检测血清LUM表达的肝病纤维化检测试剂、检测试剂盒和检测方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种用于肝病纤维化诊断的双抗体夹心法ELISA检测试剂及方法。

背景技术

肝病是指各种原因导致肝脏疾病的统称，按病因分类可分为酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、病毒性肝病、自身免疫性肝病、药物/毒物性肝病、胆汁淤积性肝炎及遗传性肝病等。肝病的自然史中，肝病重症化倾向常以肝病的纤维化为表征，肝病纤维化晚期可发展至肝硬化甚至肝癌。当前对终末期肝病的治疗并不乐观，早期诊断、干预对肝病的治疗及预后至关重要。

目前，肝组织病理活检仍是评价肝病程度的金标准，但属于有创性方法。肝纤维化四项如血清III型前胶原氨基端肽(PIIINP)、IV胶原(CIV)、层连蛋白(LN)、透明质酸(HA)已在临床开展，但存在特异性、敏感性不足的缺陷。影像学技术可用于诊断肝硬化、肝肿瘤，但对慢性肝病存在早期预警程度差、成本较高的缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有肝病预后诊断技术的缺陷和不足，提供了一种新的肝病纤维化诊断标志物，即基膜聚糖(Lumican,LUM)。LUM是一种蛋白聚糖，隶属于富含亮氨酸低分子蛋白聚糖家族，最早在牛角膜基质中发现，其基因定位于染色体12q21.3-q22。作为细胞外基质的重要成分，LUM主要参与维持组织的结构稳态。

各类肝病中，肝脏纤维化程度是病情进展的一种指征；当纤维化进展成4期即肝硬化时，病情基本成不可逆性表现。本发明研究发现，血清LUM水平是肝病病情的检测指标，可以作为肝病临床辅助诊断手段，特别是对于肝病纤维化的显著期/进展期的发病预警和早期诊断，具有重要的临床应用价值。

本发明的第一个目的是提供血清LUM在作为肝病纤维化诊断标志物方面的应用。

本发明第二个目的是提供了一种检测LUM表达的肝病纤维化检测试剂盒，包括LUM捕获抗体和用于标记的LUM检测抗体。

具体的，LUM捕获抗体用于包被酶标板，辣根过氧化物酶标记于LUM检测抗体。

更为具体的，所述试剂盒包括LUM捕获抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的LUM检测抗体、LUM标准品、和辅助试剂组成。

更具体的，所述试剂盒包括如下组分：(1)酶标板：在固相96孔酶标板上包被有人LUM重组单克隆抗体；(2)酶结合物工作液：辣根过氧化物酶标记的人LUM重组单克隆抗体反应液；(3)显色液；(4)洗涤液；(5)结合物稀释液；(6)终止液。

优选地，所述试剂盒可作为肝病诊断试剂盒和早期预警诊断试剂盒。

本发明的第三个目的是提供了诊断肝病纤维化的检测试剂，包括与LUM特异性结合的抗体。

具体的，所述抗体包括LUM捕获抗体和用于标记的LUM检测抗体。

所述包被酶标板的LUM捕获抗体和HRP标记的LUM检测抗体为配对抗体

本发明还提供了一种血清LUM的双抗体夹心法ELISA检测方法，利用上述试剂盒进行双抗体夹心法ELISA检测。

优选地，所述的血清LUM的双抗体夹心法ELISA检测方法步骤如下：

S1.包被：LUM捕获抗体用PBS包被稀释液(137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na

S2.封闭：洗涤液(0.05％Tween20-PBS)冲洗96孔板数次，加结合物稀释液(0.1％BSA-PBS)100μl/孔，37℃放置1.5～2.5小时；

S3.加待检血清样品：洗涤液冲洗96孔板数次，加待检血清样品及结合物稀释液稀释的标准品(人LUM标准蛋白，2重复)100μl/孔，37℃放置1.5～2.5小时；

S4.加酶标抗体：洗涤液冲洗96孔板数次，用结合物稀释液稀释酶标抗体至0.1～0.2μg/ml，加入96孔板，100μl/孔，37℃放置1.5～2.5小时；

S5.加酶结合物工作液：洗涤液冲洗96孔板数次，加入96孔板，100μl/孔，37℃放置20分钟；

S6.显色：洗涤液冲洗96孔板数次，显色液(H

S7.标准曲线：根据标准品OD值绘制标准曲线，在标准曲线上查出待检标本的含量，数据统计出血清LUM含量。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种新的诊断肝病重症化的生物标记物，尤其是对于肝病纤维化的早期预警和早期诊断，具有重要的临床应用价值。血清LUM在作为肝病病程诊断标志物方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。

