缓解动脉粥样硬化的发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470和长双歧杆菌L556

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及发酵乳杆菌F356，植物乳杆菌P470和长双歧杆菌L556及其应用。

背景技术

临床上使用最多的药物为他汀类药物，它是通过抑制羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶活性而降低胆固醇的内源性合成，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白(Low DensityLipoprotein，LDL)受体数量和活性增加、血清胆固醇水平降低。临床药物依泽替米贝抑制NPC1L1而降低胆固醇的吸收和转运；此外还有一些中药对血脂的调节也有一定的效果。2010 年，一项对 26 项试验的 129526 名参与者数据的荟萃分析表明，与标准治疗相比，他汀类药物治疗使心血管疾病事件的发生率显著下降了 15%。每降低 1 mmol/L LDL-C，总死亡率显著降低10% 。但目前他汀类药物的制造主要依赖化学合成，而合成类药物会有一些不良反应，全身身体不适、发热；腹部不适，嗳气，胃肠胀气，肝炎，胆汁淤积；骨骼肌痛，肌肉疲劳，颈痛，关节肿胀等。

寻求安全有效的功能性食品，如具有人体健康功能的益生菌正日益受到重视。目前，筛选在人体内具有降胆固醇作用的功能益生菌成为研究热点。

乳酸菌是一类具有长久安全食用历史的公认安全(GRAS)的食品级微生物。本世纪以来，乳酸菌最早在牛奶中被广泛应用，因其产酸，故很多乳酸菌均具有抗菌作用，起到防腐的作用。随着对乳酸菌研究的不断深入，人们发现乳酸菌不仅抗菌作用，在抗炎、抗氧化、抗肿瘤、调节免疫均有很大的作用。早在1963年首次研究非洲Samburu部落食用大量由野生乳酸菌和/或双歧杆菌发酵的牛奶后，发现血清胆固醇会降低。近年来，越来越多的研究者对益生菌降胆固醇进行研究。张芬从婴儿粪便中分离到屎肠球菌（

近年来，关于乳酸菌降胆固醇方面研究兴起，而对全面的益生特性评价、安全性评价、体内功能评价、以及具体机制解析。目前对于我国乳酸菌菌种资源开发并应用的菌株较少，故筛选功能性乳酸菌并且能对人体血脂有调节作用，且安全性高，机制明确的乳酸菌还要进一步开发。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供具有降血脂、抗氧化、抗炎作用的发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470和长双歧杆菌L556。

本发明的第一个目的在于提供发酵乳杆菌（

发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470和长双歧杆菌L556体外降低胆固醇分别为29.40%、32.30%和32.30%。体内动物实验表明发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470和长双歧杆菌L556喂养后的TG、TC、oxLDL和ALT水平均显著降低(P<0.05)。植物乳杆菌P470和长双歧杆菌L556还显著降低LDL-C水平，而长双歧杆菌L556显著降低AST水平。通过转录组和qPCR验证机制表明发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470通过调节类固醇激素生物合成通路上

本发明的第二个目的是提供上述的发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470或/和长双歧杆菌L556在制备降胆固醇、降血脂或/和缓解动脉粥样硬化产品中的应用。

优选，所述的产品为药物、食品或保健品。

优选，所述的保健品为益生菌粉，所述的食品为压片果糖或固体饮料。

本发明的第三个目的是提供上述的发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470或/和长双歧杆菌L556在降胆固醇、降血脂或/和缓解动脉粥样硬化中的应用。

优选，所述的降胆固醇、降血脂为通过调节类固醇激素生物合成通路上

本发明的第四个目的是提供上述的植物乳杆菌P470在抗菌或制备抗菌药物中的应用。

优选，所述的抗菌为抗大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、阪崎克罗诺杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌、印第安纳沙门菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌或印第安纳沙门菌。

本发明的第五个目的是提供一种微生物制剂，其含有上述的发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470或/和长双歧杆菌L556作为活性成分。

本发明的第六个目的是提供发酵乳杆菌F356的特异性分子靶标，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；或植物乳杆菌P470的特异性分子靶标，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；或长双歧杆菌L556的特异性分子靶标，核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

本发明的第七个目的是提供一种鉴定上述的发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470或长双歧杆菌L556的鉴定引物，当鉴定发酵乳杆菌F356时，其鉴定引物为SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示；当鉴定植物乳杆菌P470时，其鉴定引物为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；当鉴定长双歧杆菌L556时，其鉴定引物为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，以及SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12所示。

本发明的第八个目的是提供上述的发酵乳杆菌F356的特异性分子靶标或上述的鉴定引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6在鉴定上述的发酵乳杆菌F356中的应用；或上述的植物乳杆菌P470的特异性分子靶标或上述的鉴定引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8在鉴定上述的植物乳杆菌P470中的应用；或上述的长双歧杆菌L556的特异性分子靶标或上述的鉴定引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10以及SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12在鉴定上述的长双歧杆菌L556中的应用。

