获得杀虫活性提高的Vip3Aa突变体的方法及其突变体蛋白

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种通过点突变技术获得杀虫活性升高的Vip3Aa突变体蛋白的方法及由此得到杀虫活性升高的Vip3Aa突变体蛋白。

背景技术

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种重要的昆虫病原菌，来自Bt的杀虫蛋白是合成农药最成功的替代品，在农作物中表达Bt的蛋白可实现对不同害虫的特异性防治。目前Bt作物在全球种植面积已经超过2.022亿公顷。Cry类杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins,ICP)是Bt产生的最大一类的杀虫蛋白，也是Bt作物中表达的最主要的蛋白，在20世纪90年代已经开始商业化应用。但是，Bt作物的可持续利用受到害虫抗性发育的威胁，已经报道了多种Bt的Cry蛋白抗性昆虫。在农作物中表达至少两种在昆虫肠道中具有不同结合位点的Bt蛋白，可实现对目标害虫较持久的防治。因此，寻找与Cry蛋白毒素作用机理不同的杀虫毒素延缓害虫抗性发展迫在眉睫。

营养期杀虫蛋白(Vegetative insecticidal proteins，Vip)是在苏云金杆菌的营养生长阶段产生的对多种鳞翅目害虫具有杀虫活性的蛋白。Vip蛋白被分为Vip、Vpb1、Vpb4和Vpa四类，其中Vip家族中的Vip3A类蛋白应用最为广泛，由于其与Cry蛋白没有序列同源性且具有不同的结合位点，已经被应用于Bt作物中以延缓害虫抗性的发展。

Vip3A类蛋白以约89kDa的原蛋白被分泌，经幼虫摄入后，被中肠蛋白酶水解激活。Vip3A蛋白被水解激活后才具有杀虫活性，且被水解激活前后该蛋白都是以四聚体形式存在。膜穿孔机制是被普遍认可的Vip3A类蛋白的杀虫机制，需要特异性受体参与，即Vip3A蛋白与靶标昆虫中肠刷状缘膜囊泡(Brush border membrane vesicles，BBMVs)上多种特定受体发生结合，最终插入细胞膜形成孔洞，通过形成稳定的离子通道来完成其杀虫作用。Vip3Aa蛋白包括五个结构域，结构域Ⅰ、结构域Ⅱ、结构域Ⅲ、结构域Ⅳ以及结构域Ⅴ，其中结构域Ⅰ至结构域Ⅲ是蛋白四聚化所必需的，结构域Ⅲ包含三个折叠片层，与杀虫晶体蛋白中的Cry类蛋白结构域Ⅱ相似，在Cry蛋白结构域Ⅱ中，连接反向折叠的loops参与受体的识别、结合以及毒素的特异性。因此，基于结构相似功能相似的想法，发明人推测Vip3Aa蛋白的结构域Ⅲ的折叠片层中连接反向折叠的loops(loop4-5、loop9-10、loop14-15)也可能具有相似的功能；氨基酸序列保守性最差的loop12-13也可能跟受体识别有关，进而影响其膜穿孔功能和毒力。

发明内容

针对上述领域中存在的问题，本发明提供了一种通过点突变技术获得杀虫活性提高的Vip3Aa突变体的方法及其突变体，利用该方法获得了杀虫活性提高的Vip3Aa突变体。

本发明采用该方法，对Vip3Aa蛋白进行突变，获得11个突变体，该11个突变体对鳞翅目害虫草地贪夜蛾的杀虫活性有明显的提高。

本发明发现了通过利用反向PCR技术对Vip3Aa的结构域Ⅲ中的loop区域进行全丙氨酸突变，能够找到显著影响该蛋白对鳞翅目害虫草地贪夜蛾的杀虫活性的loop区域，对该loop区域的氨基酸进行点突变能够提高Vip3Aa与草地贪夜蛾中肠BBMVs受体的结合能力，从而增加该蛋白对鳞翅目害虫草地贪夜蛾的杀虫活性。

