Lactiplantibacillus plantarum ZN1及其应用

技术领域

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体地说，涉及Lactiplantibacillus plantarum ZN1及其应用。

背景技术

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一类革兰氏染色呈阳性，代谢产生乳酸，不产芽孢，形状为杆状或球状的细菌的总称。目前至少可分为18个属，共200多种。乳酸菌分布广泛，生境包括人和动物肠道、各类发酵食品以及水体等自然环境。乳酸菌通常被认为是一类有益微生物，被公认为安全的食品微生物，一直单独或与酵母菌一同应用于发酵乳制品、蔬菜、谷物等食品，在食品工业中起重要的作用。食品经乳酸菌发酵后，不仅能被赋予特殊的风味，提高自身营养价值，延长贮藏期，并且在摄入人体后，具有一定的保健功能。对乳酸菌对宿主的保健功能已被广为认可。乳酸菌作为益生菌，可以在人体的肠道中定殖，对维持人体健康起到重要的作用，是人体内重要的共生菌群之一。乳酸菌在肠道中具有调节肠道菌群，抑制致病菌、腐败菌的生长繁殖，降低血清胆固醇，提高免疫力，保持微生态平衡，抗诱变，延缓衰老，改善肝功能，抗肿瘤活性，抗氧化活性，从而对机体的生理功能、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和应激反应等产生全方位的营养保健作用。由此可见，乳酸菌与人体健康有非常重要的联系。

乳酸菌一方面能明显激活巨噬细胞的吞噬作用，另一方面由于它能在肠道定植，相当于天然自动免疫。它们还能刺激腹膜巨噬细胞、诱导产生干扰素、促进细胞分裂、产生抗体及促进细胞免疫等，所以能增强机体的非特异性和特异性免疫反应，提高机体的抗病能力。口服乳酸菌后，对巨璇细胞的半乳糖甙酶活性、巨噬细胞的吞噬活性等具有显著的激活和促进作用。当异物侵入机体时，免疫细胞被乳酸菌激活，增强了机体对异物产生抗体的作用。乳酸菌之所以具有有激机体产生抗体的作用，是由于菌体通过淋巴结、粘膜刺激淋巴细胞接受刺激的淋巴细胞再通过肠系膜淋巴结(MIN)循环到血流中，并分布全身，从而调节机体的免疫应笞。

研究表明，乳酸菌的产酸能力及发酵风味特征等在发酵乳制品、发酵谷物饮料、发酵豆制品、发酵果熟制品、发酵饲料生产中发挥了重要的作用，使用时可以单独使用，也可以结合其它细菌使用。作为潜在益生菌的乳酸菌需要具备以下性能：具有突出的益生功能，而且需要耐受胃肠道酸性环境和胆盐环境，具有较好的抑菌活性性。

乳酸菌无论应用于食品工业或是作为益生菌应用于人类或畜禽健康产业都具有广泛的前景，因此，具有良好的提高免疫力和抑菌活性，并且可抗胃肠道胁迫，使益生菌顺利到达肠道起到抗菌消炎作用，是筛选益生菌的必要因素。

发明内容

本发明的目的是提供Lactiplantibacillus plantarum ZN1及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一株从西藏采集的藏灵菇中分离纯化出的植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum ZN1。菌株ZN1现已保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，邮编510070，保藏编号GDMCC No：63584，保藏日期2023年6月25日。

第二方面，本发明提供含有所述Lactiplantibacillus plantarum ZN1的微生物菌剂。

第三方面，本发明提供所述Lactiplantibacillus plantarum ZN1或所述微生物菌剂在生产发酵制品中的应用。

所述制品包括但不限于食品、保健品或药品。

所述菌包括但不限于产气荚膜杆菌(A型)、大肠杆菌、粪肠球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、绿脓假单胞菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。

第四方面，本发明提供所述Lactiplantibacillus plantarum ZN1在制备具有提高免疫力功能的制品中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供的植物乳杆菌ZN1具有较强的耐酸、耐胆盐能力，提高免疫力及抑菌效果突出。菌株ZN1对沙门氏菌，大肠杆菌等常见革兰氏阴性致病菌，产气荚膜杆菌，金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性致病菌抑制效果明显。该菌株能够有效抵抗地酸性，高胆盐环境的影响，保持较高活性。植物乳杆菌ZN1菌株发酵上清液可以显著增强巨噬细胞吞噬活性，参与机体非特异性免疫，提高巨噬细胞释放免疫活性分子NO水平，进而减轻体内炎症反应。该菌株可广泛应用于食品或药品等领域，前景广阔。

附图说明

图1为本发明植物乳杆菌ZN1的菌落图。

图2为本发明植物乳杆菌ZN1的革兰氏染色结果。

图3为本发明基于16S rDNA基因序列构建的植物乳杆菌ZN1的系统进化树。

具体实施方式

本发明提供一种具有提高免疫力和良好抑菌功能的植物乳杆菌ZN1及其应用。

本发明提供的植物乳杆菌ZN1对产气荚膜杆菌A型、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用。其中，对沙门氏菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，产气荚膜杆菌的抑制作用最强，抑菌直径超过20mm。产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)产气荚膜杆菌(Clostridium perfringen)