本发明的第九个目的是提供一种检测上述的发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470或长双歧杆菌L556的方法，其包括如下步骤：

当检测发酵乳杆菌F356时，提取样品的DNA，然后用鉴定引物SEQ ID NO:5和SEQID NO:6进行PCR扩增，如获得条带大小为316 bp，则为发酵乳杆菌F356，否则则不是；

或检测植物乳杆菌P470时，提取样品的DNA，然后用鉴定引物SEQ ID NO:7和SEQID NO:8进行PCR扩增，如获得条带大小为310 bp，则为植物乳杆菌P470，否则则不是；

或检测长双歧杆菌L556时，提取样品的DNA，然后用鉴定引物SEQ ID NO:9和SEQID NO:10以及SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12进行PCR扩增，如获得条带大小为393 bp和201bp，则为长双歧杆菌L556，否则则不是。

优选的，所述的PCR，其扩增体系包括2×PCR Mix、模板DNA、引物组和灭菌双蒸水。

优选的，所述的PCR，其扩增体系为2×PCR Mix 12.5 μL，模板DNA 10 μmol/L引物各1 μL，灭菌双蒸水补足体积至25 μL。

优选的，所述的PCR扩增，其扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；67-69℃退火30 s；72℃延伸30 s；变性、退火、延伸共进行30个循环；最后72℃延伸10 min。

本发明的优点：

本发明经过筛选得到3株具有降血脂、缓解动脉粥样硬化功能乳酸菌。经试验证明，这三株菌体内外具有降胆固醇能力，且体内降血脂、抗氧化、抗炎、缓解动脉粥样硬化功能，且无毒力基因和耐药基因无溶血性。通过16S rRNA基因序列（SEQ ID NO:13-15）比对分析，将菌株鉴定为发酵乳杆菌（

本发明提供的乳酸菌来自广东省科学院微生物研究所食品安全与健康发展中心团队菌库菌株。植物乳杆菌P470菌株抑制7种食源性致病菌以及多重耐药菌株；发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470和长双歧杆菌L556均有较好的安全性，在体外能降低胆固醇；体内外具有降脂功能，且体内降脂机制明确；还具有缓解动脉粥样硬化作用，其中三菌联用组在降低ApoE-/-小鼠的LDL-C水平优于LGG菌。说明这三株菌无论联用还是单菌均在预防和治疗高胆固醇血症、缓解肝损伤、致病菌的防控、动脉粥样硬化等心血管疾病方面具有较大的应用潜力和价值。

本发明的发酵乳杆菌（

附图说明

图1：溶血图片。(A)发酵乳杆菌F356，(B)植物乳杆菌P470，(C)长双歧杆菌L556。

图2：宏转录组解析干预菌株改善血脂的差异通路解析。(A)发酵乳杆菌F356组 vsHF组(B vs E)，(B)植物乳杆菌P470组 vs HF组(C vs E)；(C)长双歧杆菌L556组vs HF组(Gvs E)；HF组为模型组。

图3：qPCR验证差异基因表达。(A)发酵乳杆菌F356组 vs HF组(B vs E)，(B)植物乳杆菌P470组 vs HF组(C vs E)；(C)长双歧杆菌L556 组vs HF组(G vs E)；HF组为模型组。

图4：三菌及三菌联用组缓解ApoE-/-小鼠主动脉窦斑块面积。

图5：发酵乳杆菌F356血清和粪便差异代谢物。(A)粪便差异代谢物，(B)粪便差异代谢物KEGG富集通路，(C)血清差异代谢物，(D)血清差异代谢物KEGG富集通路。

图6：植物乳杆菌P470血清和粪便差异代谢物。(A)粪便差异代谢物，(B)粪便差异代谢物KEGG富集通路，(C)血清差异代谢物，(D)血清差异代谢物KEGG富集通路。

图7：长双歧杆菌L556血清和粪便差异代谢物。(A)粪便差异代谢物，(B)粪便差异代谢物KEGG富集通路，(C)血清差异代谢物，(D)血清差异代谢物KEGG富集通路。

图8：三菌联用组血清和粪便差异代谢物。(A)粪便差异代谢物，(B)粪便差异代谢物KEGG富集通路，(C)血清差异代谢物，(D)血清差异代谢物KEGG富集通路。

图9：发酵乳杆菌F356的特异靶标验证电泳图。(A)非发酵乳杆菌电泳条带，(B)非目标乳杆菌电泳条带，(C)非乳杆菌电泳条带。

图10：植物乳杆菌P470的特异靶标验证电泳图。(A)非植物乳杆菌电泳条带，(B)非目标乳杆菌电泳条带，(C)非乳杆菌电泳条带。

图11：长双歧杆菌L556的特异靶标验证电泳图。(A)非长双歧杆菌电泳条带，(B)非目标双歧杆菌电泳条带，(C)非双歧杆菌电泳条带。

图12：三菌 SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4靶标qPCR定量检测方法建立的结果示意图。(A)发酵乳杆菌F356 SEQ ID NO:1特异靶标qPCR定量检测方法建立的结果示意图，(B)植物乳杆菌P470 SEQ ID NO:2特异靶标qPCR定量检测方法建立的结果示意图，(C)长双歧杆菌L556 SEQ ID NO:3特异靶标qPCR定量检测方法建立的结果示意图，(D)长双歧杆菌L556 SEQ ID NO:4特异靶标qPCR定量检测方法建立的结果示意图。

