丹皮酚用作黄曲霉抑菌剂的实验方法

技术领域

本发明涉及丹皮酚，尤其涉及丹皮酚用作黄曲霉抑菌剂。

背景技术

丹皮酚是从牡丹根皮中提取出来的一种中药活性成分，此药物具有抗炎、阵痛、解热和抑制变态反应等作用。同时，丹皮酚具有广谱抑菌性，对细菌和真菌都有抑制作用，但关于丹皮酚抑制黄曲霉却鲜有报道，抑菌机理更是尚未提出。

黄曲霉，一种常见的霉菌，极易在农作物产后储藏和食品加工过程中发生污染，作为一种条件致病菌，还能够引发人和动物患曲霉病。同时，黄曲霉产生黄曲霉毒素，其毒性强，致癌几率大，严重威胁人类身体健康。

鉴于黄曲霉及其毒素的危害之大，迫切需要寻找一种高效、无毒的抑菌剂。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种丹皮酚用作黄曲霉抑菌剂的实验方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种丹皮酚用作黄曲霉抑菌剂的实验方法，包括以下步骤，

步骤一，制备培养基，制备两组培养基组，分别为第一培养基组和第二培养基组；

步骤二，菌丝培养，在第一培养基组中加入丹皮酚，至第一培养基组中各培养基的丹皮酚浓度不同，在第一组培养基组的各培养基中插入黄曲霉菌丝块，初始状态下，第一组培养基组中各培养基中的黄曲霉菌丝直径相同，孵育，定期检测黄曲霉菌落的直径，得到丹皮酚抑菌浓度低值MIC；

步骤三，菌丝收集，在第二培养基组中添加黄曲霉孢子，初始状态下，第二培养基组中各培养基中的黄曲霉孢子含量相同，培养24h，然后在第二培养基组中分批加入丹皮酚，至丹皮酚的终浓度达到MIC，再培养24h，收集第二培养基组中各培养基的黄曲霉菌丝，分别进行冷冻干燥后，根据丹皮酚的浓度值进行分组标记备用；

步骤四，机理测定，将步骤三得到的黄曲霉菌丝分别进行表面超微结构检测、内部检测、隔膜数量检测、几丁质含量检测、β-1，3-葡聚糖检测；

步骤五，验证试验，取多份黄曲霉孢子悬浮液，向每份黄曲霉孢子悬浮液中加入丹皮酚，至各份黄曲霉孢子悬浮液中的丹皮酚浓度分别为0、1/2MIC、MIC，将经过无菌水冲洗后的玉米粒切口，注入混合有丹皮酚的黄曲霉孢子悬浮液，然后放入培养皿中培养，定期测量各玉米粒上黄曲霉的直径值。

进一步地，步骤二中，第一培养基组中各培养基的丹皮酚浓度值分别为0mg/mL、0.3125mg/mL、0.625mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL。

进一步地，步骤三中第二培养基组中各培养基的丹皮酚浓度值分别为0、1/2MIC、MIC。

进一步地，所述表面超微结构检测包括以下步骤，

步骤a1，将步骤三得到的黄曲霉菌丝于浓度为2.5%的戊二醛中固定8-12 h，然后分别移入不同浓度的乙醇中，洗脱，干燥，得到第一组样品；

步骤a2，将第一组样品通过导电粘合剂粘附至样品台，通过离子喷雾器喷涂镀金，然后通过扫描电子显微镜观察并拍照。

进一步地，所述内部检测包括以下步骤，

步骤b1，将步骤三得到的黄曲霉菌丝于浓度为2.5%的戊二醛中固定4-5h，，洗涤，固定，然后进行脱水，环氧树脂包埋，切片；

步骤b2，将切片安装在铜栅上，染色，通过透射电子显微镜观察并拍照。

进一步地，所述隔膜数量检测包括以下步骤，

步骤c1，将步骤三得到的黄曲霉菌丝置于载玻片上，依次添加荧光增白剂、10%KOH、抗荧光猝灭剂，荧光增白剂、10%KOH、抗荧光猝灭剂三者的体积比为1:1:1，盖上盖薄片，静置8-12min；

