一种用牛皮制备胶原蛋白的系统及其制备方法

技术领域

本发明涉及胶原蛋白的制备技术领域，具体涉及一种用牛皮制备胶原蛋白的系统及其制备方法。

背景技术

胶原蛋白是一种生物性高分子物质，在动物细胞中扮演结合组织的角色，是人体内含量最丰富的蛋白质，占全身总蛋白质的30％以上。胶原蛋白用于食品时，口感柔和、味道清淡、易消化，据研究表明，食用级胶原蛋白可降低甘油三酯和胆固醇，并增高体内某些缺乏的必需微量元素；还可以协助排出体内的铝，减少铝在体内的聚集，并一定程度促进指甲和头发的生长。目前市场销售的食用的胶原蛋白多为胶原或明胶降解后制得的小分子量的三股螺旋结构被破坏的胶原多肽。

胶原蛋白大分子的三股螺旋结构具有一定的热稳定性，且天然的紧密的纤维结构显示出很强的韧性和强度，适用于薄膜材料的制备。目前市场中各类香肠制品越来越多，天然的肠衣制品缺乏，以胶原蛋白为主要原料的肠衣在热处理的过程中随着水分和油脂的蒸发与溶化，胶原蛋白肠衣几乎与肉制品的收缩率一致，其他的可食用包装材料暂时并没有这种性质。因此，制备具有三股螺旋结构的大分子胶原蛋白具备极大的价值。

我国各地的牧区每年屠宰大量的牛养，在获取大量的牛羊肉用于食品的同时，产生大量的副产品，如牛皮，造成资源的浪费和环境的污染。牛皮中富含胶原蛋白，从牛皮中提取制备胶原蛋白，既充分利用废弃牛皮，又能获得优质的胶原蛋白。但是在胶原蛋白的制备过程中，存在以下难点：原料预处理方式不正确会导致胶原蛋白活性成分产率低；工艺步骤选择不适当导致生产过程存在污染，终产品中杂质多；制备方法导致终产品已被破坏了原有的三股螺旋结构，降低了其生物功能性。专利CN 111116736 A公开了使用牛皮作为原料制备胶原蛋白的方法，包括牛皮预处理和预处理后的牛皮酸法提取，通过碳酸钠溶液涨发和酶处理结合法，利于脱毛和胶原纤维的松散，提取具有完整三股螺旋结构的I型胶原，但是存在预处理步骤复杂，耗时耗力等问题。

发明内容

为了解决现有的技术问题，本发明提供了一种用牛皮制备胶原蛋白的系统及其制备方法，通过用牛皮制备胶原蛋白的系统制备牛皮的真皮组织，并通过柠檬酸和胃蛋白酶等进行处理，得到完整三股螺旋结构的胶原蛋白，且产率高、纯度高。

一种用牛皮制备胶原蛋白的系统，包括机架、置物台、自动伸缩杆、电机、滑轨、割刀、顶板、移动滑道、反应锅和水浴锅；所述机架是整个装置的基体，置物台固定在机架中间，自动伸缩杆连接在机架的上部，自动伸缩杆的底端与顶板连接；滑轨共2条沿竖直方向分布，设置在置物台的上方，滑轨内侧分别安装割刀，且自动伸缩杆、割刀与电机连接；置物台的一侧通过移动滑道与反应锅连接，反应锅设置在水浴锅中，水浴锅固定在机架上。

进一步地，所述割刀共2个，两个割刀之间的竖直距离为0.3mm～0.45mm。

进一步地，所述自动伸缩杆的顶端通过顶部滑轨连接在机架上，自动伸缩杆沿顶部滑轨在机架顶部左右移动。

进一步地，所述顶板为网格结构，每个小方格为33mm×75mm。

进一步地，所述反应锅的右下角设置管道，管道穿过水浴锅与废液池连接，管道与水浴锅之间通过密封胶带进行密封。

一种用牛皮制备胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

S1、通过用牛皮制备胶原蛋白的系统去除牛皮的皮下组织上残余的脂肪组织和肌肉组织，除去牛皮的表面层，厚度为0.3mm～0.45mm，并修剪成块33mm×75mm，得到牛皮的真皮组织；

S2、将真皮组织放置在pH为1.5～2.1的柠檬酸溶液中，添加质量分数为0.3～0.5％的胃蛋白酶液进行毛发或毛根的水解，胃蛋白酶液与真皮组织的质量比为(5～7):1，酶作用的温度为34℃～36℃，酶作用时间为1～2h，得到脱毛后的真皮组织；