图13：三菌 SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4靶标qPCR的实时标曲Ct值示意图。(A)发酵乳杆菌F356 SEQ ID NO:1特异靶标qPCR的实时标曲Ct值示意图，(B)植物乳杆菌P470 SEQID NO:2特异靶标qPCR的实时标曲Ct值示意图，(C)长双歧杆菌L556 SEQ ID NO:3特异靶标qPCR的实时标曲Ct值示意图，(D)长双歧杆菌L556 SEQ ID NO:4特异靶标qPCR的实时标曲Ct值示意图。

图14：三株菌PAM-qPCR和qPCR检测结果。

具体实施方式

为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。

实施例1：体外降胆固醇活性测定

（1）降胆固醇活性测定

胆固醇培养基（CHO）的配制（g/L）：胆固醇0.5 g，蔗糖酯0.1 g，吐温-80 1 mL，冰乙酸1 mL充分搅拌，并于60℃进行超声30 min，边加边搅拌加入含有质量分数0.2%牛磺脱氧胆酸钠的1 L MRS肉汤中。121℃灭菌20 min。

选取广东省科学院微生物研究所食品安全与健康发展中心菌库中3株乳酸菌进行活化，其中发酵乳杆菌F356来源新疆驴粪，植物乳杆菌P470来源新疆发酵蔬菜制品，长双岐杆菌L556来源健康人源粪便，按体积比2%接种量接入胆固醇培养基（CHO）中，37℃厌氧培养72 h，每个菌株接3个平行，以胆固醇培养基（CHO）为空白对照。取1 mL发酵液于4000×

P

其中，C：样品胆固醇含量；D：空白对照胆固醇含量。

本发明选取的菌株，经MALDI-TOF MS (BRUKER，Germany)质谱验证结果显示其为发酵乳杆菌F356(可信度为2.2)，植物乳杆菌P470(可信度为2.2)，和长双歧杆菌L556(可信度为2.2)，可信度大于2证明同源性大于99%。命名为发酵乳杆菌（

实施例2：乳酸菌发酵上清对常见食源性致病菌和多重耐药菌的抑制作用

选用指示菌为大肠杆菌ATCC 8739、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单增李斯特氏菌ATCC 19117、蜡样芽孢杆菌ATCC14579，铜绿假单胞菌ATCC 15442和团队自主分离的多重耐药菌株分别为单增李斯特菌833-1（耐药谱：K-CIP-SXT-S-E-OX-DA-TE-C)、印第安纳沙门菌51-38(耐药谱：NA-CIP-LVX-MXF-AM/CA-CN-SXT-TE-C-FFC)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA Sta 177-2（耐药谱：AMC-AMP-P-FOX-CAZ）、和印第安纳沙门菌77-5（耐药谱：AMP-AM/CA-CTX-CRO-S-AK-CN-NA-CIP-LVX-MXF-SMZ-TE-C-FFC）。发酵乳杆菌F356，植物乳杆菌P470和长双歧杆菌L556的种子液按体积比2%分别接种至MRS肉汤中，37℃厌氧培养48 h。4℃ 4000×

注：氨苄青霉素(AMP)；青霉素(P)；头孢西丁(FOX)；头孢他啶(CAZ)；红霉素(E)；阿莫西林(AMC)；阿莫西林/克拉维酸(AM/CA)；头孢噻肟(CTX)；头孢曲松(CRO)；链霉素(S)；阿米卡星(AK)；庆大霉素(CN)；萘啶酸(NA)；环丙沙星(CIP)；左氧氟沙星(LVX)；莫西沙星(MXF)；复方磺胺甲恶唑(SMZ)；四环素(TE)；氯霉素(C)；氟苯尼考( FFC)；卡那霉素(K)；复方新诺明(SXT)；苯唑西林(OX)；克林霉素(DA)。

表1 发酵上清抑菌实验

从表1中可以看出，MRS肉汤空白对照无抑菌活性。发酵乳杆菌F356和植物乳杆菌P470对7种食源性致病菌都具有较强的抑菌活性，其中植物乳杆菌P470抑菌圈直径均>18mm，该菌上清还可以抑制团队自主分离的多重耐药菌株，抑菌圈>17mm，而长双歧杆菌L556几乎没有抑菌活性，团队自主分离菌株德氏乳杆菌XJ-51活性也较弱，几乎无活性，结果表明植物乳杆菌P470的抑菌活性较强。