植物乳杆菌ZN1能耐受胃肠液、低酸性环境、高胆盐环境的影响，保持较高活性。该菌株经pH3.0酸性条件消化24h和1.0％胆盐溶液中消化24h，存活率分别高达82.6％和94.6％，能通过胃肠道的逆环境有效定植于肠道内发挥其功能特性。

植物乳杆菌ZN1具有提高免疫力活性，植物乳杆菌ZN1可以显著增强巨噬细胞吞噬活性，参与机体非特异性免疫，提高巨噬细胞释放免疫活性分子NO水平，NO浓度高达8.15μmol/L，显著高于其他对照菌株，进而减轻体内炎症反应。

植物乳杆菌ZN1可广泛应用于发酵食品、保健品或药品等生产领域，前景广阔。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1菌株的分离与筛选

1、样品来源

在西藏采集的藏灵菇。

2、菌株的分离

取藏灵菇1g加到9mL缓冲PBS中，10倍系列稀释，选择合适稀释度，分别划线到MRS培养基平板上。37℃培养16-18h；挑取菌落较大、活性较强的单菌落，于MRS培养基进行划线纯化培养，如此反复2～3次，直到划线平皿中菌落特征一致；每个纯化后的平皿挑取2个以上单菌落进行涂片、革兰氏染色，并且在显微镜下观察其颜色、菌体形状是否一致，从而确定该平皿中菌落是否为纯培养物。

通过镜检，挑选出呈蓝紫色、杆状的单独或成链状排列且无芽孢的菌株，共8株，分别命名为ZN1～ZN8。

3、抑菌菌株的复筛

参考指示菌株为大肠杆菌，体外抑菌实验采用打孔法进行，用打孔器在含有指示菌的培养基内打孔，活化好的实验菌液按80μl/孔，加入到相应的孔洞中，置于37℃培养20h，观察抑菌圈大小。

结果显示：本发明筛选出的8株菌中对大肠杆菌抑制效果最强的是ZN1菌株。

实施例2 ZN1菌株的鉴定

1、菌形态鉴定

如图1和图2所示，ZN1菌株为革兰氏阳性菌，兼性厌氧，无芽孢，不运动；菌落较小且大小均一，边缘整齐，表面光滑细密，白色或乳白色；菌体呈短杆状，成对或成链排列。

2、分子生物学鉴定

通过NCBI BLAST比对发现，ZN1菌株的16S rDNA序列(SEQ ID NO：1)与植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)的相似性最高。而且，使用MEGA7.0构建系统进化树，结果如图3所示，ZN1菌株与植物乳杆菌同源关系最近。

综上，结合ZN1菌株的菌落形态和分子生物学鉴定结果，确定筛选到的ZN1菌株是一株新型的植物乳杆菌，将其命名为植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)，并于2023年6月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)。

实施例3植物乳杆菌ZN1的抑菌效果实验

1、指示菌准备

取产气荚膜杆菌A型、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌四种指示菌株冻存管于室温下融化。

按1％(V/V)的接种量将植物乳杆菌ZN1、其他三株植物乳杆菌种子液分别接种到MRS培养基中，37℃培养24h。

按1％(V/V)的接种量将气荚膜杆菌A型、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌分别接种至液态培养基，37℃恒温过夜培养，得培养液(菌浓度约为2.4×10

2、抑菌圈实验

用无菌生理盐水分别调节沙气荚膜杆菌A型、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌指示菌的菌悬液浓度为10

取100μL指示菌菌悬液均匀涂布于固体培养基，将无菌牛津杯竖直置入固态培养基打孔后取出。取植物乳杆菌ZN1发酵液(发酵液的菌含量为10

表1植物乳杆菌ZN1发酵液抑菌效果

从表1可以看出，植物乳杆菌ZN对气荚膜杆菌A型、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有较强抑制作用，抑菌圈直径超过20mm。

实施例4植物乳杆菌ZN1对消化道逆环境的耐受实验

1、耐酸实验

实验涉及乳酸菌10株以及植物乳杆菌ZN1，分别在pH3.0的MRS液体培养基中，置于37℃培养，测定存活率。

(1)对照组：将活化后的植物乳杆菌ZN1菌液按3％(V/V)的比例接种于的液体MRS培养基(pH6.7)中；

(2)实验组：将活化后的植物乳杆菌ZN1菌液按3％(V/V)的比例接种于pH为3.0的液体MRS培养基中；

37℃静置培养15h后，用无菌生理盐水10倍梯度稀释，分别取适宜稀释度的菌液200μL混菌计数操作，每个稀释度3次重复，37℃静置培养15h后对平板进行活菌菌落计数。

对照组测得的活菌对数值用N

表2菌株在酸性条件下的存活率

从表2可知，本发明的植物乳杆菌对酸性环境的耐受性很强，在pH3.0的酸性条件下处理24h后，存活率仍高达82.6％，效果显著。

2、耐胆盐试验

实验涉及乳酸菌10株以及植物乳杆菌ZN1，分别接种到胆盐浓度为1.0％溶液中，置于37℃培养6h，测定其存活率。将活化后的植物乳杆菌ZN1菌液(菌含量约为8.0×10

