一种治疗骨关节炎的混合干细胞药物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及骨关节炎治疗药物技术领域，具体涉及一种治疗骨关节炎的混合干细胞药物及其制备方法和应用。

背景技术

骨关节炎（OA）是一种常见的关节损伤疾病，现有的治疗方法主要是使用物理疗法进行缓解，如热敷法等。此外，小分子化学药物也被用于治疗OA。近些年，在细胞和分子水平寻找治疗方法缓解OA也被广泛探究。研究证实，OA患者的软骨细胞受损严重，因此使用有效手段向患者体内补充软骨细胞或增强干细胞的软骨细胞分化能力以缓解OA具有很好的治疗效果。

随着人们对干细胞研究的深入，发现间充质干细胞（MSC）在骨关节炎治疗中具有独特的优势。原因如下：（1）MSC具备多向分化的潜能，在特定条件诱导下能够继续分化形成软骨细胞或成骨细胞等。（2）间充质干细胞具备免疫细胞特性，能够发挥免疫调控作用，通过双重调控免疫反应进而发挥缓解OA的作用。（3）激活的MSC通过旁分泌产生活性细胞因子等代谢产物能够缓解OA。因此，当前的研究热点主要集中在如何使用细胞疗法来治疗骨关节炎。

MSC具有不同的来源，且不同来源的MSC通常存在差异性。根据来源不同将其归化为自体来源间充质干细胞和异体来源间充质干细胞。在OA治疗中，这两种不同来源的MSC均被证实具有治疗OA的作用。其特点如下：（1）自体MSC通常来源于OA患者自身的骨髓，因此产生的免疫排斥反应少。然而由于大多数OA患者为老年患者，机体和细胞的衰老可能是导致发生OA的重要原因之一。细胞衰老会导致其活力下降，MSC也不例外，研究证实MSC衰老后其向软骨细胞、破骨细胞分化以及其免疫调控作用均会下降。因此利用自体衰老的MSC治疗OA往往无法达到预期效果，这限制了自体MSC在老年OA中的治疗。（2）异体间充质干细胞通常来源于健康人体的骨髓或脐带血，这类干细胞具备较强的活性和软骨细胞分化能力，能够有效缓解OA。但由于此类细胞非自体来源的属性，当注射至关节腔后会产生较强的免疫排斥反应，影响了异体MSC在OA中的应用。

发明内容

1.所要解决的技术问题：

针对上述技术问题，为了达到治疗OA的目的，本发明利用异体间充质干细胞增强自体间充质干细胞的功能，成功逆转了自体MSC衰老，同时增强了其向软骨细胞的分化，得到的药物对于OA的治疗有着显著的疗效。

2.技术方案：

一种治疗骨关节炎的混合干细胞药物的制备方法，包括如下步骤：

将自体来源的间充质干细胞和异体来源的间充质干细胞加入DMEM完全培养基中静置培养48~72 h，即得所述混合干细胞药物。

优选的，所述静置培养的条件为35~39 ℃，3~7% CO

优选的，所述异体来源的间充质干细胞来自于脐带血。

优选地，所述自体来源的间充质干细胞来自于骨髓。

优选的，所述药物中，异体来源的间充质干细胞占细胞总数的30%~80%，更优选的，异体来源的间充质干细胞占细胞总数的40%~70%。

优选的，所述DMEM完全培养基的配方为：DMEM+8~12%胎牛血清（体积分数）+90~110U/ml青霉素+90~110 µg/ml链霉素，更优选为DMEM+10%胎牛血清+100U/ml青霉素+100 µg/ml链霉素。

优选的，所述培养在孵育箱内进行。

优选的，所述培养在六孔板或Microwell培养板内进行，在六孔板内进行时为普通培养，在Microwell培养板内进行时为成球培养。优选为聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶、聚甲基丙烯酸羟乙酯（polyHEMA）或琼脂糖G-10材质的Microwell。

