合性能低的问题。

本发明通过下述技术方案实现：

本申请提出了一种类肝素的制备方法，包括以下步骤：

S1：溶解：在肝素废蛋白中加入水和氯化钠进行溶解得到肝素废蛋白溶液；

S2：酶解：调节肝素废蛋白溶液的pH，再加入胰酶进行初步酶解后依次进行胰酶灭活、过滤得到初步酶解上清液；在所述初步上清液中加入硫酸软骨素ABC酶，进行再次酶解后依次进行硫酸软骨素ABC酶灭活、过滤得到最终酶解上清液。

S3：柱层析分离：其中，层析柱中包括再生液、平衡液、洗涤液和洗脱液；

调节最终酶解上清液的pH和电导率与所述平衡液一致后进行柱层析分离，柱层析分离过程中所述调节最终酶解上清液依次通入再生液、平衡液、上样液、洗涤液、洗脱液后得到柱层析流穿液、柱层析洗涤液和柱层析洗脱液；

S4：类肝素的制备：在柱层析洗脱液中加入碳酸钠、过氧化氢溶液后调节pH进行氧化反应，直至柱层析洗脱液中不在含有过氧化氢分子；再用采用超滤膜进行超滤收集滤液，调节pH后添加乙醇溶液至滤液中析出沉淀物质，将所述沉淀物质用乙醇脱水洗涤后进行干燥得到类肝素。

优选地，S1中加入水的重量是肝素废蛋白的10～13倍，加入氯化钠的重量是水的0.5％～1％，溶解时间为1～2小时。

优选地，S2中初步酶解的环境温度是50±2℃，酶解前调节的pH为8.0～8.4，所述胰酶的重量占肝素废蛋白的0.8～1.2％；

初步酶解时间为10～14小时，胰酶灭活的温度为88～92℃，胰酶灭活的时间为13～17分钟；

初步酶解上清液的过滤的方式为向胰酶灭活后的溶液中加入体积分数为15～25％的珍珠岩，搅拌25～35分钟进行过滤。

优选地，S2中再次酶解的温度为35～40℃，所述硫酸软骨素ABC酶为硫酸软骨素ABC酶80000U，再次酶解的时间为10～14小时，硫酸软骨素ABC酶灭活的温度为88～92℃，灭活的时间为13～17分钟。

优选地，所述再生液中溶质由氢氧化钠和氯化钠组成，所述氢氧化钠和氯化钠的浓度均为0.9～1.1mol/L；

所述平衡液为0.04～0.06mol/L的磷酸盐缓冲液；

所述洗涤液中溶质由磷酸盐和氯化钠组成，其中磷酸盐的浓度为0.04～0.06mol/L，氯化钠的浓度为0.35～0.6mol/L；

所述洗脱液为质量分数为12～14％的氯化钠溶液。

优选地，S4中加入碳酸钠的体积为柱层析洗脱液的0.5～0.7％；

加入过氧化氢后，过氧化氢在混合溶液中质量百分数为0.8～1.2％，氧化反应的pH为8.0～8.5，氧化时间为5～8小时；

超滤膜为1000Da超滤膜，所述滤液的电导率小于800us/cm，滤液的pH调节为6.0～7.0；

析出沉淀物质的乙醇溶液的质量分数为65～70％，析出沉淀物质的温度为22～27℃。

本申请还提出了一种低分子硫酸软骨素的制备方法，包括以下步骤：

将上述S3中柱层析流穿液作为原料进行制备，包括以下步骤：

S31：低分子硫酸软骨素制备：在柱层析流穿液中加入碳酸钠、过氧化氢溶液后调节pH进行氧化反应，直至柱层析流穿液中不在含有过氧化氢分子；再用采用超滤膜进行超滤收集滤液，调节pH后添加乙醇至滤液中析出沉淀物质，将所述沉淀物质用乙醇脱水洗涤后进行干燥得到低分子硫酸软骨素。

优选地，S31中加入碳酸钠的体积为柱层析流穿液的0.5～0.7％；

加入过氧化氢后，过氧化氢在混合溶液中质量百分数为0.8～1.2％，氧化反应的pH为8.0～8.5，氧化时间为5～8小时；

超滤膜为1000Da超滤膜，所述滤液的电导率小于800us/cm，滤液的pH调节为6.0～7.0；

析出沉淀物质的乙醇溶液的质量分数为65～70％，析出沉淀物质的温度为22～27℃。

本申请还提出一种低分子硫酸皮肤素的制备方法，将上述S3中柱层析洗涤液作为原料进行制备，包括以下步骤：

S32：低分子硫酸皮肤素制备：在柱层析洗涤液中加入碳酸钠、过氧化氢溶液后调节pH进行氧化反应，直至柱层析洗涤液中不在含有过氧化氢分子；再用采用超滤膜进行超滤收集滤液，调节pH后添加乙醇至滤液中析出沉淀物质，将所述沉淀物质用乙醇脱水洗涤后进行干燥得到低分子硫酸皮肤素。

