一种基于丹参叶绿体基因组多态性基因片段制备的条形码及其应用

技术领域

本发明涉及丹参的鉴定方法，具体涉及利用丹参叶绿体基因组多态性基因片段对丹参的真伪、批次、产地的鉴别方法。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)是唇形科多年生草本植物，是预防和治疗血管性痴呆的重要药用植物，在中国广泛分布，对不同的环境压力有很强的抵抗力。《中华人民共和国药典》20版中明确规定，丹参来源于唇形科植物丹参的干燥根和根茎。文献调查发现，鼠尾草属中以根做丹参用的药用植物达25 种(含变种、变型)。虽然已有相关文献报道过丹参及其伪品或混淆品的性状及其理化鉴别，但对于如何追溯丹参药材的产地来源、区分不同生产批次、筛选优质品种以及鉴定生长年限却尚无相关研究。

由于同种药材来源复杂，中药材质量不稳定，这是造成中药发展问题的主要原因之一。在药材使用中多种同属植物作为一种药材使用，由于形态、结构极近似，性状、显微(组织构造和粉末)等传统鉴定方法有比较大的难度，即使有丰富经验的专业人员或药师，也费时费力，并且不能保证精确无误。近年来，DNA条形码分子鉴定技术在中药鉴定领域得到了广泛的应用。母系遗传叶绿体双链环状DNA，其序列保守性强，基因组结构稳定，常作为物种的系统发育和鉴定的有效工具之一。研究发现，叶绿体基因组中存在多态性区域，如matK和rbcl等基因片段常用于鉴别药材及其亲缘关系的研究，如张晓芹利用 matK基因片段鉴定大黄药材的基原，王玉金等利用trnL-F基因片段探索毛凤菊属的系统发育，吴志刚等利用rbcl基因片段研究山药类植物的来源及亲缘关系。这些多态性区域可为植物物种水平上的鉴定提供分子标记，而且还可以为物种提供准确的遗传多样性和群体结构，进一步为物种的品种选择育种提供有价值的信息。然而目前国内外尚无能够用于丹参种质鉴别的基因多态性区域的报道。

发明内容

为了弥补现有技术的空白，本发明提供了一种丹参叶绿体基因组多态性基因片段及其应用，所述基因片段为atpF和/或clpP多态性基因片段。

本发明的第一方面，提供一种atpF和/或clpP多态性基因片段作为丹参鉴别DNA条形码的应用。在一种实施方案中，所述鉴别DNA条形码可用于丹参种质鉴别，更为具体的，所述种质鉴别包括对样品基原、产地、质量和真伪的鉴别。

本发明的第二方面，提供一种利用atpF和/或clpP多态性基因片段对丹参种子进行批次防伪的方法，所述方法包括：

(1)丹参单倍型选择和种植

将收集单倍型种子，将携带不同的atpF和/或clpP多态性基因片段的单倍型进行组合，然后分批次进行种植，

(2)丹参批次样品的鉴定

将上述的丹参样品进行收集，提取DNA，对丹参的叶绿体多态性基因片段 atpF和/或clpP基因片段进行扩增并测序，并将测序结果分析，根据单倍型的序列和组合方式判断种植的丹参的批次样品。

本发明的第三方面，提供一种用于鉴别丹参种质的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括扩增丹参的叶绿体多态性区域atpF和/或clpP的引物及试剂。

本发明的第四方面，提供一种用于丹参种子批次防伪的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括扩增丹参的叶绿体多态性区域atpF和/或clpP的引物及试剂。

本发明至少获得了如下有益的技术效果：

1.本发明所提供的丹参多态性基因片段可以用于对丹参药材种质进行鉴别，方法操作简单，准确度高，可实现对不同产地不同种质的丹参的区分；

2.本发明所提供的丹参多态性基因片段可以作为识别丹参药材真伪的 DNA条形码，能够快速有效的对不同批次的丹参药材进行真伪识别，保障丹参药材市场秩序稳定；

3.本发明所提供的丹参多态性基因片段可以为丹参物种提供准确的遗传多样性和群体结构分析提供有价值的信息。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1atpF基因片段不同单倍型序列；

图2atpF单倍型序列构建的进化树；

图3atpF单倍型序列构建的遗传距离；

图4clpP基因片段不同单倍型序列；

图5clpP单倍型序列构建的进化树；

图6clpP单倍型序列构建的遗传距离；

图7编号SDLYHZNL2单倍型Hap1和编号HBSJZCJZ8单倍型Hap3的atpF 片段的测序峰图；

图8编号SDLYHZNL2单倍型Hap1和编号SXWNHY3单倍型Hap8的atpF 片段的测序峰图；

图9编号HBSJZDX2单倍型Hap1和编号HNSJZCJZ10单倍型Hap3的clpP 片段的测序峰图；

图10编号HBSJZDX2单倍型Hap1和编号SXWNHY8单倍型Hap2的clpP 片段的测序峰图。

具体实施方式

实施例1丹参叶绿体基因组多态性区域的筛选

1.1叶绿体基因组基因区域比对结果

首先收集吉林长春、四川中江、甘肃庆阳、安徽亳州、河北石家庄、山东临沂、江西赣州、陕西渭南、河南南阳、山西运城地区的10个丹参样品，提取叶绿体基因组，进行叶绿体基因组测序，测序结果应用clustalw2软件对样本进行多序列比对分析，得到73个对比结果，其中27个基因比对结果相似性为100％。15个基因对应的比对结果只有1个差异位点，以上42个基因无法用于筛选DNA条形码。将剩余31个比对结果按照序列相似度由小到大排序，表1-1展示的是不同丹参样品变异度最高的31个叶绿体基因，表中数据可以看出，丹参叶绿体基因区序列高度相似。

