一种AQP9抑制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药技术领域中的肝癌肿瘤免疫治疗技术领域，尤其涉及一种AQP9抑制剂及其制备方法与应用。

背景技术

系统化疗是肿瘤治疗的基础方案，但是化疗药物缺乏靶向性，其次大多数化疗药物在肝癌中的治疗效果不佳，目前肝癌系统化疗较为有效的药物有阿霉素、5-氟尿嘧啶和顺铂。但这些药物对肝癌的缓解效果有限。肿瘤细胞中有多种基因表达异常，可能与肿瘤的发展、转移等症状密切相关，而肿瘤靶向药物的发现能够改善化疗药物靶向性差的现状，目前肝癌中常用的有索拉非尼、瑞格替尼、乐伐替尼等，但经过十多年的临床使用情况看，整体呈现有效率低，疗效差等情况。

近年来研究发现，肿瘤微环境中的免疫细胞的改变，对肝癌的发生和发展具有关键作用，使得肝癌免疫治疗逐渐成为了目前的研究热点，其中应用最广泛的是PD-1阻断剂，但是肝癌患者中有免疫响应的人群有限。为了达到更好的治疗效果，联合免疫治疗成为新的治疗策略。但是肝癌倾向于免疫耐受，也为肝癌的联合免疫治疗带来了挑战，这可能跟某些重要基因的表达异常有关，因此寻找肝癌中重要的免疫相关关键基因，开发新型特异的靶向治疗药物对于肝癌的联合免疫治疗至关重要。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出了一种AQP9抑制剂及其制备方法与应用。本发明的AQP9抑制剂不仅可以单独用于筛选或制备治疗实体瘤的药物，尤其是用于筛选或制备治疗肝癌的药物，还可以联合PD-1阻断剂用于筛选或制备治疗实体瘤的药物，尤其是用于筛选或制备治疗肝癌的药物。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供一种AQP9抑制剂，其为1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-基)-3-(4-氟苯基)脲，其结构式为

本发明提供一种所述的AQP9抑制剂的制备方法，苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-胺与异氰酸对氟苯酯通过缩合反应制备所述AQP9抑制剂。

进一步地，所述AQP9抑制剂的制备方法包括以下步骤：

将苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-胺和无水二氯甲烷混合，在氮气保护下，逐滴加入异氰酸对氟苯酯，搅拌得到悬浊液，浓缩，洗涤固体，得到粗产物，用四氢呋喃溶解所述粗产物，蒸发浓缩，柱层析，得到的固体即为所述AQP9抑制剂。

进一步地，在所述AQP9抑制剂的制备方法中，所述苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-胺和异氰酸对氟苯酯的摩尔比为11∶12。

进一步地，所述AQP9抑制剂的制备方法如下：

于100毫升干燥的圆底烧瓶中，加入苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-胺(500mg，3.3mmol)和无水二氯甲烷(15mL)，在室温和氮气保护下，逐滴加入异氰酸对氟苯酯(0.41mL，3.6mmol)，室温下继续搅拌24小时，得到悬浊液。将该液体浓缩，用石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1(体积比)的混合溶液洗涤固体8到10次，每次洗涤时搅拌、静置片刻后，用注射器吸去上清液，最终所得固体即为含杂质较少的粗产物，随后用四氢呋喃溶解粗产物，拌入硅胶后用旋转蒸发仪浓缩，干法上样进行柱层析，淋洗剂选择石油醚∶四氢呋喃＝3∶1到5∶1(体积比)，得到白色固体，即为所述AQP9抑制剂。

本发明还提供所述的AQP9抑制剂在筛选治疗实体瘤的药物中的应用。

本发明还提供所述的AQP9抑制剂在制备治疗实体瘤的药物中的应用。

本发明还提供所述的AQP9抑制剂在筛选治疗肝癌药物中的应用。

本发明还提供所述的AQP9抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用。

本发明还提供所述的AQP9抑制剂联合PD-1阻断剂在筛选治疗肝癌药物中的应用。

本发明还提供所述的AQP9抑制剂联合PD-1阻断剂在制备治疗肝癌药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

1.本发明首次合成的1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-基)-3-(4-氟苯基)脲可以作为AQP9抑制剂，可以明显抑制肿瘤增殖；