优选地，S32中加入碳酸钠的体积为柱层析洗涤液的0.5～0.7％；

加入过氧化氢后，过氧化氢在混合溶液中质量百分数为0.8～1.2％，氧化反应的pH为8.0～8.5，氧化时间为5～8小时；

超滤膜为1000Da超滤膜，所述滤液的电导率小于800us/cm，滤液的pH调节为6.0～7.0；

析出沉淀物质的乙醇溶液的质量分数为65～70％，析出沉淀物质的温度为22～27℃。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

(1)本发明酶解过程使用了硫酸软骨素ABC酶进行再次酶解，采用柱层析分离，设计层析柱中的液体成分和层次，最终可以通过柱层析洗脱液得到的类肝素产品，同时柱层析分离后的流穿液和洗涤液可以分别制备出低分子硫酸软骨素和低分子硫酸皮肤素，分离和回收效率高。

(2)本发明肝素废蛋白粗品效价可提升至60～80U/mg，类肝素产品提取收率可达70％～80％，效价回收率可达70％～95％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：

图1为本发明实施例的制备工艺流程图；

图2为实施例1制备得到的类肝素的多硫酸软骨素的鉴定核磁共振氢谱图；

图3为实施例1制备得到的低分子硫酸皮肤素与硫酸皮肤素红外光谱图；

图4为实施例1制备得到的低分子硫酸软骨素与硫酸软骨素红外光谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

本发明实施例提供了一种类肝素的制备方法，包括以下步骤：

S1：溶解：在肝素废蛋白中加入水和氯化钠进行溶解得到肝素废蛋白溶液；其中加入水的重量是肝素废蛋白的10～13倍，加入氯化钠的重量是水的0.5％～1％，溶解时间为1～2小时。

S2：酶解：调节肝素废蛋白溶液的pH，再加入胰酶进行初步酶解后依次进行胰酶灭活、过滤得到初步酶解上清液；在所述初步上清液中加入低分子硫酸软骨素ABC酶，进行再次酶解后依次进行低分子硫酸软骨素ABC酶酶灭活、过滤得到最终酶解上清液；

初步酶解的环境温度是50±2℃，酶解前调节的pH为8.0～8.4，所述胰酶的重量占肝素废蛋白的0.8～1.2％；

初步酶解时间为10～14小时，胰酶灭活的温度为88～92℃，胰酶灭活的时间为13～17分钟；

初步酶解上清液的过滤的方式为向胰酶灭活后的溶液中加入体积分数为15～25％的珍珠岩，搅拌25～35分钟进行过滤；

再次酶解的温度为35～40℃，所述硫酸软骨素ABC酶为硫酸软骨素ABC酶80000U，再次酶解的时间为10～14小时，硫酸软骨素ABC酶灭活的温度为88～92℃，灭活的时间为13～17分钟。

S3：柱层析分离：其中，层析柱中包括再生液、平衡液、洗涤液和洗脱液；

调节最终酶解上清液的pH和电导率与所述平衡液一致后进行柱层析分离，柱层析分离过程中所述调节最终酶解上清液依次通入再生液、平衡液、上样液、洗涤液、洗脱液后得到柱层析流穿液、柱层析洗涤液和柱层析洗脱液；

所述再生液中溶质由氢氧化钠和氯化钠组成，所述氢氧化钠和氯化钠的浓度均为0.9～1.1mol/L；

所述平衡液为0.04～0.06mol/L的磷酸盐缓冲液；

所述洗涤液中溶质由磷酸盐和氯化钠组成，其中磷酸盐的浓度为0.04～0.06mol/L，氯化钠的浓度为0.35～0.6mol/L；

所述洗脱液为质量分数为12～14％的氯化钠溶液。

S4：类肝素的制备：在柱层析洗脱液中加入碳酸钠、过氧化氢溶液后调节pH进行氧化反应，直至柱层析洗脱液中不在含有过氧化氢分子；再用采用超滤膜进行超滤收集滤液，调节pH后添加乙醇溶液至滤液中析出沉淀物质，将所述沉淀物质用乙醇脱水洗涤后进行干燥得到类肝素；