表1-1丹参变异度最高的31个叶绿体基因

1.2筛选丹参叶绿体基因组多态性区域

对于一个高效的条形码序列，除了要满足变异度足以区分不同物种的需求外，还需要满足PCR扩增和PCR产物测序的实验要求，所以对于序列长度也是筛选因素之一。将筛选出的比对长度在300～700bp之间，序列相似度＜97％的基因间区片段以及能够有效区分物种的基因区片段进行人工核对，其中atpF 基因区在第204位，第421位，第546位，第589位，第668位，第1230 位碱基存在变异情况；第575-576位，第610-611位存在插入碱基情况。clpP 基因区在第112位，第209位，第274位，第388位，第494位，第515位，第904位等碱基存在变异情况，第565-566位，1178-1179位，1479-1480 位存在插入碱基情况。

比对结果如表1-2所示，在十个样品中，atpF和clpP基因区在每个样本中的该段序列均存在其特异性变异位点，其中有两个样品该段基因序列是相同，相同序列的样品可判定为相同种质，因此十个样品由此区分为9种基因型。

除上述两段基因区序列外，对样品其他基因区序列也进行了比对，结果如表1-2所示：其他基因区序列对于10份样品的区分度低于atpF和clpP基因区序列，如ycf1能够区分7种基因型的样品，ycf3能够区分6种基因型的样品，而rpoC2、ndhA、ndhD、petD、rpoA、rpoB、rps16、ndhG、petB、rpoC1 则只能区分3-5种基因型的样品。

表1-2丹参核心种质特异性DNA条形码片段

实施例2利用atpF和clpP基因区为例，利用基因区实现对不同丹参道地性核心种质的鉴别

2.1收集不同地区的丹参种子

收集全国各地不同地区的多份药材(地区表2-1)，进行DNA提取，所用特异性引物如下所示：

atpF-F：ATGAAAAATGTAACCGATTCTTTCG；

atpF-R：TGACTAATCGGTTATTTCTTTCATCAC；

clpP-F：ATGCCTATTGGTGTTCCAAAAGTAC；

clpP-R：TCATTCAACTGCTACAAGATCAAC。

通过PCR扩增atpF和clpP基因片段，胶回收后进行测序。

表2-1丹参不同地区样品收集表

2.2利用基因区分析不同地区丹参的单倍型序列特征及遗传距离

2.2.1利用atpF分析不同地区丹参的单倍型序列特征

对测序结果进行分析，共形成9个单倍型(图1)，根据单倍型序列特征分为两大类。

第一类突变位点主要分布在204～546bp，主要有4个单倍型，单倍型Hap3、 Hap5、Hap6和Hap8的546位的特异性碱基为T；除此之外，Hap8在204 位的特异性碱基为G。

第二类突变位点分布在575～1230bp，其中576位、650位、750位、870 位、1000位、1030位、1120位、1170位及1210位的特异性碱基都为G、T、 T、G、A、T、C、T和A；单倍型Hap3和Hap4的特异性碱基在668位均为C；单倍型Hap5在1230位存在特异性碱基A；除此之外，单倍型Hap4在575-576 位存在插入碱基A；Hap1和Hap7在669位存在插入碱基T。

2.2.2利用atpF分析不同地区丹参的系统进化树及遗传距离

使用MEGAX软件对丹参的单倍型序列构建系统发育进化树及遗传距离，由图2可知，由单倍型序列构建的进化树可以分为两大支，与上面的测序结果分析类似；其中Hap1、Hap2、Hap4、Hap7和Hap9是一大分支，支持率为 12％；Hap3、Hap5、Hap6和Hap8分布在另外一分支上，支持率为64％。

从图3可以看出，丹参不同单倍型atpF序列遗传距离在0.00000～0.00241 之间，种内平均遗传距离为0.00，其中单倍型Hap2与Hap1、Hap4和Hap7 四者遗传距离最小，为0.00000；单倍型Hap9与Hap3、Hap5、Hap8之间遗传距离最大，为0.00241，遗传距离分析结构与系统发育进化树结构一致。

2.2.3利用clpP分析不同地区丹参的单倍型特征

对测序结果进行分析，共形成9个单倍型(图4)，根据单倍型序列特征分为两大类。

第一类突变位点主要分布在112～566位，主要有3个单倍型，单倍型Hap3、 Hap5和Hap6的112位、209位、388位和494位的特异性碱基均为A、G、 A、A。