基于此，一方面，本发明提供了一种通过点突变技术获得杀虫活性提高的Vip3Aa突变体的方法。

所述方法利用点突变技术在基于单点突变的基础上进行了组合突变。

另一方面，本发明提供了杀虫活性提高的Vip3Aa突变体，所述突变体与野生型Vip3Aa蛋白相比，将野生型Vip3Aa蛋白的结构域Ⅲ中的loop区域对应的氨基酸进行了定点突变。

所述定点突变位点包括结构域Ⅲ中的loop4-5或/和loop9-10或/和loop12-13或/和loop14-15对应的氨基酸。

在一个实施方式中，所述Vip3Aa蛋白的结构域Ⅲ为对应于SEQ ID No.1所示序列的第325位到第536位氨基酸。

在一个实施方式中，所述野生型Vip3Aa蛋白结构域Ⅲ中的loop4-5对应于SEQ IDNo.1所示序列的第365位到第367位氨基酸，loop9-10对应于SEQ ID No.1所示序列的第429位到第434位氨基酸，loop12-13对应于SEQ ID No.1所示序列的第468位到第473位氨基酸，loop14-15对应于SEQ ID No.1所示序列的第498位到第501位氨基酸。

在一个实施方式中，所述定点突变位点包括，将结构域Ⅲ中loop区域对应的氨基酸残基利用定点突变技术进行丙氨酸或其它氨基酸突变。

在一个实施方式中，所述突变包括以下a-b任一所述的方式：

a.将对应于结构域Ⅲ中的loop4-5或/和loop9-10或/和loop12-13或/和loop14-15的氨基酸进行任一突变；

b.将a中所述的单点突变进行任意组合突变。

在一个具体的实施方式中，将对应于SEQ ID NO.1所示的第366位S突变为T或L，或/将第470位N突变为K，或/将第501位R突变为A。

在一个具体的实施方式中，将对应于SEQ ID NO.1所示的第366位S突变为T或L，或/将第470位N突变为K，或/将第501位R突变为A进行任意组合突变。

所述鳞翅目害虫为草地贪夜蛾。

本发明中，氨基酸残基用单字母表示，如丙氨酸A，谷氨酸E，谷氨酰胺酸Q，甘氨酸G，组氨酸H，异亮氨酸I，脯氨酰胺酸P，苯丙氨酸F，半胱氨酸C，缬氨酸V，酪氨酸Y，天冬酰胺酸N，蛋氨酸M，天门冬氨酸D，赖氨酸K，丙氨酸A，精氨酸R，亮氨酸L，苏氨酸T，丝氨酸S。

本发明中，在Vip3Aa蛋白中结构域Ⅲ中的loop区域对应的氨基酸中进行定点突变，能够增强鳞翅目害虫中肠BBMVs与Vip3Aa蛋白结合能力，从而提高Vip3Aa蛋白对鳞翅目害虫的杀虫活性。

另一方面，本发明还提供了编码上述Vip3Aa突变体的基因；包含所述基因的载体；包含所述基因或所述载体的宿主细胞。

另一方面，本发明还提供了一种增强鳞翅目害虫中肠BBMVs与Vip3Aa蛋白结合能力的方法，所述方法包括对Vip3Aa蛋白进行突变得到Vip3Aa突变体的步骤；所述方法还包括将Vip3Aa突变蛋白与鳞翅目害虫中肠BBMVs竞争结合的步骤。

所述鳞翅目害虫中肠BBMVs来源于草地贪夜蛾的中肠，在一个具体的实施方式中，利用氯化镁密度梯度离心法(文献Preparation and Partial Characterization ofAmino Acid Transporting Brush Border Membrane Vesicles From the Larval Midgutof the Gypsy Moth(Lymantria dispar))提取草地贪夜蛾BBMVs即为本发明中所使用的BBMVs。