其中，加入碳酸钠的体积为柱层析洗脱液的0.5～0.7％；

加入过氧化氢后，过氧化氢在混合溶液中质量百分数为0.8～1.2％，氧化反应的pH为8.0～8.5，氧化时间为5～8小时；

超滤膜为1000Da超滤膜，所述滤液的电导率小于800us/cm，滤液的pH调节为6.0～7.0；

析出沉淀物质的乙醇溶液的质量分数为65～70％，析出沉淀物质的温度为22～27℃。

本发明实施例还提供一种低分子硫酸软骨素的制备方法，将上述S3中柱层析流穿液作为原料进行制备，包括以下步骤：

S31：低分子硫酸软骨素制备：在柱层析流穿液中加入碳酸钠、过氧化氢溶液后调节pH进行氧化反应，直至柱层析洗脱液中不在含有过氧化氢分子；再用采用超滤膜进行超滤收集滤液，调节pH后添加乙醇至滤液中析出沉淀物质，将所述沉淀物质用乙醇脱水洗涤后进行干燥得到低分子硫酸软骨素；

加入碳酸钠的体积为柱层析流穿液的0.5～0.7％；

加入过氧化氢后，过氧化氢在混合溶液中质量百分数为0.8～1.2％，氧化反应的pH为8.0～8.5，氧化时间为5～8小时；

超滤膜为1000Da超滤膜，所述滤液的电导率小于800us/cm，滤液的pH调节为6.0～7.0；

析出沉淀物质的乙醇溶液的质量分数为65～70％，析出沉淀物质的温度为22～27℃。

本发明还提供一种低分子硫酸皮肤素的制备方法，将上述S3中柱层析洗涤液作为原料进行制备，包括以下步骤：

S32：低分子硫酸皮肤素制备：在柱层析洗涤液中加入碳酸钠、过氧化氢溶液后调节pH进行氧化反应，直至柱层析洗涤液中不在含有过氧化氢分子；再用采用超滤膜进行超滤收集滤液，调节pH后添加乙醇至滤液中析出沉淀物质，将所述沉淀物质用乙醇脱水洗涤后进行干燥得到低分子硫酸皮肤素；

加入碳酸钠的体积为柱层析洗涤液的0.5～0.7％；

加入过氧化氢后，过氧化氢在混合溶液中质量百分数为0.8～1.2％，氧化反应的pH为8.0～8.5，氧化时间为5～8小时；

超滤膜为1000Da超滤膜，所述滤液的电导率小于800us/cm，滤液的pH调节为6.0～7.0；

析出沉淀物质的乙醇溶液的质量分数为65～70％，析出沉淀物质的温度为22～27℃。

实施例1

本发明实施例提供一种类肝素、低分子硫酸软骨素和低分子硫酸皮肤素的制备方法，包括以下步骤：

S1：溶解：在10kg肝素废蛋白中加入水和氯化钠进行溶解得到肝素废蛋白溶液；其中加入水的重量是肝素废蛋白的10倍，加入氯化钠的重量是水的0.5％，溶解时间为1小时，溶解温度为37℃。

S2：酶解：调节肝素废蛋白溶液的pH，再加入胰酶进行初步酶解后依次进行胰酶灭活、过滤得到初步酶解上清液；在所述初步上清液中加入硫酸软骨素ABC酶，进行再次酶解后依次进行硫酸软骨素ABC酶酶灭活、过滤得到最终酶解上清液；

初步酶解的环境温度是50℃，酶解前调节的pH为8.2，所述胰酶的重量占肝素废蛋白的1％；

初步酶解时间为12小时，胰酶灭活的温度为90℃，胰酶灭活的时间为15分钟；

初步酶解上清液的过滤的方式为向胰酶灭活后的溶液中加入体积分数为20％的珍珠岩，搅拌30分钟进行过滤；

再次酶解的温度为37℃，所述硫酸软骨素ABC酶为硫酸软骨素ABC酶80000U，再次酶解的时间为12小时，硫酸软骨素ABC酶灭活的温度为90℃，灭活的时间为15分钟。

S3：柱层析分离：其中，层析柱中包括再生液、平衡液、洗涤液和洗脱液；

调节最终酶解上清液的pH和电导率与所述平衡液一致后进行柱层析分离，柱层析分离过程中所述调节最终酶解上清液依次通入再生液、平衡液、上样液、洗涤液、洗脱液后得到柱层析流穿液、柱层析洗涤液和柱层析洗脱液；

