用于荧光编码微球与抗原偶联的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于荧光编码微球与抗原偶联的试剂盒及其应用。

背景技术

自身免疫性肝病(autoimmune liver disease,ALD)是由于体内免疫功能紊乱而引起的一种特殊类型的慢性肝病，主要包括自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)、原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,PBC)、原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis,PSC)；其中，PBC和AIH都有敏感性和特异性较高的自身抗体。

PBC是一种慢性自身免疫性肝内胆汁性淤积性疾病，其自身抗体主要包括AMA、AMA-M2、抗gp210抗体和抗Sp100抗体。

大多数AIH患者的血清中存在一种或多种高滴度的自身抗体，但这些自身抗体通常缺乏疾病特异性。根据自身抗体的不同可将AIH分为两类：抗核抗体(antinuclearantibodies,ANA)或抗平滑肌抗体(anti-smooth muscle antibodies,ASMA)为阳性的1型、抗肝肾微粒体抗体-1型(anti-liver kidney microsome-1,抗LKM-1)或抗肝细胞溶质抗原-1型(anti-liver cytosol-1,抗LC-1)为阳性的2型AIH，其中1型AIH约占90％。

研究表明，约10.2％的AIH患者起病时ANA、ASMA阴性，但在后续随访期间有患者出现ANA阳性。相较于经典AIH患者，抗体阴性的AIH患者的血清IgG水平更低且起病时可能处在纤维化进展期，然而两组患者在起病时组织学炎症程度及半年内生化应答缓解率两方面均无统计学差异。因此，及时明确诊断并启动治疗，有助于改善抗体阴性AIH患者的预后。

近年来已有多种方法用于检测自身免疫性肝病抗体，如间接荧光法，胡曼智造流式发光法，血液凝聚法，放免法或酶标法，但是上述方法通常为定性检测，其检测自身免疫性肝病的效率不能满足临床需求。

发明内容

基于此，本发明提供了一种用于荧光编码微球与抗原偶联的试剂盒、与抗原偶联的荧光编码微球以及检测自身免疫性肝病的试剂盒。具体技术方案如下：

根据本发明的一个方面，提供了一种用于荧光编码微球与抗原偶联的试剂盒，所述试剂盒中包括微球包被液A或/和微球封闭液D，或者还包括微球活化液、微球保存液、活化剂A和活化剂B中的一种或者多种；

其中，所述微球包被液A中包括0.0736mol/L～0.0744mol/L醋酸钠溶液和0.177mol/L～0.201mol/L醋酸溶液，所述微球包被液A的pH值为4.4～4.6；

按每100mL计，所述微球封闭液D中包括5g～7g Tris、0.43g～0.53g蔗糖、7g～9g海藻糖、0.9g～1g BSA、9g～2.1g PEG6000、0.12g～0.18g TritonX-100和0.09mL～0.11mLProclin300，所述微球封闭液D的pH值为7.3～7.5。

在其中一个实施例中，按每100mL计，所述微球活化液中包括0.505g～0.555g2-吗啉乙磺酸和0.475g～0.525g 2-吗啉乙磺酸钠盐；所述微球活化液的pH值为5.9～6.1。

在其中一个实施例中，所述试剂盒中还包括微球包被液B、微球包被液C和微球包被液D中的至少一种；

可选地，按每100mL计，所述微球包被液B中包括1g～2g 2-吗啉乙磺酸和0.9g～1.0g 2-吗啉乙磺酸钠盐，所述微球包被液B的pH值为5.95～6.15；

可选地，按每100mL计，所述微球包被液C中包括0.09g～0.15g无水磷酸氢二钠、0.014g～0.034g二水磷酸二氢钠和0.08mL～0.12mL Proclin300，所述微球包被液C的pH值为7.3～7.5；

可选地，按每100mL计，所述微球包被液D中包括0.09g～0.15g无水碳酸钠、0.09g～0.15g碳酸氢钠和0.06g～0.12g氯化钠，所述微球包被液D的pH值为9.5～9.7。

在其中一个实施例中，所述试剂盒中还包括微球封闭液A、微球封闭液B和微球封闭液C中的至少一种；

可选地，按每100mL计，所述微球封闭液A中包括0.152g～0.189g无水磷酸氢二钠、0.116g～0.147g二水磷酸二氢钠、1.686g～1.749g氯化钠、0.297g～0.328g BSA、0.003g～0.022g吐温20、1.844g～1.906g Glycine、0.053mL～0.072mL Proclin300和6.156mL～6.344mL山羊血清，所述微球封闭液A的pH值为6.4～6.6；