附图说明

图1为Vip3A类蛋白结构域Ⅲ氨基酸序列对比图。

图2为Vip3Aa结构域Ⅲ中的四个特殊loop结构图。

图3为loops全丙氨酸突变体稳定性分析，图中A、B、C、D分别为Vip3Aa、Vip3Aa-loop4-5A、Vip3Aa-loop12-13A和Vip3Aa-loop14-15A的蛋白水解结果。E为Vip3Aa及其突变体经胰蛋白酶处理后66kDa片段的百分比。F是Vip3Aa及其突变体经草地贪夜蛾中肠液处理后的66kDa片段的百分比。与对照组的显著差异显示为*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。

图4为loops全丙氨酸突变体蛋白BBMVs结合能力分析，图中A、B、C、D分别为生物素标记的Vip3Aa、Vip3Aa-loop4-5A、Vip3Aa-loop12-13A和Vip3Aa-loop14-15A与草地贪夜蛾BBMVs的饱和结合。

图5为loops全丙氨酸突变体入胞情况分析图。

图6为Vip3Aa突变体蛋白BBMVs结合能力分析，图中A、B、C、D分别为生物素标记的Vip3Aa、Vip3Aa-S366L、Vip3Aa-S366T和Vip3Aa-R501A与草地贪夜蛾BBMVs的饱和结合。

具体实施方式

本发明通过利用反向PCR技术对Vip3Aa的结构域Ⅲ中的loop区域进行全丙氨酸突变，找到了显著影响该蛋白对鳞翅目害虫草地贪夜蛾的杀虫活性的loop区域，对该loop区域的氨基酸进行点突变能够提高Vip3Aa与草地贪夜蛾中肠BBMVs受体的结合能力，从而增加该蛋白对鳞翅目害虫草地贪夜蛾的杀虫活性。

本发明提供了杀虫活性提高的Vip3Aa突变体，所述突变体与野生型Vip3Aa蛋白相比，将野生型Vip3Aa蛋白的结构域Ⅲ中的loop区域对应的氨基酸进行了定点突变。

所述定点突变的突变位点包括结构域Ⅲ中的loop4-5或/和loop9-10或/和loop12-13或/和loop14-15对应的氨基酸。

所述野生型Vip3Aa蛋白结构域Ⅲ中的loop4-5对应于SEQ ID No.1所示序列的第365位到第367位氨基酸，loop9-10对应于SEQ ID No.1所示序列的第429位到第434位氨基酸，loop12-13对应于SEQ ID No.1所示序列的第468位到第473位氨基酸，loop14-15对应于SEQ ID No.1所示序列的第498位到第501位氨基酸。

所述突变包括以下a-b任一所述的方式：

a.将对应于结构域Ⅲ中的loop4-5或/和loop9-10或/和loop12-13或/和loop14-15的氨基酸进行任一突变；

b.将a中所述的单点突变进行任意组合突变。

所述定点突变位点包括，将结构域Ⅲ中loop区域对应的氨基酸残基利用定点突变技术进行丙氨酸或其它氨基酸突变。

在一个具体的实施方式中，将对应于SEQ ID NO.1所示的第366位S突变为T或L，或/将第470位N突变为K，或/将第501位R突变为A。

在一个具体的实施方式中，将对应于SEQ ID NO.1所示的第366位S突变为T或L，或/将第470位N突变为K，或/将第501位R突变为A进行任意组合突变。

本发明中，氨基酸残基用单字母表示，如丙氨酸A，谷氨酸E，谷氨酰胺酸Q，甘氨酸G，组氨酸H，异亮氨酸I，脯氨酰胺酸P，苯丙氨酸F，半胱氨酸C，缬氨酸V，酪氨酸Y，天冬酰胺酸N，蛋氨酸M，天门冬氨酸D，赖氨酸K，丙氨酸A，精氨酸R，亮氨酸L，苏氨酸T，丝氨酸S。