步骤c2，用荧光显微镜观察并拍照。

进一步地，所述几丁质含量检测包括以下步骤，

步骤d1，取重量为W

步骤d2，将步骤d1得到的物料用蒸馏水冲洗4-5次，然后用95%和100%的乙醇脱水，称重得到W

步骤d3，根据前后质量变化计算几丁质含量改变，。

进一步地，所述β-1，3-葡聚糖检测包括以下步骤，

步骤e1，将900mL浓度为1 mol/L的NaOH溶液，以及90mL浓度为6 mol/L的NaOH溶液依次加入15mg步骤三得到的黄曲霉菌丝，在80℃环境下孵育30min，然后进行冰浴；

步骤e2，将步骤e1得到的物料进行离心沉淀，取900ml上清液，添加到1890 mL甲基蓝混合物中，然后在52℃环境下孵育30min，室温下冷却30min；

步骤e3，将步骤e2得到的物料使用荧光分光光度计在激发波长为398 nm和发射波长为502 nm下测量荧光强度，根据标准曲线计算β-1，3-葡聚糖含量变化。

本发明的有益效果在于：丹皮酚用作黄曲霉抑菌剂的实验方法，引入丹皮酚作为黄曲霉抑制剂，具有高效、无毒、环境友好、经济适用等优点，通过检测不同浓度丹皮酚对黄曲霉菌丝的影响，能够快速的判断丹皮酚是否能够抑制黄曲霉，还能够得到丹皮酚抑菌浓度低值MIC，操作方便，通过菌丝收集及机理测定，能够准确的判断丹皮酚的抑菌机理，不仅能够证实丹皮酚对黄曲霉的抑制作用，还能够为施用场合的选择提供依据，表面超微结构检测、内部检测、隔膜数量检测、几丁质含量检测、β-1，3-葡聚糖检测，能够综合的判断抑菌机理，通过验证试验进行实施验证，能够证实丹皮酚用作黄曲霉抑菌剂的有效性，形成一个完整的实验体系，可靠性高。

附图说明

图1为不同丹皮酚浓度下黄曲霉菌丝扫描电镜图；

图2为不同丹皮酚浓度下黄曲霉菌丝透射电镜图；

图3为不同丹皮酚浓度下黄曲霉菌丝荧光白染色图；

图4为黄曲霉菌丝细胞壁中几丁质含量随丹皮酚浓度变化图；

图5为黄曲霉菌丝细胞壁中β-1，3葡聚糖含量随丹皮酚浓度变化图。

具体实施方式

下面将结合发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种丹皮酚用作黄曲霉抑菌剂的实验方法，包括以下步骤，

步骤一，制备培养基，制备两组培养基组，分别为第一培养基组和第二培养基组，第一培养基组为SDA（沙氏葡萄糖琼脂培养基），第二培养基组为SDB（沙氏葡萄糖液体培养基）；

步骤二，菌丝培养，在第一培养基组中加入丹皮酚，至第一培养基组中各培养基的丹皮酚浓度不同，各培养基的丹皮酚浓度值分别为0mg/mL、0.3125mg/mL、0.625mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL，以等比数列进行浓度梯度分配，在低浓度时分度值较小，能够快速的确定对黄曲霉具有较好的抑制效果的浓度范围，在第一组培养基组的各培养基中插入黄曲霉菌丝块，初始状态下，第一组培养基组中各培养基中的黄曲霉菌丝直径相同，均为6mm，在26-30℃环境下孵育48h，每24h检测一次黄曲霉菌落的直径，检测结果见附表1，得到丹皮酚抑菌浓度低值MIC，本实施例中，MIC为0.625mg/mL。