S3、将脱毛后的真皮组织浸泡在柠檬酸混合溶液中，使其体积至少膨胀一倍，然后使用流动的清水冲洗6～10min，得到膨胀组织；柠檬酸混合溶液中包括1.5～3mol/L的柠檬酸和0.6～0.8mol/L的氯化十六烷基吡啶；

S4、将膨胀组织浸入1.5～3mol/L的柠檬酸溶液中，膨胀组织与柠檬酸溶液的质量比为1:(10～20)，浸泡12h～24h，然后用高速组织捣碎机匀浆5～10min，转速7000～12000转/分钟，得到匀浆液；再向匀浆液中加入1.5～3mol/L柠檬酸溶液，匀浆液与柠檬酸溶液的体积比为1：(5～8)，得到匀浆混合物，将匀浆混合物放置12～16h，期间每隔30min搅拌均匀一次；然后将该匀浆混合物以2000～3000rpm的速度离心1h，收集上清液；向上清液中加入0.2mg/ml的胃蛋白酶，并使用柠檬酸调节上清液pH为1.5～2，于20℃～25℃搅拌24～36h，得到胶原蛋白萃取液；

S5、向胶原蛋白萃取液中加入2％(w/v)酪蛋白，胶原蛋白萃取液与酪蛋白的重量比为(8～10):1，在34～36℃搅拌10～20min，然后加入2mol/L的氨水调节pH至4.0，以5000～5500rpm的速度，离心25～30min，收集上清液，即为纯化后的胶原蛋白萃取液；

S6、向纯化后的胶原蛋白萃取液中加入1mol./L的氯化钠溶液，纯化后的胶原蛋白萃取液和氯化钠溶液的体积比为1:5；搅拌1h后，得到胶原蛋白沉淀；

S7、将胶原蛋白质沉淀置于透析袋内放入清水中进行透析3～5h，每30～60min更换一次清水，取出干燥，即可得最终的成品胶原蛋白。

进一步地，所述S1中用牛皮制备胶原蛋白的系统工作时，先将牛皮放置在置物台上，然后通过电机控制自动伸缩杆伸长，使得顶板将牛皮压紧在置物台上；然后电机控制2个割刀同时同步沿滑轨从左向右移动300～500mm，接着自动伸缩杆带动顶板沿顶部滑轨从左向右移动300mm～500mm，再控制2个割刀同时同步继续向右移动300mm～500mm，直至割刀移动到牛皮的右侧，使得上方的割刀将牛皮的表面层割掉，下方的割刀将牛皮的皮下组织上残余的脂肪组织和肌肉组织割掉，得到牛皮的真皮层；然后在置物台上保留牛皮的真皮层，控制顶板向左移动，每次移动一个顶板的长度，并压紧牛皮的真皮层，使得牛皮的真皮层上留下33mm×75mm的网格形状，然后利用刀沿着网格形状将牛皮的真皮层修剪成33mm×75mm的小块，得到牛皮的真皮组织。

由于2个割刀之间的竖直距离为0.3mm～0.45mm，得到的牛皮的真皮组织的厚度为0.3mm～0.45mm。

进一步地，所述S2、S3中真皮组织都是通过移动滑道移动至反应锅中，在反应锅中进行反应，通过管道排出旧的反应液，加入新的反应液，通过水浴锅控制反应温度。

将牛皮去除皮下组织上残余的脂肪组织和肌肉组织，除去牛皮的表面层，并修剪成块后再进行后续的脱毛等步骤，可以使脱毛更加彻底，且使得膨胀组织的膨胀效果更好，且胶原蛋白更容易被萃取出来。在胶原蛋白的制备过程中，脱毛、膨胀组织和萃取的步骤中均采用柠檬酸，使得制备的胶原蛋白没有异味，食用时品质更好。氯化十六烷基吡啶可以与胶原蛋白紧密连接的“胶黏剂”蛋白多糖的硫酸皮肤素结合，破坏蛋白多糖的结构，从而使得胶原纤维更加分散，并且结合柠檬酸，使得真皮组织膨胀效果更好，胶原纤维更加松散，更有利于提取完整三股螺旋结构的胶原蛋白。使用柠檬酸和胃蛋白酶对真皮组织进行脱毛，使用柠檬酸混合溶液进行真皮组织膨胀，使用柠檬酸和胃蛋白酶进行胶原蛋白的萃取，减少各步骤间水、清洗剂等的使用，且防止各试剂中离子的干扰，减少对胶原蛋白的刺激，有利于维持胶原蛋白三股螺旋结构的稳定。胶原蛋白萃取后，采用酪蛋白与胃蛋白酶结合，并在酪蛋白等电点使得其沉淀，从而减少胶原蛋白萃取液总胃蛋白酶的含量，提高胶原蛋白的纯度。此外，酪蛋白与胶原蛋白萃取液的整个制备方法中使用的实际种类少，且制备真皮组织和脱毛的处理，显著减少胶原蛋白中的杂质，提高胶原蛋白的产率和纯度。此外酪蛋白和胶原蛋白萃取液中胃蛋白酶的含量在本发明的比例下才使得胃蛋白酶分离的效果更好，改变两者的比例，会减弱胃蛋白酶的分离效果。