可选地，按每100mL计，所述微球封闭液B中包括4.5g～4.7gTris、0.43g～0.53g蔗糖、5.04g～5.34g海藻糖、0.92g～1.08g BSA、0.03～0.05g吐温20、5.85g～6.15gGlycine、0.16g～0.2g TritonX-405和0.19mL～0.21mL Proclin300，所述微球封闭液B的pH值为7.9～8.1；

可选地，按每100mL计，所述微球封闭液C中包括1.5g～1.7g Tris、0.43g～0.53g蔗糖、0.9g～1.1g BSA、0.94g～1.06g PEG2000和0.19mL～0.21mL Proclin300，所述微球封闭液C的pH值为7.3～7.5。

在其中一个实施例中，按每100mL计，所述微球保存液中包括5.9g～6.1g HEPES缓冲液、4.9g～5.1g蔗糖、95g～2.05g海藻糖、0.25g～0.35g BSA、1.45g～1.55g甘露醇、0.54g～0.66g乙二胺四乙酸二钠和0.09mL～0.11mL Proclin300；所述微球保存液的pH值为7.3～7.5。

在其中一个实施例中，所述试剂盒满足如下条件中的至少一种：

(1)所述活化剂A中包括N-羟基硫代琥珀酰亚胺和所述微球活化液；

(2)所述活化剂B中包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和所述微球活化液。

一种与抗原偶联的荧光编码微球，采用上述的用于荧光编码微球与抗原偶联的试剂盒制备。

一种检测自身免疫性肝病的试剂盒，包括至少一个上述的与抗原偶联的荧光编码微球；所述抗原为LC-1抗原、LKM-1抗原、gp210抗原、Sp100抗原、AMA-M2抗原、CENP-B抗原、ASMA抗原、SLA/LP抗原或Ro52抗原。

在其中一个实施例中，所述试剂盒中还包括样本稀释液和荧光标记的羊抗人IgG中的一种或多种。

在其中一个实施例中，按每100mL计，所述样本稀释液中包括0.006g～0.046g无水磷酸氢二钠、0.332g～0.432g二水磷酸二氢钠、0.28g～0.38g氯化钠和0.09mL～0.11mLProclin300。

与传统技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过微球包被液和微球封闭液进行改进，能够提升荧光免疫微球与抗原的偶联效率；从而提升流式荧光检测的信噪比和检出效率，为临床上自身免疫性肝病的筛查、诊断与治疗提供参考。

附图说明

图1为ASMA抗原的疏水性结构示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

术语

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。

本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。

本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1-10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

本发明的一些实施方式提供了一种用于荧光编码微球与抗原偶联的试剂盒，试剂盒中包括微球活化液、微球包被液A、微球封闭液D、微球保存液、活化剂A和活化剂B；

其中，微球包被液A中包括0.0736mol/L～0.0744mol/L醋酸钠溶液和0.177mol/L～0.201mol/L的醋酸溶液，微球包被液A的pH值为4.4～4.6；

按每100mL计，微球封闭液D中包括1.5g～1.7g Tris(三羟甲基氨基甲烷)、0.43g～0.53g蔗糖、1.7g～1.9g海藻糖、0.9g～1.1g BSA(Bovine Serum Albumin,牛血清白蛋白)、1.9g～2.1g PEG6000、0.12g～0.18g TritonX-100和0.09mL～0.11mL Proclin300，微球封闭液D的pH值为7.3～7.5。

可理解地，LC-1抗原的等电点在pH值为5.95左右，因此配制pH值为4.4～4.6的微球包被液可以使LC-1抗原整体带正电，而羧基是带负电，正负电荷吸引使微球与抗原结合；从而提升了LC-1抗原与荧光编码微球的偶联效率，增加该指标的检测灵敏度。LC-1抗体是部分2型AIH患者唯一可检测到的自身抗体，且LC-1抗体与AIH的疾病活动度和进展有关；因此，提升对LC-1抗体的检测效率，对2型AIH患者而言具有重要意义。

ASMA抗原的疏水性结构如图1所示，大部分抗原结构的疏水性指数都是在0值以上，即抗原整体结构疏水。而在微球封闭液中加入PEG2000和蔗糖等亲水性物质，极大地增加了抗原溶解度，提升了对疏水性位点的封闭效果。