步骤三，菌丝收集，将500mL含量为5×10

步骤四，机理测定，将步骤三得到的黄曲霉菌丝分别进行表面超微结构检测、内部检测、隔膜数量检测、几丁质含量检测、β-1，3-葡聚糖检测；

步骤五，验证试验，取3份黄曲霉孢子悬浮液，每份80mL，黄曲霉孢子含量为5×10

其中，表面超微结构检测包括以下步骤，

步骤a1，在4℃环境下，将步骤三得到的黄曲霉菌丝于浓度为2.5%的戊二醛中固定8-12h，然后，将样品依次转移到30％、50％和70％的乙醇中，各15 min，再依次转移到90％和100％的乙醇中，各20min，然后，依次转移到25％、50％、75％和100％的丙酮中各10min，使用不同浓度的乙醇、丙酮目的是使菌丝样品彻底脱水, 用乙醇、丙酮脱水对样品表面产生的影响较小，浓度梯度脱水是为了减少样品收缩，从而最大程度地保留完整的细胞结构，再依次转移至洗脱液一、洗脱液二、洗脱液三、洗脱液四中进行洗脱，各10min，洗脱液一至洗脱液四均由乙酸异戊酯和丙酮组成，乙酸异戊酯和丙酮之间的配比依次为1:2、1:1、2:1、1:0，使用不同配比的乙酸异戊酯和丙酮，样品经不同配比的乙酸异戊酯和丙酮后，进入中间液100%乙酸异戊酯中，乙酸异戊酯与CO

步骤a2，将第一组样品通过导电粘合剂粘附至样品台，导电粘合剂选用日本日新EM的日新碳胶带，具体为SEM用导电碳胶带7321，尺寸为8mm*20mm，通过离子喷雾器喷涂镀金，然后通过扫描电子显微镜观察并拍照，离子喷雾器使用HITACHIE-1010型离子溅射仪，扫描电子显微镜使用HITACHIS-3400N扫描电镜。

检测结果见附图1，由附图1可以看出，随着丹皮酚浓度的增加，菌丝断裂、皱缩逐渐严重。

内部检测包括以下步骤，

步骤b1，在4℃环境下，将步骤三得到的黄曲霉菌丝于浓度为2.5%的戊二醛中固定4-5h，进行初步固定，然后通过磷酸盐缓冲液进行4次洗涤，洗去多余的戊二醛，磷酸盐缓冲液能够保持细胞的正常渗透压，相邻两次洗涤的间隔为10min，在1.0％四氧化锇中固定2 h，然后进行脱水，脱水后浸泡在环氧树脂与丙酮的混合液中1.5h，环氧树脂与丙酮的重量比为1:1，然后浸泡在环氧树脂与丙酮重量比为2:1的混合液中过夜，在浸泡在环氧树脂中过夜，其中环氧树脂选用环氧树脂812，经脱水后的黄曲霉菌丝在包埋以前要经过浸透处理，即用包埋剂（环氧树脂）与脱水剂（丙酮）按浓度梯度分级换液，使包埋剂逐渐取代脱水剂渗透到组织中去，最终使组织细胞内所有空隙均充满包埋剂，浸泡后放入烤箱中进行聚合，控制温度梯度为37℃，12h； 45℃，12h；60℃，36h，进行环氧树脂包埋，然后进行70nm切片，在包埋过程中，充分浸透的样品包埋在包埋剂中，加温使包埋剂逐渐由单体聚合成高分子，样品及包埋介质获得高度的稳定性、均匀性、合适的硬度和弹性；