第二类突变位点分布在763～1540bp，其中850位、940位、1120位、 1280位、1420位的特异性碱基都为T、T、A、G、A；单倍型Hap2、Hap3、 Hap5和Hap6的特异性碱基在904位、1453位和1476位均为T、C、G碱基，在1178-1179位均存在插入碱基T；除此之外，单倍型Hap9在763位特异性碱基位T；单倍型Hap7在1166位特异性碱基为A；单倍型Hap4在1479-1480 位存在插入碱基A。

2.2.4利用clpP分析不同地区丹参的系统发育进化树及遗传距离

使用MEGAX软件对丹参的单倍型序列构建系统发育进化树及遗传距离，由图5可知，由单倍型序列构建的进化树可以分为两大支，与上面的测序结果分析类似；其中Hap3、Hap5和Hap6是一大分支，支持率为100％；Hap1、Hap2、Hap4、Hap7、Hap8和Hap9分布在另外一分支上，支持率为88％。

从图6可以看出，丹参不同单倍型clpP序列遗传距离在0.00000～0.00368 之间，种内平均遗传距离为0.00，其中单倍型Hap4和Hap1，Hap5和Hap3、 Hap6，Hap6和Hap3之间遗传距离最小，为0.00000；单倍型Hap3、Hap5 和Hap6与Hap7、Hap8、Hap9之间遗传距离最大，为0.00368，遗传距离分析结构与系统发育进化树结构一致。

实施例3利用丹参叶绿体多态性基因区域进行丹参种子批次防伪

以筛选出的atpF和clpP基因区序列为例，对丹参种子进行批次防伪研究，表1-2中其他基因间区序列均可作用于丹参种子批次防伪。

3.1以atpF基因区序列对丹参种子进行批次防伪验证

实验采用叶绿体基因区片段作为建立中药材生产批次条形码的主要手段，实验采用的批次条形码包含但不限于atpF等叶绿体基因区片段。

挑取图1中编号SDLYHZNL2单倍型Hap1和编号HBSJZCJZ8单倍型Hap3 两个不同单倍型的丹参种子混合作为一个生产批次进行播种，于4月份播种， 8月份采集丹参不同植株10个叶片混合，进行DNA提取，并利用PCR仪扩增 atpF片段，胶回收后进行测序。测序峰图如图7所示。

由图7中明显可见atpF片段变异位点：在546bp处，Hap1碱基为C，Hap3 碱基为T，该位点测序峰图存在C-T套峰结构；在589bp处，Hap1和Hap3 分别为T和G碱基，该位点测序峰图出现G-T套峰结构。

另挑取图1中编号SDLYHZNL2单倍型Hap1和编号SXWNHY3单倍型 Hap8两个不同单倍型的丹参种子混合作为一个生产批次进行播种，于4月份播种，8月份采集丹参不同植株10个叶片混合，进行DNA提取，并利用PCR 仪扩增atpF片段，回收后进行测序。测序峰图如图8所示。

由图8中明显可见atpF片段变异位点：在204bp处，Hap1碱基为T，Hap8 碱基为G，该处位点测序峰图出现G-T套峰结构；在546bp处，Hap1碱基为 C，Hap8碱基为T，该位点测序峰图出现C-T套峰结构。

通过测序结果，可以得出，各批次丹参样品atpF片段峰图均能测出其单倍型种类，变异位点明显，存在套峰结构，可利用该片段作为批次条形码防伪方法。

3.2以clpP基因区序列对丹参种子进行批次防伪验证

挑取图1中编号HBSJZDX2单倍型Hap1和编号HBSJZCJZ10单倍型Hap3 两个不同单倍型的丹参种子混合作为一个生产批次进行播种，于4月份播种， 8月份采集丹参不同植株10个叶片混合，进行DNA提取，并利用PCR仪扩增 clpP片段，胶回收后进行测序。测序峰图如图9所示。

由图9中明显可见clpP片段变异位点：在112bp处，Hap1碱基为G，Hap3 碱基为A，该位点测序峰图存在G-A套峰结构；在209bp处，Hap1和Hap3 分别为T和G碱基，该位点测序峰图出现G-T套峰结构。

另挑取图1中编号HBSJZDX2单倍型Hap1和编号SXWNHY8单倍型Hap2 两个不同单倍型的丹参种子混合作为一个生产批次进行播种，于4月份播种， 8月份采集丹参不同植株10个叶片混合，进行DNA提取，并利用PCR仪扩增 clpP片段，回收后进行测序。测序峰图如图10所示。

由图10中明显可见clpP片段变异位点：在1453bp处，Hap1碱基为A， Hap2碱基为C，该处位点测序峰图出现A-C套峰结构；在1476bp处，Hap1 碱基为A，Hap2碱基为G，该位点测序峰图出现A-G套峰结构。

通过测序结果，可以得出，各批次丹参样品clpP片段峰图均能测出其单倍型种类，变异位点明显，存在套峰结构，可利用该片段作为批次条形码防伪方法。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。