一种尿微量白蛋白检测试剂盒及其制备

技术领域

本发明涉及一种尿微量白蛋白检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

尿微量白蛋白(mALB)是指在尿液中出现微量白蛋白。白蛋白是一种血液中正常蛋白质，人体代谢正常情况下，尿液中白蛋白极少，每升尿液白蛋白不超过20mg，所以叫微量白蛋白。但糖尿病肾病、高血压肾病等早期肾脏受损和心血管疾病并发症等发生时会造成肾脏固有细胞损伤，使肾脏固有细胞结构及功能发生变化而导致白蛋白含量在尿液中升高。尿微量白蛋白见于糖尿病肾病、高血压、妊娠子痫前期，是肾损伤的早期敏感指标。

现有技术中测定尿微量白蛋白的方法主要为免疫分析法，即用抗原和抗体特征性反应来对抗原或抗体进行定性和定量测定的分析方法。按标记物种类的不同，免疫分析法主要可分为：放射性免疫分析法、酶免疫分析法、发光免疫分析法、荧光免疫分析法。荧光免疫分析是指用荧光分子对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。与其他三种免疫法相比，荧光免疫法具有许多优点：①选择性好；②具有多种测定参数(如荧光各向异性、荧光寿命、荧光量子产率、荧光激发波长、发射波长等)；③灵敏度高；④具有多种检测技术和方法(如导数荧光、同步荧光、荧光偏振、荧光动力学分析法、时间分辨荧光分析法等)。因此可依据实际测定条件的不同加以选择，具有适用性强、选择性好、线性范围较宽的特点，是一种简便实用的分析技术。

目前荧光免疫分析最常用的标记物是有机染料。然而有机染料存在很多缺陷，如大多数荧光试剂存在光漂白现象，导致荧光信号不稳定；荧光试剂有一定的毒副作用；荧光染料的激发光谱比较窄，很难同时激发多种组分，而且其荧光光谱较宽，分布不对称，较难区分不同探针分子的荧光，不能同时检测多种组分；此外，传统的荧光标记方法，只能在生物分子的活性基团上连接少数荧光分子，分析灵敏度较低。因此，研究新型的、高灵敏度、稳定性好的荧光探针是当前荧光免疫分析领域研究的热点。

发明内容

本发明目的是针对现有技术中传统的荧光标记方法，只能在生物分子的活性基团上连接少数荧光分子，分析灵敏度较低的不足，提供一种羧基修饰铕纳米微球荧光免疫层析技术，可实现高灵敏度、可准确定量、水溶性优、简便快捷的定量检测尿微量白蛋白的试剂盒及方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种尿微量白蛋白检测试剂盒，包括尿微量白蛋白检测卡、尿微量白蛋白稀释液、尿微量白蛋白芯片：

所述尿微量白蛋白检测卡包括卡壳和试纸条；

所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC底板，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次粘贴于PVC底板上；

所述结合垫含有荧光标记的尿微量白蛋白抗体和荧光标记的羊抗鸡IgY抗体；

所述硝酸纤维素膜上依次设置有检测线和质控线，检测线、质控线相互平行，间距为3-5mm，检测线靠近加样孔；所述检测线包被有尿微量白蛋白单克隆抗体，质控线包被有鸡IgY抗体。

作为优选，所述检测试纸条的制备方法如下：

(1)荧光纳米微球的制备

向三口烧瓶中依次加入50ml无水乙醇，3ml氨水，1ml水，加热至40℃后，恒温，搅拌，迅速加入1.5ml正硅酸乙酯，反应7h后，再加入1ml正硅酸乙酯，继续反应15-20h后；高速离心，分别用乙醇和水洗三次，在水中复溶后，得到二氧化硅纳米粒，记为产物I；

称取1mmol Eu

称取4mmo1苯甲酰丙酮于20ml乙醇中溶解，在60℃搅拌下，将产物II缓慢滴加入苯甲酰丙酮的乙醇溶液中，用NaOH调pH至6-7，出现大量沉淀；加热回流搅拌30min后，滴加10ml含有2mmol邻菲罗琳的乙醇溶液继续搅拌1h，干燥，得到产物III；