在本发明中，通过点突变技术获得杀虫活性提高的Vip3Aa突变体的方法，利用点突变技术在基于单点突变的基础上进行了组合突变，该方法包括如下步骤：

S1：分析Vip3Aa蛋白结构域Ⅲ中可能影响其杀虫活性的loop区域。

S2：对S1中分析获得的Vip3Aa蛋白结构域Ⅲ中的loop区域构建全丙氨酸突变体，定位能够显著影响该蛋白杀虫活性的关键loop区域。

S3：将S2中所述的能够显著影响Vip3Aa蛋白杀虫活性的关键loop区域对应的氨基酸进行点突变，并检测突变体蛋白对鳞翅目害虫草地贪夜蛾的杀虫活性，获得活性提高的突变体。

S4：对S3中所述的杀虫活性提高的突变体进行组合突变，并检测组合突变体蛋白对鳞翅目害虫草地贪夜蛾的杀虫活性，获得杀虫活性提高的突变体。

在本发明中，所述鳞翅目害虫中肠BBMVs来源于草地贪夜蛾的中肠，利用氯化镁密度梯度离心法(文献Preparation and Partial Characterization of Amino AcidTransporting Brush Border Membrane Vesicles From the Larval Midgut of theGypsy Moth(Lymantria dispar))提取草地贪夜蛾BBMVs即为本发明中所使用的BBMVs。

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一、Vip3Aa蛋白结构域Ⅲ中loops全丙氨酸突变体的构建

Vip3Aa蛋白的结构表明其结构域Ⅲ与Cry蛋白中的结构域Ⅱ类似，在Cry蛋白结构域Ⅱ中，连接反向折叠的loops参与受体的识别、结合以及毒素的特异性。因此，基于结构相似功能相似的想法，发明人推测Vip3Aa蛋白的结构域Ⅲ的折叠片层中连接反向折叠的loops也可能具有相似的功能，进而影响其膜穿孔功能和毒力，因此，通过对所述loops进行全丙氨酸突变来探究Vip3Aa蛋白结构域Ⅲ是否影响其与受体的结合能力，进而影响它的杀虫活性。本发明中，所采用的野生型Vip3Aa氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

通过发明人前期对Vip3A类蛋白结构域Ⅲ氨基酸序列对比及Vip3Aa蛋白的结构分析(图1和图2所示)，推测结构域Ⅲ中的loop4-5、loop9-10和loop14-15可能参与受体的识别、结合以及毒素的特异性，氨基酸序列保守性最差的loop12-13也可能跟受体识别有关。因此，首先构建了这四个loop区域的全丙氨酸突变体。在本实施方式中，loop4-5对应于SEQID No.1所示序列的第365位到第367位氨基酸，loop9-10对应于SEQ ID No.1所示序列的第429位到第434位氨基酸，loop12-13对应于SEQ ID No.1所示序列的第468位到第473位氨基酸，loop14-15对应于SEQ ID No.1所示序列的第498位到第501位氨基酸。

在本实施例中，利用反向PCR技术构建四个loop全丙氨酸突变体。具体的构建方法是根据待突变的loop区域设计引物(表1所示)，以Vip3Aa基因为模板进行反向PCR，Vip3Aa基因序列如SEQ ID No.2所示。将获得的PCR产物用琼脂糖凝胶凝胶回收试剂盒进行纯化，纯化后的产物利用磷酸化试剂盒进行处理，使DNA分子5’端的-OH基团磷酸化。将2-5μL连接产物加入50μLDH5α感受态细胞中，冰浴30min后于45℃水浴热激45s，立即冰浴2min，并向其中加入600μL的LB培养基，37℃，180rpm摇床培养1h后，取200μL菌液于LB卡那抗性的LB琼脂平板上涂布，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落于5mL卡那抗性LB试管中，37℃培养过夜，吸取菌液进行保菌并测序；将测序正确的菌液提取质粒，并将其转化到BL21(DE3)中表达，将其保存到-80℃中保存。