实施例3：乳酸菌安全性评价

（1）耐药基因和毒力基因检测

按照DNA提取试剂盒（肇庆环凯生物科技有限公司，TQ001D0）对酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470和长双歧杆菌L556进行DNA提取，使用0.80%琼脂糖凝胶电泳来评估基因组DNA的质量和完整性。同时使用NanoDrop 2000分光光度计和Qubit 3.0 荧光计测定DNA浓度和纯度。使用Illumina（中国CISTRO）、AMT快速DNA- seq试剂盒（中国/CISTRO，GOD-96）进行基因组DNA文库的构建，按照说明书进行片段化、末端修复、连接接头与Illumina适配器连接、使用磁珠选择片段大小、文库DNA纯化扩增。使用安捷伦生物分析仪2100和Qubit 3.0荧光计对文库进行评估。使用Illumina Nextseq 550平台和High Output v 2.5试剂盒（美国/Agilent，5067-4626）进行DNA测序。

下机数据采用Trimmomatic（v0.39）软件对下机数据进行拆分，去除低质量数据（过短、Q30过低）。对原始序列进行质控，采用Unicycler（v0.4.8）软件进行组装，基因组采用Quast（v5.0.2）软件进行基因组质控评估，并进行拼接。用Abricate（v0.8.13）软件查找并注释毒力基因及耐药基因，利用抗性基因数据库（the comprehensive antibioticresearch database，Card, http://arpcard.mcmaster.ca）毒力基因数据库（virulencefactors database，VFDB, http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm）进行比对，比对结果需要同时满足覆盖率≥95%，且鉴定率≥90%可认为该基因存在。

结果表明，发酵乳杆菌F356，植物乳杆菌P470和长双歧杆菌L556均不含有毒力基因和耐药基因。

（2）溶血实验

在无菌条件下，用接种环接种乳酸菌于绵羊血平板中，37 ℃培养48 h，观察溶血现象。溶血现象会在血平板上形成三种特征：① α溶血：菌落周围会出现草绿色溶血环，这种菌一般具有机会致病性。② β溶血：菌落周围出现较宽的透明溶血环，一般来说致病性强。③ γ溶血：菌落周围无溶血环的出现，一般来说菌株无致病性。

金黄色葡萄球菌ATCC® 25923为阳性对照，各菌落周围均无溶血环的出现，所以发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470和长双歧杆菌L556均为γ溶血（图1），不具有溶血活性。

实施例4：体内降脂的评价

（1）实验动物分组、血脂指标测定

5周龄SPF (Specific Pathogen- Free) SD大鼠，来自广东省医学动物中心(中国广州)，许可证号 SCXK（粤）2018-0002。将大鼠置于受控环境条件下(温度23±3℃，相对湿度50%-60%，光照/黑暗周期12/12 h，实验过程中自由取水和食物)。大鼠在实验前1周开始适应，并被随机分成五组。菌液制备：将各菌种子液按2%接种羽MRS肉汤中，于37℃培养24 h后6000×g离心5 min，收集菌体，用0.9%生理盐水洗涤两次并重悬。对照组(Controlgroup)大鼠喂食Co60辐照维持饲粮（广东省医学动物中心）。模型组(HF group)饲喂高脂饮食(HF)，发酵乳杆菌F356（

饲养35天后，从心脏取血并处死，立即切除心脏、肝脏、脾脏、肾脏、附睾脂肪、回肠、结肠，冲洗称重，冷冻于干冰中，-80℃保存直至分析。

血清生化分析采用16 h禁食状态下心脏采血。血液经3500 rpm，10 min，4℃离心取血清。采用迈瑞BS-480全自动生化分析仪测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、总胆汁酸(TBA)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇水平，氧化低密度脂蛋白（oxLDL）指标采用北京冬歌博业生物科技有限公司ELISA试剂盒（DG94873Q -96T）进行测定。

表2 各组大鼠的血脂生化指标

P

由表2可以看出，HF组和对照组的TC、TG、TBA、AST、ALT、LDL-C、HDL-C水平，oxLDL值和体重增加量，饲料利用率均有显著差异(

实施例5：体内降脂的机制评价

（1）肝脏宏转录组分析

采用 TRIzol(Invitrogen) 法提取实例4中各组肝脏样本（n=3）中的总RNA，并使用 DNase I (TaKara) 去除基因组 DNA 。分别采用 2100 Bioanalyser (Agilent)、ND-2000 (NanoDrop Technologies) 方法检测 RNA样品的质量，以保证使用合格的样品。RNA文库的建立采用 TruSeq TM RNA sample preparation Kit( Illumina , SanDiego, CA)试剂盒。cDNA 经过PCR富集[sample preparation Kit(Illumina , San Diego, CA) 试剂盒中自带]后，beads（DNAclean beads）筛选 200-300 bp 的条带。经TBS380（Picogreen）定量后，文库使用 Illumina HiSeq xten/NovaSeq 6000 测序平台进行高通量测序，测序读长为 PE150。利用SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep) 和 Sickle(https://github.com/najoshi/sickle)对原始数据进行修复末端和质控后，使用 HISAT2(http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml对处理好的读段与参考基因组进行定向模式对齐，采用每一百万读长转录本（TPM）方法进行差异基因统计。差异表达分析使用DESeq2 /DEGseq /EdgeR with Q值≤0.05, DEGs with |log2FC|>1 and Q值<=0.05(DESeq2或EdgeR) /Q值<= 0.001(DEGseq)认为差异有统计学意义，功能富集分析采用GO和KEGG。