称取1mmol水杨酸、1mmol三乙胺溶于15ml二氯甲烷，1mmol丙烯酰氯溶于3ml二氯甲烷并置于恒压滴液漏斗，控制滴速，冰浴，1h内滴完，搅拌6-12h；用20％稀盐酸洗涤两次，饱和NaOH溶液洗涤两次，去离子水洗涤三次，分液，取有机相，干燥，减压蒸馏，得产物IV；

称取25mg产物IV、3.5-11mg丙烯酸溶于5ml二氯甲烷中，搅拌，混合均匀，加入0.5mg AIBN，N

将产物III溶于30ml DMF，称取2mmol产物V溶于10ml DMF中，用1M NaOH水溶液调pH至6-7，在50-60℃水浴锅中搅拌24-48h，出现沉淀，静置24h，抽滤，析出沉淀，过滤并用少量的乙醇反复洗涤后，干燥，得荧光纳米微球，即目标产物；

(2)荧光纳米微球的活化

将100μl荧光纳米微球置于1.5ml EP管中，加入100μl 1mg/ml的EDC及100μl0.6mg/ml的NHS，37℃活化60min，以14000rpm的高速离心，去除剩余的EDC和NHS，用水洗涤三次，得目标产物；

(3)荧光标记的尿微量白蛋白抗体的制备

取100μl 20μg/ml的尿微量白蛋白抗体于37℃与已经活化的荧光纳米粒孵育90min，加入100μl 1％BSA，37℃孵化60min封闭剩余活性基团，14000rpm的高速离心去上清，避光保存，得目标产物；

(4)荧光标记的羊抗鸡IgY抗体的制备

取100μl 20μg/ml的羊抗鸡IgY抗体于37℃与已经活化的荧光纳米粒孵育90min，加入100μl 1％BSA，37℃孵化60min封闭剩余活性基团，14000rpm的高速离心去上清，避光保存，得目标产物；

(5)硝酸纤维素膜的制备

分别用缓冲液将尿微量白蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线、检测线间隔3-5mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜，得目标产物；

(6)在PVC底板上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述检测试纸条。

作为优选，所述检测试纸条固定在卡壳上，试纸表面用卡面压紧，且卡面在对应样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜的部分分别预留加样孔和观察窗。

作为优选，所述尿微量白蛋白稀释液为磷酸盐缓冲液。

作为优选，所述尿微量白蛋白芯片为同一批次试剂标准曲线信息，且不可互换使用。

本发明涉及利用所述试剂盒的检测尿微量白蛋白的方法，测试应在室温18-30℃下进行，所述方法包括：

(1)打开仪器，插入与试剂批号相同的芯片；

(2)用移液器吸取10μL样本，加入到稀释液中，上下颠倒混匀；

(3)打开铝箔袋，取出检测卡，水平放置于桌面上；

(4)用移液器吸取稀释后混匀的样本100μL，加入到检测卡的加样孔中；

(5)在配套仪器上选择样本类型“尿液”；

(6)即时测试：待室温反应10min后，将检测卡放入仪器卡槽中，选择“即时测试”模式，点击“测试”；标准测试：将检测卡放入仪器卡槽中，选择“标准测试”模式，点击“测试”，仪器自动计时，计时结束后，自动测试并显示结果；

(7)点击“打印”，可打印检测结果报告。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供了一种尿微量白蛋白检测试剂盒，其中检测试纸条采用羧基修饰铕纳米微球荧光免疫层析技术，具有荧光寿命长，通常在1ms以上；Stokes位移大，激发光为365nm，发射光为615nm，有利于克服激发光导致的散乱光对测定的干扰；激发发光谱较宽，并具有很窄的发射光光谱，有利于进一步降低荧光本底，分辨率高。最终有利于提高试剂的灵敏度与特异性，提高产品的性能。