采用上述技术方案，本发明实现的有益效果如下：

(1)采用本发明的用牛皮制备胶原蛋白的方法，可以显著提高胶原蛋白的产率和纯度，胶原蛋白的产率可达到20～23％，纯度达到96～98％，且通过相关的反应参数的设置，极大的缩短了反应时间。

(2)本发明的制备过程中，并没有采用超声等步骤，使得胶原蛋白的三股螺旋结构维持稳定，最终制备得到的是具有三股螺旋结构的胶原蛋白；且制备过程中使用的试剂种类少，用量少，采用柠檬酸和胃蛋白酶制备胶原蛋白，使得最终制备的胶原蛋白无异味，品质好。

(3)现有技术中通常需要表面活性剂、螯合剂、蛋白水解酶等多种物质配合进行膨胀组织的清洗，以使得后续使用酸和酶更好的进行胶原蛋白萃取，本发明只需要使用柠檬酸、胃蛋白酶、氯化十六烷基吡啶即可实现组织的膨胀，更好的进行胶原蛋白的萃取，减少了前期组织预处理脱毛的复杂度、省略冲洗步骤等，减少化学试剂的使用和污染，且增加胶原蛋白的提取率和结构的完整性。

(4)本发明的用牛皮制备胶原蛋白的系统，结构简单，操作容易，有利于提高胶原蛋白制备的效率。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为实施例1和实施例2制备得到的胶原蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析图；

图3为实施例1制备得到的胶原蛋白的圆二色谱法检测的结果图；

图4为实施例2制备得到的胶原蛋白的圆二色谱法检测的结果图。

图中，机架1、置物台2、自动伸缩杆3、电机4、滑轨5、割刀6、顶板7、移动滑道8、反应锅9、水浴锅10、顶部滑轨11、管道12。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

参照图1所示，一种用牛皮制备胶原蛋白的系统，包括机架1、置物台2、自动伸缩杆3、电机4、滑轨5、割刀6、顶板7、移动滑道8、反应锅9和水浴锅10；所述机架1是整个装置的基体，置物台2固定在机架1中间，自动伸缩杆3连接在机架1的上部，自动伸缩杆3的底端与顶板7连接；滑轨5共2条沿竖直方向分布，设置在置物台2的上方，滑轨5内侧分别安装割刀6，且自动伸缩杆3、割刀6与电机4连接；置物台2的一侧通过移动滑道8与反应锅9连接，反应锅9设置在水浴锅10中，水浴锅10固定在机架1上。

进一步地，所述割刀6共2个，两个割刀6之间的竖直距离为0.3mm～0.45mm。

进一步地，所述自动伸缩杆3的顶端通过顶部滑轨11连接在机架1上，自动伸缩杆3沿顶部滑轨11在机架1顶部左右移动。

进一步地，所述顶板7为网格结构，每个小方格为33mm×75mm。

进一步地，所述反应锅9的右下角设置管道12，管道12穿过水浴锅10与废液池连接，管道12与水浴锅10之间通过密封胶带进行密封。

一种用牛皮制备胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

S1、通过用牛皮制备胶原蛋白的系统去除牛皮的皮下组织上残余的脂肪组织和肌肉组织，除去牛皮的表面层，厚度为0.3mm，并修剪成块33mm×75mm，得到牛皮的真皮组织；

S2、将真皮组织放置在pH为2.1的柠檬酸溶液中，添加质量分数为0.5％的胃蛋白酶液进行毛发或毛根的水解，胃蛋白酶液与真皮组织的质量比为5:1，酶作用的温度为34℃，酶作用时间为1，得到脱毛后的真皮组织；

S3、将脱毛后的真皮组织浸泡在柠檬酸混合溶液中，使其体积膨胀一倍，然后使用流动的清水冲洗6min，得到膨胀组织；柠檬酸混合溶液中包括1.5mol/L的柠檬酸和0.6mol/L的氯化十六烷基吡啶；