目前，通常采用欧蒙间接免疫荧光法判断ASMA指标，但该方法具有操作繁琐、费时等缺点；而流式荧光法检测更快速、便捷；在此基础上，对偶联抗原的荧光免疫微球进行优化和改进，提升流式荧光法检测ASMA指标的效率。

优选地，微球包被液A中包括0.074mol/L的醋酸钠溶液和0.189mol/L的醋酸溶液，pH值为4.5。

优选地，按每100mL计，微球封闭液D中包括1.6g Tris、0.48g蔗糖、1.8g海藻糖、1.0g BSA、2.0g PEG6000、0.15g TritonX-100和0.10mL Proclin300，pH值为7.4。

在其中一些实施方式中，按每100mL计，微球活化液中包括0.505g～0.555g2-吗啉乙磺酸(MES)和0.475g～0.525g 2-吗啉乙磺酸钠盐(MES-Na)；微球活化液的pH值为5.9～6.1。

优选地，按每100mL计，微球活化液中包括0.53g 2-吗啉乙磺酸和0.5g 2-吗啉乙磺酸钠盐；pH值为6.0。

在其中一些实施方式中，试剂盒中还包括微球包被液B、微球包被液C和微球包被液D中的至少一种。

在其中一些具体示例中，按每100mL计，微球包被液B中包括1.1g～1.2g 2-吗啉乙磺酸和0.9g～1.0g 2-吗啉乙磺酸钠盐，微球包被液B的pH值为5.95～6.15。

优选地，按每100mL计，微球包被液B中包括1.15g 2-吗啉乙磺酸和0.95g2-吗啉乙磺酸钠盐，微球包被液B的pH值为6.05。

在其中一些具体示例中，按每100mL计，微球包被液C中包括0.09g～0.15g无水磷酸氢二钠、0.014g～0.034g二水磷酸二氢钠和0.08mL～0.12mL Proclin300，微球包被液C的pH值为7.3～7.5。

优选地，按每100mL计，微球包被液C中包括0.12g无水磷酸氢二钠、0.024g二水磷酸二氢钠和0.1mL Proclin300，微球包被液C的pH值为7.4。

在其中一些具体示例中，按每100mL计，微球包被液D中包括0.09g～0.15g无水碳酸钠、0.09g～0.15g碳酸氢钠和0.06g～0.12g氯化钠，微球包被液D的pH值为9.5～9.7。

优选地，按每100mL计，微球包被液中D包括0.12g无水碳酸钠、0.12g碳酸氢钠和0.09g氯化钠，微球包被液D的pH值为9.6。

在其中一些实施方式中，试剂盒中还包括微球封闭液A、微球封闭液B和微球封闭液C中的至少一种。

在其中一些示例中，按每100mL计，微球封闭液A中包括0.152g～0.189g无水磷酸氢二钠、0.116g～0.147g二水磷酸二氢钠、1.686g～1.749g氯化钠、0.297g～0.328g BSA、0.003g～0.022g吐温20、1.844g～1.906g Glycine、0.053mL～0.072mL Proclin300和6.156mL～6.344mL山羊血清，微球封闭液A的pH值为6.4～6.6。

优选地，按每100mL计，微球封闭液A中包括0.171g无水磷酸氢二钠、0.131g二水磷酸二氢钠、1.717g氯化钠、0.313g BSA、0.013g吐温20、1.875g Glycine、0.063mLProclin300和6.25mL山羊血清，微球封闭液A的pH值为6.5。

在其中一些示例中，按每100mL计，微球封闭液B中包括4.5g～4.7g Tris、0.43g～0.53g蔗糖、5.04g～5.34g海藻糖、0.92g～1.08g BSA、0.03～0.05g吐温20、5.85g～6.15gGlycine、0.16g～0.2g TritonX-405和0.19mL～0.21mL Proclin300，微球封闭液B的pH值为7.9～8.1。

优选地，按每100mL计，微球封闭液B中包括4.6g Tris、0.48g蔗糖、5.19g海藻糖、1.0g BSA、0.04g吐温20、6.0g Glycine、0.18g TritonX-405和0.20mL Proclin300，微球封闭液B的pH值为8.0。

在其中一些示例中，按每100mL计，微球封闭液C中包括1.5g～1.7g Tris、0.43g～0.53g蔗糖、0.9g～1.1g BSA、0.94g～1.06g PEG2000和0.19mL～0.21mL Proclin300，微球封闭液C的pH值为7.3～7.5。