(2)本发明提供了一种尿微量白蛋白检测试剂盒，首先采用合成高质量的水溶性量子点系列产品作为荧光标记材料引入免疫层析系统，来对目标物进行定量分析，具有荧光强度强，稳定性好，生物相容性好等优势。第二，基于荧光免疫分析POCT平台进行检测及数据分析，具有多通道/多联卡检测、信息扫码、自动丢卡、自动曲线拟合、测试速度快等特点。而且周转快、不需要样本处理、随时随地检测，操作要求低、医疗成本低。第三，实现尿微量白蛋白(MAU)的定量检测，准确度在85-115％范围内，线性在[5,200]μg/mL范围内，相关系数(r)不低于0.990；批内变异系数(CV)不高于10.0％，空白限不大于2.5μg/mL。

具体实施方式：

以下结合实施例对本发明进行详细说明。但应理解，以下实施例仅是对本发明实施方式的举例说明，而非是对本发明的范围限定。

实施例1

一种尿微量白蛋白检测试剂盒，包括尿微量白蛋白检测卡、尿微量白蛋白稀释液、尿微量白蛋白芯片：

尿微量白蛋白检测卡包括卡壳和试纸条；

试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC底板，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次粘贴于PVC底板上；

结合垫含有荧光标记的尿微量白蛋白抗体和荧光标记的羊抗鸡IgY抗体；

硝酸纤维素膜上依次设置有检测线和质控线，检测线、质控线相互平行，间距为3-5mm，检测线靠近加样孔；所述检测线包被有尿微量白蛋白单克隆抗体，质控线包被有鸡IgY抗体。

羧基修饰铕纳米微球荧光检测试纸条的制备方法如下：

(1)荧光纳米微球的制备

向三口烧瓶中依次加入50ml无水乙醇，3ml氨水，1ml水，加热至40℃后，恒温，搅拌，迅速加入1.5ml正硅酸乙酯，反应7h后，再加入1ml正硅酸乙酯，继续反应15h后；高速离心，分别用乙醇和水洗三次，在水中复溶后，得到二氧化硅纳米粒，记为产物I；

称取1mmol Eu

称取4mmo1苯甲酰丙酮于20ml乙醇中溶解，在60℃搅拌下，将产物II缓慢滴加入苯甲酰丙酮的乙醇溶液中，用NaOH调pH至6，出现大量沉淀。加热回流搅拌30min后，滴加10ml含有2mmol邻菲罗琳的乙醇溶液继续搅拌1h，干燥，得到产物III；

称取1mmol水杨酸、1mmol三乙胺溶于15ml二氯甲烷，1mmol丙烯酰氯溶于3ml二氯甲烷并置于恒压滴液漏斗，控制滴速，冰浴，1h内滴完，搅拌6h；用20％稀盐酸洗涤两次，饱和NaOH溶液洗涤两次，去离子水洗涤三次，分液，取有机相，干燥，减压蒸馏，得产物IV；

称取25mg产物IV、7.5mg丙烯酸溶于5ml二氯甲烷中，搅拌，混合均匀，加入0.5mgAIBN，N

将产物III溶于30ml DMF，称取2mmol产物V溶于10ml DMF中，用1M NaOH水溶液调pH至7，在50℃水浴锅中搅拌48h，出现沉淀，静置24h，抽滤，析出沉淀，过滤并用少量的乙醇反复洗涤后，干燥，得荧光纳米微球，即目标产物；

(2)荧光纳米微球的活化

将100μl荧光纳米微球置于1.5ml EP管中，加入100μl 1mg/ml的EDC及100μl0.6mg/ml的NHS，37℃活化60min，以14000rpm的高速离心，去除剩余的EDC和NHS，用水洗涤三次，得目标产物；

(3)荧光标记的尿微量白蛋白抗体的制备

取100μl 20μg/ml的尿微量白蛋白抗体于37℃与已经活化的荧光纳米粒孵育90min，加入100μl 1％BSA，37℃孵化60min封闭剩余活性基团，14000rpm的高速离心去上清，避光保存，得目标产物；

(4)荧光标记的羊抗鸡IgY抗体的制备

取100μl 20μg/ml的羊抗鸡IgY抗体于37℃与已经活化的荧光纳米粒孵育90min，加入100μl 1％BSA，37℃孵化60min封闭剩余活性基团，14000rpm的高速离心去上清，避光保存，得目标产物；