S4、将膨胀组织浸入1.5mol/L的柠檬酸溶液中，膨胀组织与柠檬酸溶液的质量比为1:10，浸泡12h，然后用高速组织捣碎机匀浆5min，转速7000转/分钟，得到匀浆液；再向匀浆液中加入1.5mol/L柠檬酸溶液，匀浆液与柠檬酸溶液的体积比为1：5得到匀浆混合物，将匀浆混合物放置12h，期间每隔30min搅拌均匀一次；然后将该匀浆混合物以2000rpm的速度离心1h，收集上清液；向上清液中加入0.2mg/ml的胃蛋白酶，并使用柠檬酸调节上清液pH为2，于20℃搅拌24h，得到胶原蛋白萃取液；

S5、向胶原蛋白萃取液中加入2％(w/v)酪蛋白，胶原蛋白萃取液与酪蛋白的重量比为8:1，在34℃搅拌10min，然后加入2mol/L的氨水调节pH至4.0，以5000rpm的速度，离心25min，收集上清液，即为纯化后的胶原蛋白萃取液；

S6、向纯化后的胶原蛋白萃取液中加入1mol./L的氯化钠溶液，纯化后的胶原蛋白萃取液和氯化钠溶液的体积比为1:5；搅拌1h后，得到胶原蛋白沉淀；

S7、将胶原蛋白质沉淀置于透析袋内放入清水中进行透析3h，每60min更换一次清水，取出干燥，即可得最终的成品胶原蛋白。

进一步地，所述S1中用牛皮制备胶原蛋白的系统工作时，先将牛皮放置在置物台上，然后通过电机控制自动伸缩杆伸长，使得顶板将牛皮压紧在置物台上；然后电机控制2个割刀同时同步沿滑轨从左向右移动300mm，接着自动伸缩杆带动顶板沿顶部滑轨从左向右移动300mm，再控制2个割刀同时同步继续向右移动300mm，直至割刀移动到牛皮的右侧，使得上方的割刀将牛皮的表面层割掉，下方的割刀将牛皮的皮下组织上残余的脂肪组织和肌肉组织割掉，得到牛皮的真皮层；然后在置物台上保留牛皮的真皮层，控制顶板向左移动，每次移动一个顶板的长度，并压紧牛皮的真皮层，使得牛皮的真皮层上留下33mm×75mm的网格形状，然后利用刀沿着网格形状将牛皮的真皮层修剪成33mm×75mm的小块，得到牛皮的真皮组织。

进一步地，所述S2、S3中真皮组织都是通过移动滑道移动至反应锅中，在反应锅中进行反应，通过管道排出旧的反应液，加入新的反应液，通过水浴锅控制反应温度。

实施例2

与实施例1的一种用牛皮制备胶原蛋白的系统相同。

一种用牛皮制备胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

S1、通过用牛皮制备胶原蛋白的系统去除牛皮的皮下组织上残余的脂肪组织和肌肉组织，除去牛皮的表面层，厚度为0.45mm，并修剪成块33mm×75mm，得到牛皮的真皮组织；

S2、将真皮组织放置在pH为1.5的柠檬酸溶液中，添加质量分数为0.5％的胃蛋白酶液进行毛发或毛根的水解，胃蛋白酶液与真皮组织的质量比为7:1，酶作用的温度为36℃，酶作用时间为2h，得到脱毛后的真皮组织；

S3、将脱毛后的真皮组织浸泡在柠檬酸混合溶液中，使其体积膨胀1.5倍，然后使用流动的清水冲洗10min，得到膨胀组织；柠檬酸混合溶液中包括3mol/L的柠檬酸和0.8mol/L的氯化十六烷基吡啶；

S4、将膨胀组织浸入3mol/L的柠檬酸溶液中，膨胀组织与柠檬酸溶液的质量比为1:20，浸泡24h，然后用高速组织捣碎机匀浆10min，转速12000转/分钟，得到匀浆液；再向匀浆液中加入3mol/L柠檬酸溶液，匀浆液与柠檬酸溶液的体积比为1：8，得到匀浆混合物，将匀浆混合物放置16h，期间每隔30min搅拌均匀一次；然后将该匀浆混合物以3000rpm的速度离心1h，收集上清液；向上清液中加入0.2mg/ml的胃蛋白酶，并使用柠檬酸调节上清液pH为2，于25℃搅拌36h，得到胶原蛋白萃取液；