同时，本发明还建立了一种基于双抗体夹心原理的酶联免疫诊断方法，并开发成肝病诊断试剂盒，可以快速、准确地进行LUM的检测，具有操作简单、重复性好、特异性强、敏感性高等特点。

附图说明

图1 LUM检测的标准曲线。

图2正常组与肝病组的LUM表达量比较。

图3肝病患者按照纤维化分期的LUM表达量。

图4肝病非显著纤维化组与显著纤维化组的LUM表达量比较。

图5 LUM的表达量预测肝病纤维化的性能。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定，该领域的技术人员可以根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。任何与记载内容相似或均等的方法及材料均可应用于本发明中。

本发明提供了血清LUM在作为肝病纤维化诊断标志物方面的应用，具体包括在肝病纤维化诊断检测试剂、检测试剂盒和检测方法等的应用。可用于肝病诊断和肝病早期预警诊断。

检测血清LUM表达的肝病纤维化诊断试剂，包括检测LUM的试剂，具体包括特异性结合LUM的抗体。更具体的实施方案中，包括LUM捕获抗体和用于标记的LUM检测抗体。所述捕获抗体和检测抗体为配对抗体。

用于肝病纤维化诊断的基膜聚糖(LUM)酶联免疫法(ELISA)检测试剂盒，采用双抗体夹心法，所述试剂盒包括LUM捕获抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的LUM检测抗体、LUM标准品和辅助试剂组成。

在一个优选的方案中，所述包被酶标板的LUM捕获抗体和HRP标记的LUM检测抗体为配对抗体。

LUM捕获抗体包括能与人LUM蛋白结合的抗体或抗体片段。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，优选单克隆抗体。所述LUM捕获抗体选自，比如：MyBioSource的兔抗人LUM抗体(MBS9607931)；United States Biological的ItemPab Rb x LUM抗体(391203)；Thermo Fisher Scientific的LUM重组单克隆抗体(110)(MA5-30658)；Biorbyt的兔抗小鼠LUM抗体(orb315170)；antibodies-online的兔抗人LUM抗体(ABIN6390006)；FitzgeraldIndustries International的兔抗人LUM抗体(70R-18332)；LifeSpan BioSciences的兔抗人LUM抗体(LS-C660324)；Proteintech的兔抗人LUM抗体(10677-1-AP)；NovusBiologicals的兔抗人LUM抗体(110)(NBP2-89942)；Affinity Biosciences的兔抗人LUM抗体(DF7293)；R&D Systems公司的小鼠抗人Lumican抗体(mab28461)；Millipore的小鼠抗人LUM抗体(clone EFG-11，MAB2022)等。LUM捕获抗体也可通过体外表达或合成LUM蛋白或多肽片段，筛选针对LUM不同抗原表位的特异单抗或多抗而制备。

LUM检测抗体包括能结合LUM蛋白的抗体或抗体片段，可以是重组或嵌合性的人源化或鼠源化抗体。优选已标记的单克隆抗体或多克隆的抗体，比如G Biosciences的兔抗人Immunotag

LUM标准品，为人LUM标准蛋白，可通过常规的亲和层析从人体血清中分离出LUM；也可以选用，比如Abcam公司的人LUM全长蛋白(ab114635)；Millipore的Lumican重组蛋白(440319)；R&D Systems公司的重组人LUM(2846-LU)；北京义翘神州的Lumican重组蛋白(11640-H08H)。

所述辅助试剂包括显色液、洗涤液、结合物稀释液和终止液。

在一个具体的实施方案中，基膜聚糖(LUM)酶联免疫法(ELISA)检测试剂盒包括如下组分：

(1)酶标板：在固相96孔酶标板上包被有人LUM重组单克隆抗体。

(2)酶结合物工作液：辣根过氧化物酶(HRP)标记的人LUM重组单克隆抗体反应液。

(3)显色液：H

(4)洗涤液：0.05％Tween20-PBS。

(5)结合物稀释液：0.1％BSA-PBS。

(6)终止液：2N H

(7)标准品：人LUM标准蛋白。

在一个优选实施方式中，可以使用Millipore的小鼠抗人LUM抗体(clone EFG-11，MAB2022)作为LUM捕获抗体。使用R&D Systems公司的LUM抗体(#844082)作为LUM检测抗体。标准品使用R&D Systems公司的重组人LUM纯化蛋白(2846-LU)。