2.本发明的AQP9抑制剂能够提高肿瘤微环境中免疫细胞的数量,并且能够影响外周免疫系统，从而实现抗肿瘤的治疗效果；

3.本发明使用AQP9抑制剂联合PD-1阻断剂治疗肝癌，发现AQP9抑制剂可以显著增强PD-1阻断剂的治疗疗效,具有明显的抗肿瘤疗效。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为21个肝癌患者样本的单细胞测序数据，其中A为21个HCC肝癌患者样本单细胞测序数据的获取流程图，B为根据单细胞测序数据分析得到的不同的细胞分类，C为malignant cell中CD4

图2中A为1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-基)-3-(4-氟苯基)脲的结构式，B为1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-基)-3-(4-氟苯基)脲的谱图；

图3为AQP9抑制剂对小鼠肝癌生长及肿瘤免疫微环境的影响，其中A为20mg/kg单剂组和40mg/kg单剂组对肿瘤生长速度的影响，B为对照组和40mg/kg单剂组的小鼠的肿瘤中CD45

图4为AQP9抑制剂联合抗PD-1抗体对小鼠肝癌生长及免疫微环境的影响，其中A为小鼠给药的流程图，B为对照组、40mg/kg单剂组、抗PD-1抗体组和联合治疗组对肿瘤生长速度的影响，C为对照组、40mg/kg单剂组、抗PD-1抗体组和联合治疗组治疗结束时小鼠肿瘤重量的统计结果，D为对照组、40mg/kg单剂组、抗PD-1抗体组和联合治疗组治疗结束时小鼠的肿瘤拍照记录的结果，E为对照组、40mg/kg单剂组、抗PD-1抗体组和联合治疗组治疗结束时小鼠的引流淋巴结(dLN)中细胞数量的统计结果，F为对照组、40mg/kg单剂组、抗PD-1抗体组和联合治疗组的小鼠的治疗结束时引流淋巴结的拍照记录的结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明实施例中的室温指的是25±2℃。

本发明实施例所用各原料均为通过市售购买得到。

本发明实施例中所用21个肝癌样本的单细胞测序数据分析：

图1中A通过分析21个肝癌患者样本的单细胞测序数据，使用聚类分析和细胞类型识别算法，对单细胞表达矩阵进行细胞分类和亚型识别。图1中B将细胞分类成如图所示的种类包括：恶性肿瘤细胞(malignant cell)、T细胞、B细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM,tumor-associated macrophage)等等。图1中C分析malignant cell中CD4+T浸润水平，蓝色区域代表CD4+T浸润低，红色区域代表CD4+T浸润高。图1中D分析malignant cell中CD8+T浸润水平，蓝色区域代表CD8+T浸润低，红色区域代表CD8+T浸润高。图1中E分析AQP9在malignantcell中的表达水平，红色区域代表AQP9表达水平高。

以下通过实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例1

如图2所示，根据AQP9蛋白的结构特性，本发明使用苯并噻二唑胺与异氰酸对氟苯酯发生缩合反应，得到含脲结构的AQP9抑制剂药物分子，即1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-基)-3-(4-氟苯基)脲，具体方法如下：

于100毫升干燥的圆底烧瓶中，加入苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-胺(500mg，3.3mmol)和无水二氯甲烷(15mL)，在室温和氮气保护下，逐滴加入异氰酸对氟苯酯(0.41mL，3.6mmol)，室温下继续搅拌24小时，得到悬浊液。将该液体浓缩，用石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1(体积比)的混合溶液洗涤固体8到10次，每次洗涤时搅拌、静置片刻后，用注射器吸去上清液，最终所得固体即为含杂质较少的粗产物，随后用四氢呋喃溶解粗产物，拌入硅胶后用旋转蒸发仪浓缩，干法上样进行柱层析，淋洗剂选择石油醚∶四氢呋喃＝4∶1(体积比)，得到白色固体579mg，经核磁共振氢谱证明其为产物1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-基)-3-(4-氟苯基)脲(AQP9抑制剂)，产率为61％，纯度为98％以上。

以下测试方法中测试物为实施例1合成的AQP9抑制剂，即1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-基)-3-(4-氟苯基)脲。

1.AQP9抑制剂的抗肿瘤活性检测

试验用细胞：小鼠肝癌细胞Hepa1-6，小鼠为清洁级C57BL/6J小鼠。

试验方法

体重18～22g的雄性C57BL/6J小鼠，在Day0时皮下注射Hepa1-6，构建小鼠肝癌模型，在Day6时小鼠肿瘤平均大小为200mm

溶液配置如下：

抑制剂母液：40mg药物粉末加250μLDMSO(二甲基亚砜)溶解，浓度160mg/mL。

对照组：10μLDMSO加100μL PEG300+90μL无菌水。

20mg/kg单剂组：5μL抑制剂母液加100μL PEG300+95μL无菌水。

40mg/kg单剂组：10μL抑制剂母液加100μL PEG300+90μL无菌水。

药物治疗后，每天检测肿瘤的生长状态，并观察接受药物治疗的小鼠的状态。在整个实验过程中，每天测量小鼠的肿瘤体积进行统计分析，如图3中A所示，使用20mg/kg或是40mg/kg药物的小鼠，肿瘤生长速度明显变慢，证明此抑制剂可以明显抑制肿瘤的生长。