在Microwell培养板培养，更有利于促进自体MSC的功能，即逆转其衰老和促进向软骨细胞分化，得到的混合干细胞药物的微观形态为球形，具有更好的疗效。PEGDA、polyHEMA或琼脂糖G-10材质的Microwell具有更低的吸附，更有利于细胞球的形成。

本发明还提供上述制备方法制备得到的混合干细胞药物。

本发明还提供上述制备方法制备得到的混合干细胞药物在制备治疗骨关节炎药物中的应用。

在本发明的制备方法下，分离的MSC在体外能够稳定生长。当将异体MSC与自体MSC共培养后，自体MSC的衰老表型被逆转并向软骨细胞分化增加。

3.有益效果：

本发明通过将异体MSC与自体MSC共培养，成功实现了自体MSC的衰老表型被逆转并向软骨细胞分化增加，获得的混合干细胞药物对于OA的治疗有着显著的疗效，且同时能够避免免疫排斥反应。

附图说明

图1为实施例1中慢病毒感染自体/异体MSC的共聚焦成像图。

图2为实施例1共培养培养异体/自体MSC模式图。

图3 为实施例2中软模板加工技术制备所得的Microwell。

图4 为实施例2中普通光学显微镜下观察得到的MSC成球形态。

图5 为实施例2中钙黄绿色染色检测细胞微球活力。

图6 为实施例2中自体/异体MSC混合微球制备模式图。

图7 为实施例2中异体MSC促进自体MSC向软骨细胞分化时自体MSC相关标志蛋白表达情况图。

图8 为实施例2中异体MSC促进自体MSC向软骨细胞分化的阿尔新蓝染色结果图。

图9 为实施例3中异体/自体MSC衰老表型β-半乳糖苷酶检测结果图。

图10 为实施例3中检测自体/异体MSC衰老标志物p16的共聚焦成像图。

图11 为实施例3中异体MSC下调自体MSC衰老标志物p16表达的共聚焦成像图。

图12 为实施例3中混合干细胞治疗后的骨关节Mankin评分。

图13 为实施例3中混合干细胞治疗后的小鼠血清中的炎症因子IL-1β、IL-17、TNF-α和IFN-γ的表达情况。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行具体的说明。

如附图1至附图13所示，

以下实施例中涉及的细胞培养均采用相同的培养基和培养条件。培养基成分为：低糖DMEM+10%胎牛血清+100U/ml青霉素+100 µg/ml链霉素。培养条件为：37 ℃，5% CO

实施例1

（1）自体MSC分离：

研究中自体MSC来源临床患者的骨髓，分离方法具体如下：将收集到的骨髓细胞样本在2000 rpm/min，4℃条件下离心3 min，弃去上清，用7 mL无血清培养液混悬，按体积比1:1加于7 mL Ficoll-Paque细胞分离液（比重1.077）上，2000 rpm/min离心20min。溶液同样分为4层，从上到下依次为PBS液，单个核细胞层、Ficoll层，血细胞层，小心吸取中层骨髓有核细胞，使用无血清DMEM培养基漂洗后重悬细胞，使用台盼蓝染色并进行细胞计数，同时记录细胞活率，将单个核细胞以2×10

（2）异体MSC培养：

异体MSC为脐带血MSC，购自商品化的细胞系。将细胞培养至正常状态且细胞贴壁密度为90%时，使用0.25%胰酶消化细胞，对细胞进行传代培养。

结果显示，使用上述方法对自体MSC和异体MSC进行分离培养，细胞状态良好，活率大于90%。

（3）可视化异体/自体MSC构建和混合培养：

收集细胞，接种至六孔板，待细胞生长至密度为70%左右时，分别使用带有Zs-Green和mCherry的慢病毒感染自体/异体MSC，使自体/异体MSC分别带有绿色和红色荧光。慢病毒感染方法如下，取40 µl滴度为1×10

结果显示，使用不同荧光的慢病毒感染细胞后，得到了GFP-自体MSC和mCherry-异体MSC，激发后分别呈现绿色和红色荧光，荧光亮度显著，表明异体/自体MSC构建成功。