(5)硝酸纤维素膜的制备

分别用缓冲液将尿微量白蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线、检测线间隔3-5mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜，得目标产物；

(6)在PVC底板上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述检测试纸条。

上述检测试纸条固定在卡壳上，试纸表面用卡面压紧，且卡面在对应样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜的部分分别预留加样孔和观察窗。

上述尿微量白蛋白稀释液为磷酸盐缓冲液。

上述尿微量白蛋白芯片为同一批次试剂标准曲线信息，且不可互换使用。

实施例2

一种尿微量白蛋白检测试剂盒，包括尿微量白蛋白检测卡、尿微量白蛋白稀释液、尿微量白蛋白芯片：

尿微量白蛋白检测卡包括卡壳和试纸条；

试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC底板，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次粘贴于PVC底板上；

结合垫含有荧光标记的尿微量白蛋白抗体和荧光标记的羊抗鸡IgY抗体；

硝酸纤维素膜上依次设置有检测线和质控线，检测线、质控线相互平行，间距为3-5mm，检测线靠近加样孔；所述检测线包被有尿微量白蛋白单克隆抗体，质控线包被有鸡IgY抗体。

羧基修饰铕纳米微球荧光检测试纸条的制备方法如下：

(1)荧光纳米微球的制备

向三口烧瓶中依次加入50ml无水乙醇，3ml氨水，1ml水，加热至40℃后，恒温，搅拌，迅速加入1.5ml正硅酸乙酯，反应7h后，再加入1ml正硅酸乙酯，继续反应20h后；高速离心，分别用乙醇和水洗三次，在水中复溶后，得到二氧化硅纳米粒，记为产物I；

称取1mmol Eu

称取4mmo1苯甲酰丙酮于20ml乙醇中溶解，在60℃搅拌下，将产物II缓慢滴加入苯甲酰丙酮的乙醇溶液中，用NaOH调pH至7，出现大量沉淀。加热回流搅拌30min后，滴加10ml含有2mmol邻菲罗琳的乙醇溶液继续搅拌1h，干燥，得到产物III；

称取1mmol水杨酸、1mmol三乙胺溶于15ml二氯甲烷，1mmol丙烯酰氯溶于3ml二氯甲烷并置于恒压滴液漏斗，控制滴速，冰浴，1h内滴完，搅拌12h；用20％稀盐酸洗涤两次，饱和NaOH溶液洗涤两次，去离子水洗涤三次，分液，取有机相，干燥，减压蒸馏，得产物IV；

称取25mg产物IV、3.5mg丙烯酸溶于5ml二氯甲烷中，搅拌，混合均匀，加入0.5mgAIBN，N

将产物III溶于30ml DMF，称取2mmol产物V溶于10ml DMF中，用1M NaOH水溶液调pH至6，在60℃水浴锅中搅拌24h，出现沉淀，静置24h，抽滤，析出沉淀，过滤并用少量的乙醇反复洗涤后，干燥，得荧光纳米微球，即目标产物；

(2)荧光纳米微球的活化

将100μl荧光纳米微球置于1.5ml EP管中，加入100μl 1mg/ml的EDC及100μl0.6mg/ml的NHS，37℃活化60min，以14000rpm的高速离心，去除剩余的EDC和NHS，用水洗涤三次，得目标产物；

(3)荧光标记的尿微量白蛋白抗体的制备

取100μl 20μg/ml的尿微量白蛋白抗体于37℃与已经活化的荧光纳米粒孵育90min，加入100μl 1％BSA，37℃孵化60min封闭剩余活性基团，14000rpm的高速离心去上清，避光保存，得目标产物；

(4)荧光标记的羊抗鸡IgY抗体的制备

取100μl 20μg/ml的羊抗鸡IgY抗体于37℃与已经活化的荧光纳米粒孵育90min，加入100μl 1％BSA，37℃孵化60min封闭剩余活性基团，14000rpm的高速离心去上清，避光保存，得目标产物；

(5)硝酸纤维素膜的制备

分别用缓冲液将尿微量白蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线、检测线间隔3-5mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜，得目标产物；