经过KEGG富集通路分析，从图2可以看出，相比HF组，发酵乳杆菌F356主要差异通路有三条，植物乳杆菌P470有20条，其中与胆固醇、脂质相关的代谢通路为类固醇激素生物合成（Steroid hormone biosynthesis），类固醇激素以胆固醇为原料，经过一系列酶促反应而合成的，包括性激素和肾上腺皮质激素两大类。它们都是胆固醇衍生物，具有脂溶性，所以能够通过质膜并与细胞内受体（也称为核受体，NR）结合，发挥基因表达调控作用。在合成过程中主要涉及两类酶：细胞色素P450酶（CYP）和羟基类固醇脱氢酶（HSD）。长双歧杆菌L556主要差异通路有20条，结合上述生化指标与脂质代谢相关的通路主要为PPAR信号通路（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR signaling pathway）。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是与维甲酸、类固醇和甲状腺激素受体相关的配体激活转录因子超家族核激素受体成员。通过参与胆固醇的合成与分解、脂肪酸氧化等多种生物学过程，维持脂质代谢的动态平衡，从而调节血脂水平。故这三株菌可能通过调控胆固醇和脂质代谢进而改善高脂血症。

（2）qPCR 验证差异基因通路

基于上述结果，我们对差异通路上差异基因进行qPCR验证。利用提好的RNA样本，首先进行逆转录，采用广东环凯微生物科技有限公司的逆转录试剂盒（HKE045-01A-H），操作方法见说明书。接着进行qPCR，体系和程序如下所示。

qPCR扩增体系如下：

qPCR扩增程序如下：

设计引物如下表3：

表3 差异基因引物表

从上述结果得知，以β-actin作为内参，与HF组相比，发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470组差异通路主要为类固醇激素生物合成，长双歧杆菌L556差异通路为PPAR信号通路，针对这几个通路中差异差异基因进行qPCR验证，羟类固醇17-脱氢酶2（

实施例6：体内缓解动脉粥样硬化的评价

（1）血脂指标

6周龄SPF (Specific Pathogen- Free) ApoE-/-小鼠，来自来源常州卡文斯(中国常州)，许可证号 SCXK(苏）2021-0013。将小鼠置于受控环境条件下(温度23±3℃，相对湿度50% -60%，光照/黑暗周期12/12 h，实验过程中自由取水和食物)。小鼠在实验前1周开始适应，并被随机分成八组。对照组(Control group)大鼠喂食Co60辐照维持饲粮。模型组(HF group)饲喂高脂饮食(HF)。阿托伐他汀组饲喂剂量为2 mg/kg/d。菌液制备：将各菌种子液按2%接种羽MRS肉汤中，于37°C培养24h后6000×g离心5min，收集菌体，用0.9%生理盐水洗涤两次并重悬。发酵乳杆菌F356组（

饲养12周后，从心脏取血并处死，立即切除心脏、肝脏、脾脏、肾脏、附睾脂肪、回肠、结肠，冲洗称重，冷冻于干冰中，-80℃保存直至分析。

血清生化分析采用10 h禁食状态下麻醉眼眶采血。血液经3500 rpm，15 min，4℃离心取血清。采用迈瑞BS-480全自动生化分析仪测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇水平。

表4 各组血脂生化指标

结果（表4）显示，与模型组相比，阿托伐他汀主要显著提高HDL-C，发酵乳杆菌F356和植物乳杆菌P470主要降低TG；长双歧杆菌L556主要降低TC和LDL-C，发酵乳杆菌F356和三联组还能降低AST，三联组主要降低TG和LDL-C，且效果优于LGG。结果表明这三株菌菌降低血清中血脂指标，特别是三联组显著降低LDL-C，效果优于LGG组。

（2）斑块面积

将小鼠心脏固定10%福尔马林缓冲液中，接着用10%、20%、30%蔗糖梯度脱水，直至心脏沉底至脱水完成。去除心脏冰冻切片，加少量包埋剂到包埋盒中，取心脏上室部分进行切片，直到切至主动脉窦，切片厚度为10 μm，贴片室温放置20 min，蒸馏水浸洗包埋剂，60%异丙醇浸洗2 min，油红O工作液5 min，60%异丙醇调色，调色后立即水洗，苏木精复染（1min以内），盐酸酒精分化1-5 s，自来水返蓝，甘油明胶封片。在显微镜下观察斑块面积（红色区域），红色区域越大，斑块面积越大。