所述再生液中溶质由氢氧化钠和氯化钠组成，所述氢氧化钠和氯化钠的浓度均为1mol/L；

所述平衡液为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液；

所述洗涤液中溶质由磷酸盐和氯化钠组成，其中磷酸盐的浓度为0.05mol/L，氯化钠的浓度为0.4mol/L；

所述洗脱液为质量分数为13％的氯化钠溶液。

S4：类肝素的制备：在柱层析洗脱液中加入碳酸钠、过氧化氢溶液后调节pH进行氧化反应，直至柱层析洗脱液中不在含有过氧化氢分子；再用采用超滤膜进行超滤收集滤液，调节pH后添加乙醇溶液至滤液中析出沉淀物质，将所述沉淀物质用乙醇脱水3次洗涤后进行干燥得到类肝素；

其中，加入碳酸钠的体积为柱层析洗脱液的0.6％；

加入过氧化氢后，过氧化氢在混合溶液中质量百分数为1％，氧化反应的pH为8.2，氧化时间为8小时，加入亚硫酸钠至双氧水试纸检测无过氧化氢；

超滤膜为1000Da超滤膜，所述滤液的电导率小于800us/cm，滤液的pH调节为6.5；

析出沉淀物质的乙醇溶液的质量分数为68％，析出沉淀物质的温度为25℃。

S31：低分子硫酸软骨素制备：在柱层析流穿液中加入碳酸钠、过氧化氢溶液后调节pH进行氧化反应，直至柱层析洗脱液中不在含有过氧化氢分子；再用采用超滤膜进行超滤收集滤液，调节pH后添加乙醇至滤液中析出沉淀物质，将所述沉淀物质用乙醇脱水洗涤后进行干燥得到低分子硫酸软骨素；

加入碳酸钠的体积为柱层析流穿液的0.6％；

加入过氧化氢后，过氧化氢在混合溶液中质量百分数为1％，氧化反应的pH为8.2，氧化时间为8小时；

超滤膜为1000Da超滤膜，所述滤液的电导率小于800us/cm，滤液的pH调节为6.5；

析出沉淀物质的乙醇溶液的质量分数为68％，析出沉淀物质的温度为25℃。

S32：低分子硫酸皮肤素制备：在柱层析洗涤液中加入碳酸钠、过氧化氢溶液后调节pH进行氧化反应，直至柱层析洗涤液中不在含有过氧化氢分子；再用采用超滤膜进行超滤收集滤液，调节pH后添加乙醇至滤液中析出沉淀物质，将所述沉淀物质用乙醇脱水洗涤后进行干燥得到低分子硫酸皮肤素；

加入碳酸钠的体积为柱层析洗涤液的0.6％；

加入过氧化氢后，过氧化氢在混合溶液中质量百分数为1％，氧化反应的pH为8.3，氧化时间为8小时；

超滤膜为1000Da超滤膜，所述滤液的电导率小于800us/cm，滤液的pH调节为6.5；

析出沉淀物质的乙醇溶液的质量分数为68％，析出沉淀物质的温度为25℃。

将制备得到的类肝素进行核磁共振，结果如图2所示，证明本发明实施例不仅制备得到了类肝素产品，而且纯度高，分离效果好，不存在多硫酸软骨素杂质。制备得到的低分子硫酸皮肤素和低分子硫酸皮肤素红外光谱图如3-图4所示，鉴别结果符合规定。经过测试，本发明实施例制备得到的类肝素效价为68.1U/mg，比旋度为+32°，类肝素产品提取收率为79.6％，效价提取收率为91.2％。

实施例2：

本发明实施例提供一种类肝素、低分子硫酸软骨素和低分子硫酸皮肤素的制备方法，与实施例1的区别是洗涤液的磷酸盐的浓度为0.05mol/L，氯化钠的浓度为0.6mol/L，制备得到的类肝素效价为79.9U/mg，为比旋度39°，产品实物收率为70.2％，效价提取收率为75％。

将实施例1和实施例2制备得到的类肝素、低分子硫酸皮肤素和低分子硫酸软骨素的综合性能测试结果进行汇总，结果如下表1-表3所示：

对比例1：

提供一种类肝素的制备方法，与实施例1的区别是，删除步骤S31和S32，且删除S2中的初步酶解过程，得到的类肝素效价为36U/mg， 比旋度为15°，产品提取收率为70％，吸光度A260升至1.112，A280上升至1.203。吸光度显著提升，导致类肝素性能降低，效价比旋度显著下降。

对比例2：

提供一种类肝素的制备方法，与实施例1的区别是，删除步骤S31和S32，且删除S2中的再次酶解过程，得到的类肝素效价为26U/mg，比旋度为9°，产品提取收率为85％，吸光度A260为0.081，A280为0.092，效价、比旋度显著下降，说明硫酸软骨素ABC酶的再次酶解可以提高类肝素的效价和比旋度。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。