(6)在PVC底板上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述检测试纸条。

上述检测试纸条固定在卡壳上，试纸表面用卡面压紧，且卡面在对应样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜的部分分别预留加样孔和观察窗。

上述尿微量白蛋白稀释液为磷酸盐缓冲液。

上述尿微量白蛋白芯片为同一批次试剂标准曲线信息，且不可互换使用。

实施例3

一种尿微量白蛋白检测试剂盒，包括尿微量白蛋白检测卡、尿微量白蛋白稀释液、尿微量白蛋白芯片：

尿微量白蛋白检测卡包括卡壳和试纸条；

试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC底板，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次粘贴于PVC底板上；

结合垫含有荧光标记的尿微量白蛋白抗体和荧光标记的羊抗鸡IgY抗体；

硝酸纤维素膜上依次设置有检测线和质控线，检测线、质控线相互平行，间距为3-5mm，检测线靠近加样孔；所述检测线包被有尿微量白蛋白单克隆抗体，质控线包被有鸡IgY抗体。

羧基修饰铕纳米微球荧光检测试纸条的制备方法如下：

(1)荧光纳米微球的制备

向三口烧瓶中依次加入50ml无水乙醇，3ml氨水，1ml水，加热至40℃后，恒温，搅拌，迅速加入1.5ml正硅酸乙酯，反应7h后，再加入1ml正硅酸乙酯，继续反应18h后；高速离心，分别用乙醇和水洗三次，在水中复溶后，得到二氧化硅纳米粒，记为产物I；

称取1mmol Eu

称取4mmo1苯甲酰丙酮于20ml乙醇中溶解，在60℃搅拌下，将产物II缓慢滴加入苯甲酰丙酮的乙醇溶液中，用NaOH调pH至7，出现大量沉淀。加热回流搅拌30min后，滴加10ml含有2mmol邻菲罗琳的乙醇溶液继续搅拌1h，干燥，得到产物III；

称取1mmol水杨酸、1mmol三乙胺溶于15ml二氯甲烷，1mmol丙烯酰氯溶于3ml二氯甲烷并置于恒压滴液漏斗，控制滴速，冰浴，1h内滴完，搅拌10h；用20％稀盐酸洗涤两次，饱和NaOH溶液洗涤两次，去离子水洗涤三次，分液，取有机相，干燥，减压蒸馏，得产物IV；

称取25mg产物IV、11mg丙烯酸溶于5ml二氯甲烷中，搅拌，混合均匀，加入0.5mgAIBN，N

将产物III溶于30ml DMF，称取2mmol产物V溶于10ml DMF中，用1M NaOH水溶液调pH至6，在50℃水浴锅中搅拌30h，出现沉淀，静置24h，抽滤，析出沉淀，过滤并用少量的乙醇反复洗涤后，干燥，得荧光纳米微球，即目标产物；

(2)荧光纳米微球的活化

将100μl荧光纳米微球置于1.5ml EP管中，加入100μl 1mg/ml的EDC及100μl0.6mg/ml的NHS，37℃活化60min，以14000rpm的高速离心，去除剩余的EDC和NHS，用水洗涤三次，得目标产物；

(3)荧光标记的尿微量白蛋白抗体的制备

取100μl 20μg/ml的尿微量白蛋白抗体于37℃与已经活化的荧光纳米粒孵育90min，加入100μl 1％BSA，37℃孵化60min封闭剩余活性基团，14000rpm的高速离心去上清，避光保存，得目标产物；

(4)荧光标记的羊抗鸡IgY抗体的制备

取100μl 20μg/ml的羊抗鸡IgY抗体于37℃与已经活化的荧光纳米粒孵育90min，加入100μl 1％BSA，37℃孵化60min封闭剩余活性基团，14000rpm的高速离心去上清，避光保存，得目标产物；

(5)硝酸纤维素膜的制备

分别用缓冲液将尿微量白蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线、检测线间隔3-5mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜，得目标产物；

(6)在PVC底板上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述检测试纸条。

上述检测试纸条固定在卡壳上，试纸表面用卡面压紧，且卡面在对应样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜的部分分别预留加样孔和观察窗。