图4显示，与模型组相比，阿托伐他汀组、发酵乳杆菌F356组、植物乳杆菌P470组、长双歧杆菌L556组和三联组还能降低斑块面积，提示这三株菌在不同程度上缓解动脉粥样硬化的作用。

（3）非靶向代谢组学挖掘物质基础

小鼠粪便预处理:称取粪便样品50±5 mg，加入预冷甲醇:乙腈:水(4:2:2; v:v:v) 250 μL，将研磨机均质(45 HZ, 120 s)两次，水浴超声10 min，置于-20℃冰箱中静置1h，12000 rpm，4℃离心10 min，取上清液，置于真空干燥箱中室温干燥；然后用预冷乙腈:水(1:1; v:v)溶解200 μL，旋流30 s，12000 rpm、4℃离心15 min，取上清液作为处理样品，每个样品取10 μL混合作为QC样品，取200 μL作为进样体积。

血清预处理采用200 μL血清混合1 mL甲醇:乙腈(1:1; v:v)，超声(冰浴)20 min，放入-20℃冰箱1 h。取其1 mL上清，以13000rpm、15 min离心，4℃真空干燥。加入250μL 50%乙腈水溶液复溶，涡旋30℃，13000rpm、15 min离心，取上清液，作为处理样品，每个样品取10 μL混合作为QC样品，取200 μL作为进样体积。

使用UPLC UltiMate3000 (Thermo Fisher Scientific)液相色谱对加工后的粪便/血清样本进行代谢组学分析。UPLC系统配备RSLC系统、自动进样器和DAD-3000(RS)检测器，使用ESI源正负离子模式扫描(ESI+/ESD-)，鞘气流量40%，辅气流量10%，扫气流量0%，喷雾电压3.50 KV，毛细管温度320℃，S-lens RF电平50.0，辅气加热器温度350℃。采用ACQUITYUPLC®HSS T3 1.8 μm色谱柱(Waters, 2.1×100mm)进行分离。正离子模式的流动相为1/1000甲酸水，B相为乙腈，负离子模式的流动相为5 mmol乙酸，B相为乙腈，进样量为3μL，柱温为35℃。液相条件如表5所示。统计分析：UPLCQ-TOF-MS获得的原始数据使用ThermoCompound Discoverer™ 3.1软件进行色谱峰提取，该软件能够自动完成基线校准、峰对齐、色谱峰提取、解卷积等前处理，利用HMDB(http://www.hmdb.ca/)、KEGG (http://www.keggjp/)、Chemspider(http://www.chemspider.com/)等数据库进行检索完确定其结构，进行多元统计分析主要采用PCA和有OPLS-DA分析。此外，为了验证多元统计分析筛选出的变量是否不同，利用Metaboanalyst (https://www.metaboanalyst.ca/)进行了差异性检验(t检验)与差异倍数检验(Fold Change)与变量投影重要性指标(VIP≥1)，规定VIP≥1，

表5 液相洗脱条件

图5显示，与模型组相比，在粪便代谢组学中发酵乳杆菌F356显著增加Hydroxycholic acid，2-Indolinecarboxylic acid，IAA-Val，LysoPC(18:4(6Z,9Z,12Z,15Z))，7-ketodeoxycholic acid，Eugenol，显著降低D-PANTOTHENIC ACID，Lupulone，Arabinosylhypoxant，Genistein，KEGG富集通路主要在泛酸和辅酶a的生物合成，硫胺素新陈代谢，牛磺酸和次牛磺酸代谢，戊糖和葡萄糖酸盐的相互转化，类固醇激素生物合成，谷胱甘肽代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，花生四烯酸代谢，酪氨酸代谢，初级胆汁酸生物合成（图5A-B）。在血清代谢组中，发酵乳杆菌F356显著增加Palmitic Acid，Linolenic Acid，Arachidonic acid，Leukotriene E3，Succinic acid，Linoleamide，Allopregnanolone，Desthiobiotin，spermidine。发酵乳杆菌F356显著降低Trimethylamine N-oxide，Platelet-activating factor。KEGG富集通路主要在糖酵解/糖异生、谷胱甘肽代谢、乙醛酸盐和二羧酸盐代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、脂肪酸生物合成、类固醇激素生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成（图5C-D）。