步骤b2，将切片安装在铜栅上，用饱和乙酸铀酰和柠檬酸铅染色，通过透射电子显微镜观察并拍照，透射电子显微镜选用PHILPSTECNAI10 透射电镜。

检测结果见附图2，由附图2可以知道，丹皮酚能够改变黄曲霉菌丝胞内外超微结构。

隔膜数量检测包括以下步骤，

步骤c1，将步骤三得到的黄曲霉菌丝置于载玻片上，依次添加荧光增白剂、10%KOH、抗荧光猝灭剂，荧光增白剂、10%KOH、抗荧光猝灭剂三者的体积比为1:1:1，盖上盖薄片，静置8-12min，其中荧光增白剂为上海懋康生物科技有限公司，货号MM1011-100mL，抗荧光猝灭剂为生工生物工程（上海）股份有限公司，E675011-0005；

步骤c2，用荧光显微镜观察并拍照。

“隔膜”位于黄曲霉菌丝内，被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞。在隔膜上有一至多个小孔，使细胞间的细胞质和营养物质相互沟通，隔膜数量可以用来表征几丁质的含量。

检测结果见附图3，由附图3可以看出，黄曲霉菌丝内隔膜数量明显减少。

几丁质含量检测包括以下步骤，

步骤d1，取重量为W

步骤d2，将步骤d1得到的物料用蒸馏水冲洗4-5次，然后依次用95%和100%的乙醇脱水，称重得到W

步骤d3，根据前后质量变化计算几丁质含量改变，具体为通过以下计算公式计算，

几丁质含量 (%) =W2/W1×1.26×100，

其中1.26是乙酰氨基葡萄糖的相对分子质量与氨基葡萄糖的相对分子质量的比值。

检测结果见附图4，由附图4可以看出，黄曲霉细胞壁中的几丁质含量明显减少，根据Ducan的多重比较分析，a–c显著差异（P<0.05）。

β-1，3-葡聚糖检测包括以下步骤，

步骤e1，将900mL浓度为1 mol/L的NaOH溶液，以及90mL浓度为6 mol/L的NaOH溶液依次加入15mg步骤三得到的黄曲霉菌丝，在80℃环境下孵育30min，然后进行冰浴；

步骤e2，将步骤e1得到的物料进行4000g离心沉淀10min，取900ml上清液，添加到1890mL甲基蓝混合物中，然后在52℃环境下孵育30min，室温下冷却30min；

步骤e3，将步骤e2得到的物料使用荧光分光光度计在激发波长为398 nm和发射波长为502 nm下测量荧光强度，根据标准曲线计算β-1，3-葡聚糖含量变化。

其中甲基蓝混合物中，甲基蓝的含量为0.1wt%，HCl的含量为1mol/L，甘氨酸的含量为1mol/L，余量为水，pH为9.5，甲基蓝混合物中有苯胺蓝，盐酸和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，最后用氢氧化钠调pH至9.5，其中甘氨酸具有氨基和羧基的两性离子，故有很强的缓冲性。

标准曲线是由可得然胶在激发波长为398 nm和发射波长为502 nm下测量得到的曲线，可得然胶是由β-1，3-glucan组成，由它的吸光值能够定量样品中β-1，3-glucan的含量。

几丁质和β-1，3葡聚糖均位于黄曲霉细胞壁，二者含量的变化可以反映黄曲霉菌丝细胞壁有无遭受破坏。

检测结果见附图5，由附图5可以看出，细胞壁中β-1，3-葡聚糖减少。

附表1

由附表1可以知道，在丹皮酚浓度不低于0.625 mg/ mL时，黄曲霉的增殖被抑制，丹皮酚对于黄曲霉抑菌浓度低值MIC。

附表2

由附表2可以知道，在丹皮酚浓度为0.625 mg/ mL时，玉米上的黄曲霉的增殖被抑制。

由本实施例提供的丹皮酚用作黄曲霉抑菌剂的实验方法，能够知道丹皮酚对于黄曲霉的抑菌浓度低值MIC为0.625mg/mL，丹皮酚本身是植物来源的，对人体无毒无害，且丹皮酚主要破坏黄曲霉菌丝的细胞壁，鉴于人体没有细胞壁，因此丹皮酚对人体无副作用，可将其应用于食品安全方面。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。