表1loop全丙氨酸突变体引物

二、Vip3Aa蛋白结构域Ⅲ中loops全丙氨酸突变体的表达与纯化

本发明中的Vip3Aa蛋白及其所有的突变体都采用相同的诱导表达方法。具体如下：

将-80℃中保存的菌种在LB固体培养基(含卡那抗性)上划线，37℃倒置培养12h。挑取单菌落，接种在含有卡那抗性的5ml LB液体培养基中，180rpm，37℃振荡培养过夜。吸取15ml培养过夜的菌液于1L LB液体培养基中(含有卡那抗性)，置于37℃，180rpm下培养过夜，培养至菌液OD600约为1.0左右，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导Vip3Aa蛋白的表达，后置于16℃，180rpm振荡培养过夜。将培养好的菌液在4℃，8000rpm条件下，离心5min，用以收集菌体，后用Lysis buffer(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH 8.0，含有终浓度为1mmol/L的PMSF)悬浮，超声破碎菌体。在4℃，18000rpm条件下，离心40min收集破碎后菌液的上清液，用以纯化Vip3Aa蛋白及突变体。上清液加入亲和层析镍柱中，控制流速，重复循环两次，使用15倍体积的Washing buffer(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)洗柱，注意控制流速。加入5-10ml Elution buffer(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)于镍柱中，静置10min，控制流速，收集洗脱液。将洗脱液吸入透析袋中，置于透析缓冲液(20mM Tris-HCl,300mM NaCl，pH 8.0)中，透析3次，每间隔6h更换一次透析缓冲液。透析结束后，留存于透析袋中含有的蛋白即为本实例所得到的Vip3Aa蛋白及突变体。在本实施例中，loop9-10经全丙氨酸突变后无法表达，未获得相应突变体。

三、Vip3Aa蛋白结构域Ⅲ中loops全丙氨酸突变体杀虫活性测定

本发明中Vip3Aa蛋白及其所有的突变体都采用相同的生测方法，采用24孔板饲料法，以不同浓度的蛋白(50、100、150、300、500、1000和1500ng/g)饲养昆虫。选取草地贪夜蛾的初孵幼虫作为供试昆虫，以添加3mL纯化蛋白透析液的饲料作为阴性对照组。

称取20g人工饲料置于无菌培养皿中，将饲料按压至糊状，平铺于无菌培养皿中；用移液枪吸取配置好的待测试样品混合溶液3mL，均匀吹打到饲料表面，将蛋白与饲料充分混匀，平铺于平皿中，室温放置3h，将饲料中多余的水分蒸发；用药匙将饲料均匀的分装到24孔培养板中，并使饲料贴向一侧，可稍微压实；注意每次不同种类蛋白分装时，需要对药匙进行消毒处理。先将幼虫从培养箱中取出，以白纸打底，用毛笔挑取个体活跃的一日龄幼虫接于24孔培养板内，每孔一头；接好幼虫后用24孔板的顶盖盖好，再用4根橡皮筋将其固定住，防止幼虫逃跑；将24孔培养板置于温度(27±1)℃，RH(65±5)％，光照周期16L：8D的养虫室中；定期观察饲料的干湿情况、培养箱的光照周期是否正常、条件是否适宜，培养7天后统计测试昆虫的存活和死亡情况，整理好的数据用于计算死亡率。每个蛋白连续重复三次，比较不同Vip3Aa突变体蛋白的杀虫活性，结果如表2所示。

表2Vip3Aa蛋白及其loop全丙氨酸突变体对草地贪夜蛾的杀虫活性

四、Vip3Aa蛋白结构域Ⅲ中loop全丙氨酸突变体的稳定性分析

向蛋白中加入10％胰蛋白酶于37℃条件下孵育不同时间段(10min,20min,30min,1h)，使用不同比例(4％，6％，8％，10％)的草地贪夜蛾中肠汁于37℃条件下处理突变体蛋白1h，通过SDS-PAGE分析突变体蛋白的敏感性及稳定性(图3)。结果表明，突变体蛋白与Vip3Aa蛋白的蛋白水解模式相似，随着胰蛋白酶水解时间的延长或中肠汁浓度的增加，蛋白水解模式没有发生变化。然而，与野生型Vip3Aa相比，突变体蛋白的活化带比例均有不同程度的下降，这表明loop4-5或loop12-13或loop14-15中的所有残基都被丙氨酸取代可能会影响Vip3Aa蛋白在草地贪夜蛾中肠中的稳定性。