上述尿微量白蛋白稀释液为磷酸盐缓冲液。

上述尿微量白蛋白芯片为同一批次试剂标准曲线信息，且不可互换使用。

以下对比例均以实施例1为基准，进行测试：

对比例1

一种尿微量白蛋白检测试剂盒，包括尿微量白蛋白检测卡、尿微量白蛋白稀释液、尿微量白蛋白芯片：

尿微量白蛋白检测卡包括卡壳和试纸条；

试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC底板，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次粘贴于PVC底板上；

结合垫含有荧光标记的尿微量白蛋白抗体和荧光标记的羊抗鸡IgY抗体；

硝酸纤维素膜上依次设置有检测线和质控线，检测线、质控线相互平行，间距为3-5mm，检测线靠近加样孔；所述检测线包被有尿微量白蛋白单克隆抗体，质控线包被有鸡IgY抗体。

羧基修饰铕纳米微球荧光检测试纸条的制备方法如下：

(1)荧光纳米微球的制备

向三口烧瓶中依次加入50ml无水乙醇，3ml氨水，1ml水，加热至40℃后，恒温，搅拌，迅速加入1.5ml正硅酸乙酯，反应7h后，再加入1ml正硅酸乙酯，继续反应15h后；高速离心，分别用乙醇和水洗三次，在水中复溶后，得到二氧化硅纳米粒，记为产物I；

称取1mmol Eu

称取1mmol水杨酸、1mmol三乙胺溶于15ml二氯甲烷，1mmol丙烯酰氯溶于3ml二氯甲烷并置于恒压滴液漏斗，控制滴速，冰浴，1h内滴完，搅拌6h；用20％稀盐酸洗涤两次，饱和NaOH溶液洗涤两次，去离子水洗涤三次，分液，取有机相，干燥，减压蒸馏，得产物III；

称取25mg产物III、7.5mg丙烯酸溶于5ml二氯甲烷中，搅拌，混合均匀，加入0.5mgAIBN，N

将产物II溶于30ml DMF，称取2mmol产物IV溶于10ml DMF中，用1M NaOH水溶液调pH至7，在50℃水浴锅中搅拌48h，出现沉淀，静置24h，抽滤，析出沉淀，过滤并用少量的乙醇反复洗涤后，干燥，得荧光纳米微球，即目标产物；

(2)荧光纳米微球的活化

将100μl荧光纳米微球置于1.5ml EP管中，加入100μl 1mg/ml的EDC及100μl0.6mg/ml的NHS，37℃活化60min，以14000rpm的高速离心，去除剩余的EDC和NHS，用水洗涤三次，得目标产物；

(3)荧光标记的尿微量白蛋白抗体的制备

取100μl 20μg/ml的尿微量白蛋白抗体于37℃与已经活化的荧光纳米粒孵育90min，加入100μl 1％BSA，37℃孵化60min封闭剩余活性基团，14000rpm的高速离心去上清，避光保存，得目标产物；

(4)荧光标记的羊抗鸡IgY抗体的制备

取100μl 20μg/ml的羊抗鸡IgY抗体于37℃与已经活化的荧光纳米粒孵育90min，加入100μl 1％BSA，37℃孵化60min封闭剩余活性基团，14000rpm的高速离心去上清，避光保存，得目标产物；

(5)硝酸纤维素膜的制备

分别用缓冲液将尿微量白蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线、检测线间隔3-5mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜，得目标产物；

(6)在PVC底板上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述检测试纸条。

上述检测试纸条固定在卡壳上，试纸表面用卡面压紧，且卡面在对应样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜的部分分别预留加样孔和观察窗。

上述尿微量白蛋白稀释液为磷酸盐缓冲液。

上述尿微量白蛋白芯片为同一批次试剂标准曲线信息，且不可互换使用。

对比例2

一种尿微量白蛋白检测试剂盒，包括尿微量白蛋白检测卡、尿微量白蛋白稀释液、尿微量白蛋白芯片：

尿微量白蛋白检测卡包括卡壳和试纸条；

试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC底板，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次粘贴于PVC底板上；