优选地，按每100mL计，微球封闭液C中包括1.6g Tris、0.48g蔗糖、1.0g BSA、1.0gPEG2000和0.20mL Proclin300，微球封闭液C的pH值为7.4。

在其中一些实施方式中，按每100mL计，微球保存液中包括5.9g～6.1g HEPES缓冲液、4.9g～5.1g蔗糖、1.95g～2.05g海藻糖、0.25g～0.35g BSA、1.45g～1.55g甘露醇、0.54g～0.66g乙二胺四乙酸二钠和0.09mL～0.11mL Proclin300；微球保存液的pH值为7.3～7.5。

优选地，按每100mL计，微球保存液中包括6.0g HEPES缓冲液、5.0g蔗糖、2.0g海藻糖、0.30g BSA、1.50g甘露醇、0.60g乙二胺四乙酸二钠和0.10mL Proclin300；微球保存液的pH值为7.4。

在其中一些实施方式中，活化剂A中包括N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和上述的微球活化液。

在其中一些具体示例中，N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量与微球活化液的体积之比为1mg：20μL。

在其中一些实施方式中，活化剂B中包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和微球活化液。

在其中一些具体示例中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的质量与微球活化液的体积之比为1mg：20μL。

采用上述试剂盒，能够提升荧光免疫微球与抗原偶联的效果，从而提高流式荧光法检测自身抗体的信噪比和准确性。

本发明的一些实施方式还提供了一种采用上述的用于荧光编码微球与抗原偶联的试剂盒制备的荧光编码微球。

本发明的一些实施方式还提供了一种检测自身免疫性肝病的试剂盒，试剂盒中包括至少一个与抗原偶联的荧光编码微球；抗原选自LC-1抗原、LKM-1抗原、gp210抗原、Sp100抗原、AMA-M2抗原、CENP-B抗原、ASMA抗原、SLA/LP抗原和Ro52抗原中的一个或多个。

在其中一些实施方式中，试剂盒中包括9个荧光编码微球，9个荧光编码微球分别与LC-1抗原、LKM-1抗原、gp210抗原、Sp100抗原、AMA-M2抗原、CENP-B抗原、ASMA抗原、SLA/LP抗原和Ro52抗原偶联。

本发明的检测自身免疫性肝病的试剂盒中包括了9个抗原指标，在临床上能够对自身免疫性肝病进行更全面、更准确地筛查和诊断。

在其中一些实施方式中，试剂盒中还包括样本稀释液和荧光标记的羊抗人IgG中的一种或多种。

在其中一些具体示例中，荧光标记为藻红蛋白。

在其中一些实施方式中，按每100mL计，样本稀释液中包括0.006g～0.046g无水磷酸氢二钠、0.332g～0.432g二水磷酸二氢钠、0.28g～0.38g氯化钠和0.09mL～0.11mLProclin300。

优选地，按每100mL计，样本稀释液中包括0.026g无水磷酸氢二钠、0.382g二水磷酸二氢钠、0.33g氯化钠和0.10mL Proclin300。

在其中一些具体示例中，样本稀释液的pH值为7.3～7.5。

优选地，样本稀释液的pH值为7.4。

采用本发明的上述检测自身免疫性肝病的试剂盒，可以实现对多个抗原指标进行定量分析，为临床上自身免疫性肝病的筛查和治疗提供参考。

下面将结合具体实施例和对比例对本发明作进一步说明，但不应将其理解为对本发明保护范围的限制。

本发明下述实施例中使用的各个反应试剂按照如下方法配制：

微球活化液(pH值＝6.0)：取1.06g 2-吗啉乙磺酸、1.00g 2-吗啉乙磺酸钠盐溶于200mL纯水中。

微球包被液A(pH值＝4.5)：取3.7mL浓度为0.2mol/L的醋酸钠溶液与6.3mL浓度为0.3mol/L的醋酸溶液混合即得。

微球包被液B(pH值＝6.05)：取1.15g 2-吗啉乙磺酸、0.95g 2-吗啉乙磺酸钠盐溶于100mL纯水中。

微球包被液C(pH值＝7.4)：取0.12g无水磷酸氢二钠、0.024g二水磷酸二氢钠和0.1mL Proclin300溶于100mL纯水中。

微球包被液D(pH值＝9.6)：取0.12g无水碳酸钠、0.12g碳酸氢钠和0.9g氯化钠溶于100mL纯水中。

微球封闭液A(pH值＝6.5)：取0.546g无水氢二钠、0.420g磷酸二氢钠、5.496g氯化钠、1.0g BSA、0.04g吐温20、6.0g Glycine、0.2mL Proclin300和20mL山羊血清溶于300mL纯水中。