利用氯化镁密度梯度离心法提取草地贪夜蛾BBMVs，利用商品化生物素标记试剂盒标记Vip3Aa蛋白突变体，利用Elisa方法检测突变体与草地贪夜蛾BBMVs的竞争结合情况(图4)。结果表明，与Vip3Aa-loop12-13A不同，BBMVs与Vip3Aa-loop4-5A(128.32±21.11nM)或Vip3Aa-loop14-15A(144.25±18.18nM)结合的平解离常数(Ka)明显大于与Vip3Aa结合的平衡解离常数(94.04±8.93nM)。

用带红色荧光蛋白的突变体处理草地贪夜蛾Sf9细胞4-6h，利用荧光显微镜检测Sf9细胞膜上的红色荧光，通过红色荧光强度反映突变体与草地贪夜蛾细胞膜的结合情况(图5)。在用Vip3Aa-loop-5A或Vip3Aa-loop14-15A处理的细胞中，可以观察到大部分Vip3Aa-RFP(荧光蛋白)点，而红色荧光的点则减少了。这些结果表明，Vip3Aa与其受体之间的相互作用可能与结构域Ⅲ中的loop4-5或loop14-15有关。

实施例2

一、基于关键loops的Vip3Aa蛋白杀虫活性的定向改造

分析关键loops中暴露在分子表面的氨基酸，明确可能影响杀虫活性的氨基酸位点，利用商品化定点突变试剂盒构建突变体，突变体引物如表3所示。

表3点突变引物

以Vip3Aa蛋白表达质粒为模板进行PCR扩增，经过DMT酶处理、大肠转化和DNA测序验证获得相应突变体。

二、Vip3Aa突变体的表达与纯化及杀虫活性测定

突变体的表达与纯化方法与实施例1中所述方法一致。

将纯化后的关键氨基酸突变体蛋白按设置的浓度梯度分别稀释成终体积为3mL的溶液。以空白饲料及添加20mmol/LTris-HCL透析液的饲料为阴性对照，选取草地贪夜蛾初孵幼虫作为供试昆虫。培养7天后统计试虫的存活和死亡情况，整理好数据用于计算死亡率及LC50，结果如表4所示。

表4定向改造突变体对草地贪夜蛾的杀虫活性

Vip3Aa定向改造突变体的杀虫活性相较于野生型Vip3Aa都显著提高，其中以Vip3Aa-S366T，Vip3Aa-S366L和Vip3Aa-R501A最为明显，分别提高了2.6倍，3.3倍和2.5倍。

实施例3

Vip3Aa突变体与草地贪夜蛾BBMVs的竞争结合分析

将实施例2中所获得的杀虫活性显著提高的三个突变体及利用商品化生物素标记试剂盒标记，利用Elisa方法检测突变体与草地贪夜蛾BBMVs的竞争结合情况(图6)。BBMVs与Vip3Aa-S366T，Vip3Aa-S366L和Vip3Aa-R501A结合的平解离常数(Ka)分别为66.15±8.73nM、60.95±9.25nM和79.82±10.01nM。这些结果表明，毒性增强的Vip3Aa突变体与草地贪夜蛾BBMVs的结合力大于Vip3Aa。

实施例4

Vip3Aa单点突变体的组合突变体的表达与纯化及杀虫活性测定

对通过点突变技术获得的杀虫活性提高的突变体进行任意组合突变，将构建好的突变体进行表达和纯化，并检测它们的杀虫活性，结果如表5所示。

表5Vip3Aa组合突变体对草地贪夜蛾的杀虫活性

Vip3Aa组合突变体的杀虫活性相较于野生型Vip3Aa都有所提高，其中以Vip3Aa-S366T，Vip3Aa-S366L/N470K和Vip3Aa-S366T/N470K最为明显，分别提高了4.4倍和3.7倍。