2.AQP9抑制剂影响肿瘤内免疫微环境的流式细胞检测

在第10天时，将上述1.药物的抗肿瘤活性检测中的所有小鼠颈椎脱臼处死，喷洒酒精后，分离皮下肿瘤、引流淋巴结。

将小鼠肿瘤样本用无菌剪刀剪碎，使用添加了CollegaseIV(购自Worthington，LS004188-1gm)、DNaseI(购自roche，11284932001)的消化液，置于37℃的3D摇床360°旋转消化45min，通过70μm滤网过滤制备单细胞悬液。将单细胞悬液转移到新的离心管，补加PBS溶液，离心后弃上清，PBS洗涤后再次离心。再加PBS重悬，取100μL到流式管中，加对应的流式抗体冰上孵育染色30min，PBS洗涤再次离心用200μL PBS溶液重悬进行流式细胞检测分析。如图3中B-D所示，统计对照组肿瘤和40mg/kg单剂组肿瘤中的免疫细胞数量。图3中B显示使用40mg/kg药物的小鼠的肿瘤中CD45+T细胞的数量明显升高。图3中C显示使用40mg/kg药物的小鼠的肿瘤中CD8+T细胞的数量明显升高。图3中D和图3中E显示使用40mg/kg药物的小鼠引流淋巴结中的CD4+T和CD8+T细胞的数量明显升高。

3.AQP9抑制剂(即1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-基)-3-(4-氟苯基)脲)联合PD1阻断剂对肿瘤增殖的影响

体重18～22g的雄性C57BL/6J小鼠，Day0开始构建C57BL/6J小鼠的Hepa1-6皮下肝癌模型，在Day7时小鼠肿瘤平均大小为200mm

其中：

40mg/kg单剂组：每只小鼠腹腔注射40mg/kg的药物，给药频次为每天给药一次。

抗PD-1抗体组：每只小鼠腹腔注射0.5mg/kg的PD-1阻断剂单剂，给药频次为每两天给药一次。

联合治疗组：每只小鼠腹腔注射40mg/kg的药物，给药频次为每天给药一次；腹腔注射0.5mg/kg的PD-1阻断剂单剂，给药频次为每两天给药一次。

对照组：每只小鼠腹腔注射PBS(200μL/只/次)作为对照，给药频次为每天给药一次。

药物治疗后，每天检测肿瘤的生长状态，并观察接受药物治疗的小鼠的生活状态。在给药开始后，每天测量小鼠的肿瘤体积。

如图4中B、C、D所示，抗PD-1抗体组与40mg/kg单剂组相对于对照组，肿瘤明显被抑制，证明PD-1阻断剂和40mg/kg单剂单独使用都具有抑制肿瘤增殖的效果。但是联合治疗组的肿瘤抑制效果相对于两种单剂组的抑制效果更明显，证明联合治疗能够具有更强的抑制肿瘤增殖的能力。如图4中E、F，联合治疗组小鼠的引流淋巴结的细胞数和体积都发生了明显的增大，证明AQP9抑制剂能够调动外周免疫系统，提高小鼠的抗肿瘤免疫水平，从而抑制肿瘤增殖。

以上结果证明：

本发明首次合成的1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-基)-3-(4-氟苯基)脲可以作为AQP9抑制剂，可以用于筛选或制备用于治疗实体瘤的药物中，可以明显提高肿瘤微环境中免疫细胞的数量，且能够影响外周免疫系统。

本发明首次合成的1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-基)-3-(4-氟苯基)脲可以作为AQP9抑制剂，可以用于筛选或制备用于治疗肝癌的药物中。

本发明首次合成的1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-基)-3-(4-氟苯基)脲可以作为AQP9抑制剂，联合PD-1阻断剂可以用于筛选或制备用于治疗肝癌的药物中，1-(苯并[d][1,2,3]噻二唑-6-基)-3-(4-氟苯基)脲可以显著增强PD-1阻断剂的治疗疗效，具有明显的抗肿瘤疗效。

以上，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。