微球封闭液B(pH值＝8.0)：取4.6g浓度为50mM的Tris、0.48g蔗糖、5.19g海藻糖、1.0g BSA、0.04g吐温20、6.0g Glycine、0.18g TritonX-405和0.2mL Proclin300溶于100mL纯水中。

微球封闭液C(pH值＝7.4)：取1.6g浓度为50mM的Tris、0.48g蔗糖、1.0g BSA、1.0gPEG2000和0.2mL Proclin300溶于100mL纯水中。

微球封闭液D(pH值＝7.4)：取1.6g浓度为50mM的Tris、0.48g蔗糖、1.8g海藻糖、1.0g BSA、2.0g PEG6000、0.15g TritonX-100和0.1mL Proclin300溶于100mL纯水中。

微球保存液(pH值＝7.4)：取6.0g浓度为500mM的HEPES、5.0g蔗糖、2.0g海藻糖、0.3g BSA、1.5g甘露醇、0.6g EDTA-Na

样本稀释液(pH值＝7.4)：取0.026g无水氢二钠、0.382g磷酸二氢钠、0.33g氯化钠和0.1mL Proclin300溶于100mL纯水中。

活化剂A：取20mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)与400μL微球活化液涡旋混匀30s。

活化剂B：取20mg 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)与400μL微球活化液涡旋混匀30s。

实施例中使用的羊抗人藻红蛋白溶液购买自索莱宝，货号：K0001G-PE；羊抗人藻红蛋白溶液与样本稀释液按照1:200的比例进行稀释。

实施例1：

(1)荧光编码微球的处理

将荧光编码磁性微球在旋涡混匀仪中震荡30s，上下颠倒混匀5次；4个离心管中各加入100μL荧光编码磁性微球，并将离心管置于磁力架上进行磁性吸附2min，分离弃上清液。

向4个离心管中各加入200μL微球活化液，涡旋15s、超声波清洗剂中超声20s、并磁性吸附2min，分离弃上清；再重复洗涤一次：再向4个试管中分别加入180μL微球活化液，涡旋15s、超声20s；获得4个微球重悬液M。

向4个离心管中各加入10μL活化剂A和10μL活化剂B，涡旋15s、25℃避光反应20min、磁性吸附2min，分离弃上清液。

向4个离心管中分别加入200μL微球包被液A、微球包被液B、微球包被液C和微球包被液D，涡旋15s、超声20s、磁性吸附2min，分离弃上清液；再重复洗涤两次：向4个离心管中分别加入200μL微球包被液A、微球包被液B、微球包被液C或微球包被液D重悬微球，再涡旋15s、超声20s，获得4个微球重悬液N。

向4个离心管中各加入10μg LC-1抗原，涡旋混匀后室温避光反应2h；再磁性吸附2min，分离去上清液。

向4个离心管中各加入300μL微球封闭液A，涡旋15s混匀、超声20s、于25℃避光反应60min。

完成封闭后，向4个离心管中各加入400μL微球保存液，涡旋15s、超声20s、磁性吸附20min，分离去上清液；再重复洗涤2次：向4个离心管中各加入400μL微球保存液重悬微球，涡旋混匀15s；获得4种偶联有LC-1抗原的荧光编码微球；置于2℃～8℃避光保存。

将上述4种偶联有LC-1抗原的荧光编码微球按1：1：1：1混合，获得微球混合液。

(2)信号值检测

将待测样本与上述微球混合液、以及稀释后的羊抗人藻红蛋白溶液用iMutli进行上机测试。待测样本包括3例LC-1阴性样本和2例LC-1阳性样本。各个样本的信号值测试结果如表1所示；信噪比计算结果如表2所示。

表1不同包被液处理荧光编码微球后检测LC-1抗体的信号值

表2不同包被液处理荧光编码微球后检测LC-1抗体的信噪比

由上表可知，使用包被液A处理的荧光编码微球，用于检测LC-1阳性样本时信噪比最高，且本底的信号值最低。

实施例2：

(1)荧光编码微球的处理

将荧光编码磁性微球在旋涡混匀仪中震荡30s，上下颠倒混匀5次，4个离心管中各加入100μL荧光编码磁性微球，并将离心管置于磁力架上进行磁性吸附2min，分离弃上清液。