表3植物乳杆菌ZN1对胆盐的耐受情况

从表3可知，11株实验菌在胆盐浓度为1.0％时，耐受性弱的菌株存活率较低，菌活损失40％左右。而耐受性强的菌株，菌活损失较小，本发明提供的植物乳杆菌ZN1对胆盐的耐受性很强，在1.0％胆盐处理24h后，存活率仍高达94.6％，取得了很好的技术效果。

实施例5植物乳杆菌ZN1在脂多糖刺激的巨噬细胞炎症模型中具有抑制炎症的作用

通过体外细胞实验考察植物乳杆菌ZN1发酵液对脂多糖刺激的巨噬细胞炎症模型的抑制效果。

将纯化后的植物乳杆菌ZN1和对照菌株接种于5ml的MRS肉汤培养基中，37℃培养24h制得母液；吸取200ul种母液液接种于100mL MRS肉汤培养基中，于37℃厌氧培养箱培养72h；随后将菌悬液于OD600时测定吸光度值确定菌落数后，8000rmp离心20min，取上清液于50ml离心管中，立即用细胞专用的0.22μm的无菌过滤器进行过滤制备成乳酸菌无菌上清发酵液待用，用细胞专用的DMEM高糖培养基将乳酸菌无菌上清发酵液配制成10

将巨噬细胞复苏后，传代2-3次待生长稳定后，进行试验。六孔板以1×10

采用Griess法测定不同药物处理后细胞上清分泌物中炎症因子NO的分泌水平变化。取6个浓度制作标准曲线，样本每个取50ul加入6孔板中，随后依次加入A液和B液各50ul，轻轻混匀后，于540nm波长下测定吸光度值，并根据标准曲线可计算出对应浓度(每个组设置3个复孔，重复3次)。

结果如表4所示，乳酸菌ZN1的发酵液均能够在一定程度上抑制由LPS刺激巨噬细胞产生的炎症反应。

表4植物乳杆菌ZN1提高免疫力(实验对象为巨噬细胞)

实施例6植物乳杆菌ZN1耐受人工胃液、人工肠液试验

1、人工胃液试验

取20mL植物乳杆菌ZN1发酵液(菌含量约为8.0×10

存活率(％)＝N

表5植物乳杆菌ZN1对人工胃液的耐受情况

从表5可以看出，本发明的植物乳杆菌ZN1在人工胃液经过3h消化后，仍能保证96.8％的存活率，效果显著。

2、人工肠液试验

取20mL植物乳杆菌ZN1发酵液(菌含量约为8.0×10

存活率(％)＝N

表6植物乳杆菌ZN1对人工肠液的耐受情况

从表6可以看出，本发明提供的植物乳杆菌ZN1在人工肠液经过6h消化后，存活率有所提升。说明该菌株能在人工肠液中实现有效增值，效果明显。

实施例7植物乳杆菌ZN1在发酵中药红景天的应用

1、中药发酵液的制备

称取红景天2.5g置于250mL三角瓶中，加水50mL，混匀，121℃灭菌20min，即得中药发酵培养基，将植物乳杆菌ZN1及对照菌株按接种量(体积分数)3％接种到红景天发酵培养基，于37℃恒温静置培养48h，获得红景天发酵液。

将上述所获得的红景天发酵液，6000rpm、4℃条件下离心10min；将上清液经0.45μm水相膜过滤后，得到无菌发酵上清液。

2、红景天发酵前后的DPPH自由基清除率

吸取1.0mL乙醇溶液，加0.5mL DPPH自由基乙醇溶液(0.1mmol/L)，加1.0mL样品溶液，混匀，在室温下避光放置60min，然后在517nm下测定吸光度，并计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率的计算公式如下：

DPPH自由基清除率/％＝(A0－Ai)/A0×100

式中：A0，溶剂空白管吸光值；Ai，样品管吸光值。

表7植物乳杆菌ZN1对DPPH自由基的清除率

从表7可以看出，红景天发酵后其清除DPPH自由基能力增强，抗氧化能力增加。本发明植物乳杆菌ZN1发酵制备的红景天具有较强抗氧化活性，能高效清除DPPH自由基，清除率高达72.6％，显著优于对照乳酸菌。

综上所述，本发明筛选获得的植物乳杆菌ZN1对沙门氏菌，大肠杆菌等常见革兰氏阴性致病菌，产气荚膜杆菌，金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性致病菌抑制效果明显。该菌株能够有效抵抗酸性，高胆盐环境的影响，保持较高活性。植物乳杆菌ZN1菌株发酵上清液可以显著增强巨噬细胞吞噬活性，参与机体非特异性免疫，提高巨噬细胞释放免疫活性分子NO水平，进而减轻体内炎症反应。植物乳杆菌ZN1用于发酵中药红景天，可以有效提高红景天对DPPH自由基的清除率，提高其抗氧化能力。该菌株可广泛应用食品或药品生产领域，前景广阔。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。