（4）普通混合干细胞药物的制备：

六孔板中加入GFP-自体MSC，细胞量为1×10

结果如表1所示，在混合培养体系异体MSC的占比为40%~70%时，自体MSC衰老被显著逆转，向软骨细胞的分化被显著促进。

表1不同培养体系培养后自体MSC的衰老和分化相关标志物的表达量

实施例2

异体/自体MSC成球培养：

（1）标准光刻法制备Microwell，使用软光刻技术首先制备主板模具，随后使用主板复制PDMS模具。首先向制备好的主板模具中加入聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合溶液（硅烷:固化剂=10:1），随后在真空中脱气15 min，在70-80 ℃环境下固化2 h，形成PDMS模具。选取聚乙二醇（1000）二丙烯酰酯作为光交联剂，将其溶解后，加入1%光引发剂2-二甲基-2-甲基苯丙酮，并将该溶液加入PDMS模具上，在紫外光照射下光交联600 s，形成Microwell。如图3。结果显示，由软模板加工技术制备的Microwell性能稳定，在水中持续浸泡7天后不发生崩解，可用于后期细胞成球培养。

（2）MSC成球能力及细胞球活力检测：

紫外过夜照射Microwell培养板，随后将其放置于细胞培养皿中。取1 mL 2×10

结果显示，经Microwell培养的MSC细胞，1天后即可观察到成球的细胞团。钙黄绿素染色结果显示，在Microwell中形成的MSC细胞球具备较强的活力。

（3）异体MSC促进自体MSC向软骨细胞分化：

Western blotting 检测SOX9和COLII的蛋白表达：收集按照实施例2中培养的混合细胞球（异体MSC数量占细胞总数60%），将细胞球消化为单细胞悬液后进行流式分选得到自体MSC，采用试剂盒提取细胞蛋白，随后对SOX9、COL II蛋白进行Western blotting 检测。结果如图7所示。

结果显示，成球培养体系中异体MSC能够促进自体MSC高表达SOX9和COL II，这表明异体MSC在细胞球中能够促进自体MSC向软骨分化。

阿尔新蓝染色检测自体MSC的蛋白聚糖分布：收取自体MSC，用 1×PBS 清洗后，浸泡于4%多聚甲醛溶液固定30 min 以上，随后使用梯度浓度酒精脱水，然后进行透明、浸蜡、石蜡包埋。修整蜡块，连续切片，每片厚度 3 μm，将自体MSC细胞切片粘附于载玻片上，在烘箱中烘干，脱腊，染色，在晾干的切片上滴加阿利新蓝染液，37℃染色 1 h，用自来水冲洗载玻片 5 min，晾干，在显微镜下观察软骨组织中蛋白聚糖的分布。结果如图8所示。

结果显示，与对照组相比，与异体MSC共培养后的自体MSC中的蛋白聚糖含量明显升高，这表明异体MSC的加入促进了自体MSC向软骨细胞分化。

（4）异体MSC逆转自体MSC衰老：

自体/异体MSC的β-半乳糖苷酶活性检测：为检测成球培养体系对自体MSC衰老状态的影响，首先检测了自体/异体MSC衰老标志物β-半乳糖苷酶的活性。方法如下，收集六孔板中培养的自体/异体MSC，加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟， PBS清洗3次，每次3min，进行β-半乳糖苷酶染色随后在普通光学显微镜下观察染色情况。结果如图9所示。

结果表明，自体MSC细胞中的β-半乳糖苷酶的活性明显高于异体MSC，说明由OA患者来源的干细胞处于高度衰老状态。

自体/异体MSC的衰老标志物p16检测：收集六孔板中的自体/异体MSC细胞，使用PBS洗涤三次，加入4%多聚甲醛固定20 min，继续使用PBS清洗三遍，随后使用Triton ×100进行细胞通透处理，加入山羊血清封闭30 min，随后加入p16抗体，室温孵育1 h，加入二抗，室温孵育2 h，加入300 µl DAPI封片液，直接在共聚焦显微镜下观察p16的分布情况。结果如图10所示，自体MSC细胞中p16的蛋白表达量显著高于异体MSC，表明OA患者来源的干细胞处于高度衰老状态