结合垫含有荧光标记的尿微量白蛋白抗体和荧光标记的羊抗鸡IgY抗体；

硝酸纤维素膜上依次设置有检测线和质控线，检测线、质控线相互平行，间距为3-5mm，检测线靠近加样孔；所述检测线包被有尿微量白蛋白单克隆抗体，质控线包被有鸡IgY抗体。

铕纳米微球荧光检测试纸条的制备方法如下：

(1)荧光纳米微球的制备

向三口烧瓶中依次加入50ml无水乙醇，3ml氨水，1ml水，加热至40℃后，恒温，搅拌，迅速加入1.5ml正硅酸乙酯，反应7h后，再加入1ml正硅酸乙酯，继续反应15h后；高速离心，分别用乙醇和水洗三次，在水中复溶后，得到二氧化硅纳米粒，记为产物I；

称取1mmol Eu

称取4mmo1苯甲酰丙酮于20ml乙醇中溶解，在60℃搅拌下，将产物II缓慢滴加入苯甲酰丙酮的乙醇溶液中，用NaOH调pH至6，出现大量沉淀。加热回流搅拌30min后，滴加10ml含有2mmol邻菲罗琳的乙醇溶液继续搅拌1h，干燥，得到产物III；

将产物III溶于30ml DMF，用1M NaOH水溶液调pH至7，在50℃水浴锅中搅拌48h，出现沉淀，静置24h，抽滤，析出沉淀，过滤并用少量的乙醇反复洗涤后，干燥，得荧光纳米微球，即目标产物；

(2)荧光纳米微球的活化

将100μl荧光纳米微球置于1.5ml EP管中，加入100μl 1mg/ml的EDC及100μl0.6mg/ml的NHS，37℃活化60min，以14000rpm的高速离心，去除剩余的EDC和NHS，用水洗涤三次，得目标产物；

(3)荧光标记的尿微量白蛋白抗体的制备

取100μl 20μg/ml的尿微量白蛋白抗体于37℃与已经活化的荧光纳米粒孵育90min，加入100μl 1％BSA，37℃孵化60min封闭剩余活性基团，14000rpm的高速离心去上清，避光保存，得目标产物；

(4)荧光标记的羊抗鸡IgY抗体的制备

取100μl 20μg/ml的羊抗鸡IgY抗体于37℃与已经活化的荧光纳米粒孵育90min，加入100μl 1％BSA，37℃孵化60min封闭剩余活性基团，14000rpm的高速离心去上清，避光保存，得目标产物；

(5)硝酸纤维素膜的制备

分别用缓冲液将尿微量白蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线、检测线间隔3-5mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜，得目标产物；

(6)在PVC底板上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述检测试纸条。

上述检测试纸条固定在卡壳上，试纸表面用卡面压紧，且卡面在对应样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜的部分分别预留加样孔和观察窗。

上述尿微量白蛋白稀释液为磷酸盐缓冲液。

上述尿微量白蛋白芯片为同一批次试剂标准曲线信息，且不可互换使用。

将实施例1-3、对比例1-2所制备的一种尿微量白蛋白检测试剂盒，进行定量检测：

1、精密度

表1精密度检测结果

2、准确度

表2准确度评价试验结果

3、检出限浓度

表3检出限检测数据

4、特异性

表4特异性实验检测结果(MALB阴性)

表5特异性实验检测结果(MALB浓度50mg/mL)

5、线性范围

表6线性范围确认检测数据

表7线性范围分析结果

分析性能评估总结

本发明的尿微量蛋白(MALB)检测试剂盒(量子点免疫荧光层析法)采用实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2在型干式荧光免疫分析仪上分别进行了精密度、准确度、最低检出限、特异性、线性范围的性能评估试验，试验总结如下：