LUM的双抗体夹心法ELISA检测方法，可利用上述检测试剂盒进行双抗体夹心法ELISA检测。

在一个具体的实施方案中，血清LUM的双抗体夹心ELISA检测方法包括如下步骤：

S1.包被：LUM捕获抗体用PBS包被稀释液(137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na

S2.封闭：洗涤液(0.05％Tween20-PBS)冲洗96孔板数次，加结合物稀释液(0.1％BSA-PBS)100μl/孔，37℃放置1.5～2.5小时；

S3.加待检血清样品：洗涤液冲洗96孔板数次，加待检血清样品及结合物稀释液稀释的标准品(人LUM标准蛋白，2重复)100μl/孔，37℃放置1.5～2.5小时；

S4.加酶标抗体：洗涤液冲洗96孔板数次，用结合物稀释液稀释酶标抗体至0.1～0.2μg/ml，加入96孔板，100μl/孔，37℃放置1.5～2.5小时；

S5.加酶结合物工作液：洗涤液冲洗96孔板数次，加入96孔板，100μl/孔，37℃放置20分钟；

S6.显色：洗涤液冲洗96孔板数次，显色液(H

S7.标准曲线：根据标准品OD值绘制标准曲线，在标准曲线上查出待检标本的含量，数据统计出血清LUM含量。

本发明的检测样品可采用血清样品。

实施例1本发明所述检测试剂盒性能考察

配制LUM标准品梯度稀释液，浓度分别为100pg/ml，250pg/ml,500pg/ml，1000pg/ml，2000pg/ml,4000pg/ml，设置阴性对照，具体检测方法如下：

a)抗原-抗体反应：在包被酶标板的微孔中分别加入100ul LUM标准品溶液和阴性对照液，37℃放置1h。清洗缓冲液洗板操作5次。

b)将HRP标记的LUM单克隆抗体溶液加入各孔，每孔100u1，37℃放置2h。重复洗板操作5次。

c)将酶结合物工作液加入96孔板，100μl/孔，37℃放置20分钟；

d)显色反应：每孔依次加入显色液底物，100μl/孔，37℃显色20分钟，再加终止液结束反应。

e)比色：用酶标仪在450nm测定OD值并记录。

f)制作标准曲线:以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线。

标准曲线如图1所示。根据不同浓度标准品获得吸光度数据进行回归，得回归方程为Y＝0.001×X+0.01317；回归系数R

实施例2临床样本检测

1、血清样品

30份正常体检人群血清样品：经临床实验室检测无代谢性疾病(糖尿病、高血压、肾病)、无感染性疾病(HBV、HCV和HIV)，无肿瘤疾患；肝功能正常。

123份肝病患者血清样品：肝病包括非酒精性脂肪肝(NAFLD)、慢性乙型病毒性肝炎(HBV)、NAFLD合并HBV感染、及自身免疫性肝病。患者经肝脏穿刺病理分期分为F0期肝病13例、F1期肝病63例、F2期肝病22例、F3期肝病18例和F4期肝病7例。

所有样品收集于杭州师范大学附属医院，并经伦理委员会批准用于科学研究。

2、LUM的双抗体夹心法ELISA检测

采用本发明所述检测方法。数据统计：数据采用均值±标准差表示；两组比较使用t检验；p＜0.05被认为具有统计学意义。

3、结果

肝病中LUM的表达增加

正常组LUM表达量为4374.13±191.50pg/ml，肝病组LUM表达量为8018.20±837.66pg/ml；两组比较p<0.0001，差异显著(图2)。

肝病患者的LUM表达分布

F0期肝病患者LUM表达量为7658.42±891.26pg/ml，F1期肝病患者LUM表达量为7840.41±855.56pg/ml，F2期肝病患者LUM表达量为8156.78±591.32pg/ml，F3期肝病患者LUM表达量为8429.66±792.98pg/ml，F4期肝病患者LUM表达量为8637.03±610.23pg/ml。随纤维化分期进展，LUM的表达逐步增加(图3)。

肝病纤维化进展中的LUM表达

将肝病患者进行分层，将F<2称为纤维化非显著(Non-Significant fibrosis)，F≥2称为纤维化显著(Significant fibrosis)。非显著组患者LUM表达量为7809.28±858.46pg/ml，显著组LUM表达量为8356.04±686.10pg/ml。两组比较后者表达显著增高(图4)。

肝病纤维化的ROC分析

为评估血清LUM水平在显著肝纤维化阶段的表达与预测性能，设定非显著组为对照，绘制血清LUM的ROC曲线，并计算曲线下面积。AUC＝0.697，p<0.001。敏感性及特异性分别为79.25％、52.63％，Cut-off值为7870.873pg/ml(图5)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。