向4个离心管中各加入200μL微球活化液，涡旋15s、超声波清洗剂中超声20s、并磁性吸附2min，分离弃上清；再重复洗涤一次：再向4个试管中分别加入180μL微球活化液，涡旋15s、超声20s；获得4个微球重悬液M。

向4个离心管中各加入10μL活化剂A和10μL活化剂B，涡旋15s、25℃避光反应20min、磁性吸附2min，分离弃上清液。

向4个离心管中各加入200μL微球包被液B，涡旋15s、超声20s、磁性吸附2min，分离弃上清液；再重复洗涤两次：向4个离心管中各加入200μL微球包被液B重悬微球，再涡旋15s、超声20s，获得4个微球重悬液N。

向4个离心管中各加入10μg ASMA抗原，涡旋混匀后室温避光反应2h；再磁性吸附2min，分离去上清液。

向4个离心管中分别加入300μL微球封闭液A、微球封闭液B、微球封闭液C和微球封闭液D，涡旋15s混匀、超声20s、于25℃避光反应60min。

完成封闭后，向4个离心管中各加入400μL微球保存液，涡旋15s、超声20s、磁性吸附20min，分离去上清液；再重复洗涤2次：向4个离心管中各加入400μL微球保存液重悬微球，涡旋混匀15s；获得4种偶联有ASMA抗原的荧光编码微球；置于2℃～8℃避光保存。

将上述4种偶联有ASMA抗原的荧光编码微球按1：1：1：1混合，获得微球混合液。

(2)信号值检测

将待测样本与上述微球混合液、以及稀释后的羊抗人藻红蛋白溶液用iMutli进行上机测试；设置cutoff值为25000。待测样本包括2例ASMA阴性样本和2例ASMA抗体阳性样本。各个样本的信号值测试结果如表3所示；信噪比计算结果如表4所示。

表3不同封闭液处理荧光编码微球后检测ASMA抗体的信号值

表4不同封闭液处理荧光编码微球后检测ASMA抗体的信噪比

由上表可知，使用封闭液D处理荧光编码微球，能够提升检测LC-1阳性样本的信噪比。

(3)阴阳符合率分析

收集16例待测样本，使用本实施例步骤(1)中4种不同封闭液处理后的微球检测ASMA抗体的信号值，cutoff值为25000；并采用欧蒙间接免疫荧光法对待测样本进行定性检测，计算各个荧光编码微球检测结果与欧蒙间接免疫荧光法检测结果的阴阳符合率；结果如表5所示，其中“-”为ASMA抗体阴性，“+”“++”“+++”为ASMA抗体阳性。

阴性符合率＝欧蒙间接免疫荧光法检测为阴性且定性检测的信号值小于25000的样本数量÷欧蒙间接免疫荧光法检测为阴性的样本数量

阳性符合率＝欧蒙间接免疫荧光法检测为阳性且定性检测的信号值大于25000的样本数量÷欧蒙间接免疫荧光法检测为阳性的样本数量

表5不同封闭液处理荧光编码微球后检测ASMA抗体的符合率

由表5可知，与欧蒙间接免疫荧光法检测的结果相比，使用封闭液D对荧光免疫微球进行处理后，荧光免疫微球上机检测的阳性符合率和阴性符合率均大于85％；检测效率较高。

实施例3：

(1)荧光编码微球的处理步骤与实施例1基本相同，区别仅在于：包被液为微球包被液B、封闭液为微球封闭液A，7个离心管中分别加入10μg的SLA/LP抗原、Ro52抗原、AMA-M2抗原、Sp100抗原、Gp210抗原、LKM-1抗原和CENP-B抗原。

(2)信号值检测

将待测样本与上述微球混合液、以及稀释后的羊抗人藻红蛋白溶液用iMutli进行上机测试；检测结果如下表6～7所示。

表6流式荧光法检测不同抗原指标的信号值

表7流式荧光法检测不同抗原指标的信噪比

由表6～7可知，本发明的微球包被液和微球封闭液，能够用于多种不同的抗原与荧光免疫微球进行偶联，实现对多重指标进行定量检测。

综上，采用本发明的微球包被液和微球封闭液对荧光免疫微球进行处理，使之与抗原偶联，能够实现快速、准确地对多个抗体指标进行定量检测，为临床上自身免疫性肝病的筛查与诊断提供参考，更好地指导临床上的用药需求。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。