成球培养对自体MSC的影响：使用GFP-自体MSC与mcherry-异体MSC混合培养后使用流式细胞系进行分选，收集自体MSC细胞检测衰老标志物p16的表达。结果如图11所述，共培养后的自体MSC的p16的表达显著低于对照组自体MSC（未混合培养），这说明异体MSC在成球培养体系中逆转了自体MSC的衰老。

实施例3

（1）混合干细胞药物在小鼠骨关节炎模型上的疗效：

选用实施例1和实施例2制备的混合干细胞药物，考察其对骨关节炎的疗效。选择的药物分别是实施例1中异体MSC占比为60%的混合培养细胞（治疗组1）、实施例2中异体MSC占比为60%的混合成球培养细胞（治疗组2）、实施例1中异体MSC占比为0%的自体间充质干细胞（治疗组3）、实施例2中异体MSC占比为0%的混合成球培养细胞（治疗组4）、异体MSC占比为100%的干细胞（治疗组5）、异体MSC占比为60%，自体MSC占比为40%混合后不培养直接注射（治疗组6）。

具体实验过程如下：购买105只6~8周、体重为20~22 g Balb/c小鼠随机分为六组：正常组（n=15）、对照组（n=15）、治疗组1（n=15）、治疗组2（n=15）、治疗组3（n=15）、治疗组4（n=15）、治疗组5（n=15）、治疗组6（n=15）。正常组为未经任何处理的小鼠，对照组为使用内侧半月板失稳术造骨关节炎小鼠，关节腔注射与治疗组相同体积的生理盐水。治疗组1、2、3、4、5为在骨关节炎小鼠关节腔注射对应的混合干细胞药物（注射细胞量为5×10

在治疗完成后的病理切片显示，对照组关节软骨边缘不规则，软骨细胞的数量和软骨的厚度减少等，而干细胞治疗组的软骨结构均趋于完整，软骨细胞增多。对切片的Mankin评分如图12所示，异体MSC占比为60%的混合培养细胞（治疗组1）和异体MSC占比为0%的混合培养细胞（治疗组3）骨关节Mankin评分显著低于对照组，显示出显著的治疗效果。另外，治疗组2和治疗组4的骨关节Mankin评分也显著低于对照组，但高于治疗组1和3，表明异体-自体MSC混合制备的药物疗效比单独自体MSC干细胞治疗效果好。另外，将自体MSC和异体MSC不经过培养直接混合注射后Mankin评分也显著降低，显示出缓解骨关节炎的疗效，但显著低于治疗组2，此结果表明异体MSC通过共培养过程显著逆转了自体MSC的衰老，最终表现在骨关节炎中的治疗作用上。

（2）使用混合干细胞药物在小鼠骨关节炎的免疫排斥评价：

按照（1）的方法，在进行4周干细胞药物治疗后，处死小鼠，采用眼球取血法将全血收集到试管中，室温下血液自然凝固后，在4℃条件下1000×g离心20 min，取上清即得到血清样本。使用购自生工的小鼠白介素1β(IL-1β)ELISA试剂盒、小鼠白介素17 (IL-17)ELISA试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒、小鼠γ干扰素(IFN-γ)ELISA试剂盒检测各组别小鼠血清中的炎症因子IL-1β、IL-17、TNF-α和IFN-γ的表达情况。如图13所示，将正常组的炎症因子表达量的平均值作为1，计算各组炎症因子的表达量。

结果显示，单独注射正常培养的异体间充质干细胞（治疗组5）后引起了炎症因子的显著上调，而注射自体-异体混合培养的间充质干细胞后的炎症因子上调幅度相对于治疗组3和4较低，表明免疫排斥反应低于单独注射异体间充质干细胞。另外，成球培养方式（治疗组2）有助于降低干细胞药物的排异反应，体现在相对于治疗组1更低的炎症因子表达。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但它们并不是用来限定本发明的，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神和范围内，自当可作各种变化或润饰，因此本发明的保护范围应当以本申请的权利要求保护范围所界定的为准。