图6显示，与模型组相比，在粪便代谢组学中植物乳杆菌P470显著增加16-Hydroxyhexadecanoic acid，Indole-3-carbidol，Dodecanedioic acid，Brassylic acid，Indole-3-acetic acid，Eugenol，Hydroxycholic acid，显著减少Lithocholic Acid，(±)11(12)-EET，(+)-Carpaine，Primaquine，13(S)-HOTrE，Taurodeoxycholic Acid，Taurochenodeoxycholic Acid，Taurine，7-ketodeoxycholic Acid，Lithocholic Acid，13(S)-HOTrE，Glycochenodeoxycholic Acid。KEGG富集通路主要在牛磺酸和次牛磺酸代谢，初级胆汁酸生物合成，硫代谢，类固醇激素生物合成，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，色氨酸代谢，类固醇生物合成（图6A-B）。在血清代谢组中，植物乳杆菌P470显著增加DocosahexaenoicAcid，L-(+)-Valine，Taurocholic acid，Glycocholic acid，Palmitic Acid，MyristicAcid，Linolenic Acid，Arachidonic acid，5-OxoETE，spermidine，Linoleamide显著降低Acetyl-L-carnitine，Trimethylamine N-oxide，Platelet-activating factor。KEGG富集通路主要在不饱和脂肪酸的生物合成、原胆酸的生物合成、脂肪酸的生物合成、d -谷氨酰胺和d -谷氨酸代谢、α -亚麻酸代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢、糖酵解/糖异生、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（图6C-D）。

图7显示，与模型组相比，在粪便代谢组学中长双歧杆菌L556显著增加prostaglandin E2 1-glyceryl ester，3−Carboxyindol，Palmitoleic Acid，Dodecanedioic acid，16-Hydroxyhexadecanoic acid，显著下降Glycodeoxycholic Acid，Glycochenodeoxycholic Acid，Taurodeoxycholic Acid，Hexadecanedioic acid，7-ketodeoxycholic Acid，Lithocholic Acid，13(S)-HOTrE，(±)11(12)-EET，Tyramine，DL-Tryptophan。KEGG富集通路主要在酪氨酸代谢，亚麻酸代谢，类固醇激素生物合成，萜类骨架生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，不饱和脂肪酸的生物合成，花生四烯酸代谢，氨基糖和核苷酸糖的代谢，初级胆汁酸生物合成（图7A-B）。在血清代谢组中，长双歧杆菌L556显著增加L-(+)-Valine，3-indole carboxylic acid glucuronide，DocosahexaenoicAcid，(±)13-HODE，Palmitic Acid，Linolenic Acid，Myristic Acid，spermidine，Linoleamide显著降低(±)11(12)-EET，bilirubin，Trimethylamine N-oxide，Platelet-activating factor。KEGG富集通路主要在不饱和脂肪酸的生物合成，泛酸和辅酶a的生物合成，脂肪酸生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，亚麻酸代谢，醚脂质代谢，谷胱甘肽代谢，花生四烯酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，脂肪酸延伸，脂肪酸降解，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解通路上（图7C-D）。

图8显示，与模型组相比，在粪便代谢组学中三联组显著增加Dehydrocholicacid，Hydroxycholic acid，7-ketodeoxycholic Acid，LysoPC(18:4(6Z,9Z,12Z,15Z))，D-Glucosamine 6-phosphate，N-Acetyl-L-leucine，Dodecanedioic acid，Diosgenin，Tocopherol显著降低Taurochenodeoxycholic Acid，13(S)-HOTrE，Tyramine，DL-Tryptophan，Lithocholic Acid，(+)-Carpaine，KEGG富集通路主要在初级胆汁酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，不饱和脂肪酸的生物合成，花生四烯酸代谢，Glycerophospholipid新陈代谢，醚脂质代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，氨基糖和核苷酸糖的代谢，类固醇生物合成（图8A-B）。在血清代谢组中，三联组显著增加DocosahexaenoicAcid，Myristic Acid，Palmitic Acid，Linolenic Acid，spermidine，Hydroxycholicacid，Linoleamide，显著降低(±)11(12)-EET，(±)11-HETE，ricinelaidic acid，Trimethylamine N-oxide，Platelet-activating factor，Oleic Acid，5-OxoETE，(±)18-HEPE，Arachidonic acid，KEGG富集通路主要在不饱和脂肪酸的生物合成，醚脂质代谢，花生四烯酸代谢，脂肪酸生物合成，亚麻酸代谢，谷胱甘肽代谢，Glycerophospholipid新陈代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，脂肪酸延伸，脂肪酸降解，类固醇激素生物合成（图8C-D）。

综上所述，这三株菌和三联菌均显著降低小鼠血清中Trimethylamine N-oxide（氧化三甲胺）、Platelet-activating factor（血小板激活因子），显著增加spermidine（亚精胺）、Linoleamide（亚油酰胺），将胆固醇转化为胆汁酸、类固醇等，脂肪转化为不饱和脂肪或其他脂肪酸，并且调控氨基酸代谢缓解动脉粥样硬化的进程。

实施例7：乳酸菌特异分子靶标验证

（1）不同种特异性新分子靶标的挖掘

首先对发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470和长双歧杆菌L556进行全基因测序，并利用GenBank数据库进行生物信息学分析，筛选得到发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470和长双歧杆菌L556特异性基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示。