(1)批内精密度最大检测结果为6.57％，符合批内精密度不大于10％的要求；实施例之间精密度最大检测结果为5.62％，符合实施例之间精密度不大于10％的要求。

(2)准确度参考品检测的最大相对偏差为3.5％，均符合相对偏差在±15％范围内的要求；

(3)MALB零浓度校准品所得检出限的浓度值最大为3.8mg/L，符合检出限不高于5mg/L的要求。

(4)血红蛋白浓度为6mg/mL，胆红素浓度为0.5mg/mL的样本不会对本试剂的检测结果造成干扰。肌酐、氯化铵、尿素对检测结果没有影响。

(5)在5mg/L-300mg/L浓度范围内，本试剂盒检测线性相关系数可以满足研发预设目标r≥0.990的要求。

测试方法：

1、精密度

试验方法：

(1)随机抽取同一批次的30条检测卡，分别对尿微量蛋白(MALB)的企业精密度参考品进行检测。三个水平浓度样本各重复检测10次，记录测定浓度。

(2)依照上述实验方法，三个实施例批次的试剂盒每个批次都各检测一次。

数据分析方法

批内精密度：分别计算每批次试剂盒各浓度样本10次检测结果的平均值(M)、标准差(SD)，根据公式CV＝SD/M×100％得出变异系数，变异系数CV(％)均应符合不大于10％的要求。

批间精密度：计算各浓度样本三个实施例批次试剂盒30次检测结果的平均值(M)和标准差(SD)，根据公式CV＝SD/M×100％得出变异系数，变异系数CV(％)值均应符合不大于10％的要求。

2、准确度

实验方法：

(1)随机抽取同一批次的9条检测卡，分别对尿微量蛋白(MALB)目标浓度约为20mg/L、50mg/L、200mg/L的企业参考品进行检测，记录测定浓度。

(2)依照上述实验方法，三个批次的试剂盒每个批次都各检测一次。

数据分析方法

计算各浓度样本3次检测结果的平均值(M)，根据公式(1)计算测量浓度的相对偏差B，结果应符合相对偏差在±15％范围内的要求。

B＝|(M-T)|/T×100％…………………………………………(1)

式中：

B——相对偏差；

M——测量浓度均值；

T——标定浓度。

3、检测限

实验方法

(1)分别用MALB零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，记录检测结果。

(2)依照上述实验方法，三个实施例批次的试剂盒每个批次都各检测一次。

数据分析方法

分别计算20次检测结果的平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，即为最低检测限。

4、特异性

实验方法

(1)以添加血红蛋白(浓度为6mg/mL)，胆红素(浓度为0.5mg/mL)，肌酐(浓度为0.1mg/mL)、氯化铵(浓度为6mg/mL)尿素(浓度为20mg/mL)的MALB阴性血清为干扰样本，每个样本检测三次；以添加血红蛋白(浓度为6mg/mL)，胆红素(浓度为0.5mg/mL)，肌酐(浓度为0.1mg/mL)、氯化铵(浓度为6mg/mL)尿素(浓度为20mg/mL)的MALB目标浓度约为50mg/L质控品为MALB阳性干扰样本，每个样本检测三次。

(2)依照上述实验方法，三个实施例批次的试剂盒每个批次各检测一次。

数据分析方法

(1)分别计算三个MALB阴性干扰样本，测定结果MALB应不高于5mg/L。

(2)分别计算三个MALB阳性干扰样本，三次推算浓度的平均值M，均值M与50mg/L的偏差不高于15％。

5、线性范围

实验方法

线性范围的建立

将MALB抗原稀释成0mg/L、2mg/L、5mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、300mg/L、600mg/L浓度水平的进行检测，分别使用干式荧光免疫分析仪进行检测，三个批次的试剂盒每个批次都各检测一次，每个浓度点检测三次，记录每次检测的浓度值。

数据分析方法

线性范围的确定

分别计算每个浓度三次检测得到的T/C值的平均值M，以浓度为横坐标，T/C平均值M为纵坐标，得出线性回归方程y＝a+bx，依据实验结果逐渐减少数据点直到满足相关系数r值≥0.990的要求，以满足相关系数r值≥0.990的浓度范围为本试剂盒的线性范围。

内部参考品、校准品

1、参考品的来源

由于尿微量蛋白(MALB)目前尚无国家参考品，故目前参考品为内部制备。

内部参考品构成

表8参考品的构成

2、校准品的来源

由于尿微量蛋白(MALB)目前尚无国家参考品，故目前校准品为内部制备。

内部校准品构成

表9校准品的构成

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。