S5、向胶原蛋白萃取液中加入2％(w/v)酪蛋白，胶原蛋白萃取液与酪蛋白的重量比为10:1，在36℃搅拌20min，然后加入2mol/L的氨水调节pH至4.0，以5500rpm的速度，离心30min，收集上清液，即为纯化后的胶原蛋白萃取液；

S6、向纯化后的胶原蛋白萃取液中加入1mol./L的氯化钠溶液，纯化后的胶原蛋白萃取液和氯化钠溶液的体积比为1:5；搅拌1h后，得到胶原蛋白沉淀；

S7、将胶原蛋白质沉淀置于透析袋内放入清水中进行透析5h，每30min更换一次清水，取出干燥，即可得最终的成品胶原蛋白。

进一步地，所述S1中用牛皮制备胶原蛋白的系统工作时，先将牛皮放置在置物台上，然后通过电机控制自动伸缩杆伸长，使得顶板将牛皮压紧在置物台上；然后电机控制2个割刀同时同步沿滑轨从左向右移动500mm，接着自动伸缩杆带动顶板沿顶部滑轨从左向右移动500mm，再控制2个割刀同时同步继续向右移动500mm，直至割刀移动到牛皮的右侧，使得上方的割刀将牛皮的表面层割掉，下方的割刀将牛皮的皮下组织上残余的脂肪组织和肌肉组织割掉，得到牛皮的真皮层；然后在置物台上保留牛皮的真皮层，控制顶板向左移动，每次移动一个顶板的长度，并压紧牛皮的真皮层，使得牛皮的真皮层上留下33mm×75mm的网格形状，然后利用刀沿着网格形状将牛皮的真皮层修剪成33mm×75mm的小块，得到牛皮的真皮组织。

进一步地，所述S2、S3中真皮组织都是在反应锅中进行反应，通过管道排出旧的反应液，加入新的反应液，通过水浴锅控制反应温度。

对比例1

与实施例1的区别在于，S5中胶原蛋白萃取液与酪蛋白的重量比为5:1。

对比例2

与实施例1的区别在于，删除S5。

上述实施例1-2制备得到的胶原蛋白及对比例1-2制备得到的胶原蛋白的产率、纯度胶原蛋白的产率通过测定计算胶原蛋白和牛皮的质量比得到；采用凯氏定氮法检测最终成品中胶原蛋白的含量，胶原蛋白的质量与成品总重量的比例为纯度。

表1胶原蛋白的产率和纯度实验结果

从表1结果可以看出，实施例1和实施例2的产率和纯度显著高于对比例1和对比例2。通过步骤S5中选择合适的浓度进行胶原蛋白萃取液的纯化，最终显著提高胶原蛋白的产率和纯度。

采用SDS-PAGE电泳(配胶浓度为5％浓缩胶和8％分离胶)鉴定实施例1和实施例2制备得到的胶原蛋白，结果如图2所示，表明实施例1和实施例2制备得到的胶原蛋白在130KD左右处和280KD左右处分别有一条电泳条带，说明存在胶原蛋白α链和α链缠绕形成的三股螺旋结构，证明实施例1和实施例2制备得到的胶原蛋白含有完整三股螺旋结构。

胶原蛋白具有三股螺旋结构时，说明二级结构没有收到破坏，在圆二色谱法检测下，会出现明显的正、负吸收谱带。蛋白质的CD信号反映了二级结构元件的总和，能估算未知结构蛋白质的螺旋、链和转角的比例。胶原蛋白出现的正吸收峰与反式肽键的聚脯氨酸构型肽链有关，而其负吸收峰的出现与无规卷曲有直接的关系。由圆二色谱结果可以得到不同胶原蛋白空间二级结构形态，实现对胶原蛋白定性的结构鉴别分析。本发明中，采用圆二色谱法进行检测的具体步骤包括：用0.01～0.1mol/L的乙酸配制加样浓度为0.5mg/mL的胶原蛋白溶液，10000rpm于4℃冷冻离心，取上清，采用圆二色谱仪进行光谱扫描，比色皿光程为1mm，扫描波长范围为170-240nm。

图3和图4结果表明，实施例1和实施例2制备得到的胶原蛋白在190nm左右有强的正吸收峰，为I型胶原蛋白α螺旋构象的典型特征；在波长222nm、208nm左右有负吸收峰，为I型胶原蛋白α螺旋构象的典型特征，213nm处为0，为胶原蛋白三螺旋结构的典型特征，结合图2的电泳图，证明实施例1和实施例2为具有三股螺旋结构的胶原蛋白。