（2）PCR检测引物有效性

根据（1）中的序列SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4设计特异性PCR扩增引物组（包括正向引物和反向引物），引物组序列如下表6。

表6 特异序列PCR检测引物组

步骤S1 DNA模板制备：将发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470和长双歧杆菌L556分别在MRS液体培养基中增菌培养，使用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模板，同时抽提非目标菌属和非菌属DNA，菌液浓度均为10

步骤S2 PCR扩增：PCR扩增体系如下：

其中：两组引物同时加入进行扩增，PCR扩增程序下所示。其中SEQ ID NO:7-8退火温度为67℃，SEQ ID NO:5-6、SEQ ID NO:9-10和SEQ ID NO:11-12为69℃。

步骤S3：取PCR扩增产物进行凝胶电泳，观察各引物组对应产物大小的位置是否同时存在两条扩增条带。如其他菌株模板没有同时出现两条带，说明对应靶标是菌株特异性分子靶标。

发酵乳杆菌F356检测特异性评价试验取22株其他发酵乳杆菌株，46株非目标乳杆菌以及23株非乳杆菌（表7）；植物乳杆菌P470检测特异性评价试验取22株植物乳杆菌株，46株非目标乳杆菌以及48株非乳杆菌（表8）；22株其他长双歧杆菌株，46株非目标双歧杆菌以及48株非双歧杆菌（表9）；按照上述方法进行发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470和长双歧杆菌L556特异靶标PCR检测。其中，步骤S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；步骤S2 PCR扩增时，使用的引物为引物组中的引物。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶液。

所用各细菌的菌株及检测结果如下表7、表8、表9所示，表中，检测结果栏目中“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图9、图10、图11所示，“+”表示目标条带，“M”为2000 Maker，“-”为空白对照。

表7 发酵乳杆菌F356检测特异性评价试验结果

表8 植物乳杆菌P470检测特异性评价试验结果

表9 长双歧杆菌L556检测特异性评价试验结果

由图9、图10、图11中可以看出，发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470含有一条特意条带，长双歧杆菌L556含有两条特意条带。均只有目标菌株同时出现特异扩增条带，非目标乳杆菌和非乳杆菌均不同时含有特异条带，说明本方法中仅目标菌株含有特异性分子靶标。

（3）荧光定量PCR检测引物有效性

利用荧光定量PCR进一步验证SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:12的有效性和特异性。首先培养发酵乳杆菌F356、植物乳杆菌P470和长双歧杆菌L556至MRS培养基中，调整活菌数为10

以表7、8、9所示菌株进行qPCR验证SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:12的有效性和特异性，其浓度为10

qPCR扩增体系如下：

其中：两组引物分开加入扩增体系，PCR扩增程序下所示。其中SEQ ID NO:7-8对应引物的退火温度为67℃，SEQ ID NO:5-6、SEQ ID NO:9-10、SEQ ID NO:11-12对应引物的为69℃。

qPCR扩增程序如下：

图12A为SEQ ID NO:5-6的标准曲线，本发明中该引物检测线为10

（4）PAM（叠氮溴化丙锭）荧光定量PCR检测活菌数

将三株菌培养至稳定期，取一定的菌量进行95℃加热10 min以灭活菌体，利用10µL平板培养法检测灭活菌不生长细菌。取 10 µL 活性菌（未加热灭活）的菌悬液加入 500µL PBS 溶液配制成活性菌样品，同时取 10 µL 灭活菌的菌悬液加入 500 µL PBS 溶液配制成非活性菌样品。将两种样品分别同时采用 PMA-qPCR 和常规 qPCR 进行检测，比较两种分子生物学方法的检测结果，每个试验设 2 个平行样，

PAM反应：将PMA染料溶解于DMSO中制备成2 mmol/L的储备液，放置于-20℃下避光保存。在 1.5 mL 透明离心管中加入 500 µL 待测样品，然后再加入12.5 µL 2 mmol/LPMA（终浓度为 50 µmol/L）上下晃动 3~4 次，避光摇床反应 5 min，然后将离心管平放于冰上，用 650 W 的卤素灯照射 4 min，离心管与卤素灯灯泡的距离为 20 cm。反应结束后将离心管在 8000 rpm下离心 10 min，收集菌体后用细菌DNA提取试剂盒提取DNA。发酵乳杆菌F356引物组SEQ ID NO:5-6，植物乳杆菌P470引物组SEQ ID NO:7-8，长双岐杆菌L556引物组SEQ ID NO:11-12。采用qPCR扩增体系和扩增条件，利用上述标准曲线，算样本活菌数（CFU/mL）。

结果如图14显示，PAM-qPCR处理的活菌，和普通qPCR扩增的qPCR显示的活菌数基本一致，说明普通qPCR无法鉴别出活菌和死菌，而PAM-qPCR-活菌和PAM-qPCR-死菌有显著的差异，发酵乳杆菌F356 SEQ ID NO:5-6检测线10

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。