一株米曲霉及其在深度发酵豆粕中的应用

技术领域

本发明属于益生菌筛选技术领域，具体涉及一株米曲霉及其在深度发酵豆粕中的应用。

背景技术

豆粕是饲料中常用的蛋白质原料之一，约占植物性蛋白质饲料总消费量的64％，但豆粕中含有大量的抗营养因子，如胰蛋白酶抑制剂、大豆抗原、寡糖、植酸、植物凝集素、抗维生素因子、促甲状腺肿因子和非淀粉多糖类，这些抗营养因子的存在降低了动物对豆粕的利用率。研究表明幼龄畜禽断奶日粮中大豆抗原成分引起的短暂过敏反应是断奶后腹泻的主要因素之一，而仔猪断奶后对营养素的吸收不良和临床腹泻给养猪生产造成了重大损失，如何解决这一问题是国内外研究的热点。

大豆抗原是热稳定性抗营养因子，并且对胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感，很难通过加热等物理方法消除其对乳仔猪肠道的致敏危害。微生物对豆粕的发酵处理可以使其中各种抗营养因子以及致幼龄畜禽肠道过敏和腹泻的因子降解去除，并且分解蛋白质生成大量具有生物活性的小肽，同时生成游离氨基酸、消化酶、有机酸、维生素等多种活性因子。

经过微生物发酵的无抗原大豆粕消化吸收率高，是断奶仔猪、幼禽和水产动物的优质蛋白质饲料原料。这类高可溶性蛋白、低抗原的优质产品是市场急需的产品。但目前市面上的发酵豆粕产品大多是简单发酵，工艺粗糙，豆粕得不到充分的发酵分解，产品品质不高。

发明内容

本发明的目的是提供一株米曲霉及其在深度发酵豆粕中的应用，从而能够更高效的发酵豆粕产品，

本发明的第一个目的是提供一株米曲霉(Aspergillus oryzae)HS-3，已于2023年3月31日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.40549，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所提供的米曲霉HS-3用于豆粕的深度发酵。

本发明还提供一种发酵豆粕的方法，是使用上述的米曲霉HS-3进行发酵

本发明再一个方面还提供一种深度发酵豆粕，其制备方法如下：

1)制备米曲霉斜面种子：以土豆培养基做斜面，划线接种米曲霉，培养72h，至斜面长满黄绿色孢子。

2)制备麸皮种子：称量麸皮8.5g，豆粕1.5g，加去离子水9mL，混匀灭菌，冷却后接种一环米曲霉斜面种子，30度培养72h，至麸皮培养基上下表面均长满黄绿色孢子。

3)豆粕发酵：称量豆粕65-85g，麸皮30-10g，糖蜜5g，添加去离子水至水分占物料总质量的35-40％，混匀灭菌。从麸皮种子中取出1g接种至灭菌后的豆粕发酵培养基，混匀后30度培养72h；

4)添加乳酸菌厌氧发酵和酶解：豆粕发酵结束之后检测物料水分，添加液体乳酸菌液3-5％，加无菌水至水分含量35-40％，37度厌氧酶解48h，烘干粉碎即获得营养物质丰富的深度发酵豆粕。

本发明的有益效果如下：

1)本发明的米曲霉HS-3具有高的中性蛋白酶活力，可以豆粕为原料发酵生长，产生丰富的酶系，所得深度发酵豆粕蛋白分子量低、可溶性高。原料中蛋白经发酵酶解后多以具有生物活性的小分子肽和游离氨基酸的形式存在，显著提高了蛋白的利用率。

2)应用本发明所筛选的菌株发酵豆粕，可将原料中的大豆抗原蛋白、棉籽糖和水苏糖等低聚糖、尿酶和胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子有效降解，降低动物腹泻的发生率，促进营养物质的消化吸收，提高了饲料转化率。

(3)本发明利用生产性状优良的米曲霉和乳酸菌联合发酵，充分利用菌种的不同生产特性，使菌种产酶、产酸优势互补，所得深度发酵豆粕有机酸含量高，含有相当浓度的乳酸、醋酸等有机酸，适口性好，并且富含多种活性益生菌，能调节动物肠道的微生态环境，提高动物应激能力和免疫力，降低应激性腹泻，提高动物生长性能。

(4)本发明所述深度发酵豆粕含有发酵固有的鲜香味，并产生了特殊的香味，具有明显的诱食作用。益生菌发酵生成了醇类物质、有机酸以及由它们聚合形成具有香味的酯类物质，同时固体发酵给产品赋予了特有的鲜香味，可显著提高饲料的适口性，增加动物采食量，促进生长，提高动物的生产性能。

附图说明

图1：米曲霉HS-3在显微镜下的菌体形态图。

图2：米曲霉HS-3在土豆培养基上的菌落形态图。

图3：各种发酵豆粕产品的蛋白分布电泳图，其中泳道1是标样，2是豆粕原料，泳道3、4、5、7为市售的其它米曲霉作为发酵菌种制备的发酵豆粕，泳6(1)是以本发明筛菌过程中获得的米曲霉HS-4为发酵菌种制得的发酵豆粕，泳道6(2)是本发明实施例2制备的米曲霉深度发酵豆粕。

图4：各种发酵豆粕产品中低聚糖含量的薄板层析图，其中泳道1是标样，泳道2是豆粕原料，泳道3、4、5、7是市面上收集来的其他以米曲霉作为发酵菌种的发酵豆粕，泳道6(2)是本发明实施例2制备的发酵豆粕。

具体实施方式

本发明通过米曲霉对豆粕的深度发酵酶解获得一种高可溶性蛋白、低抗营养因子、具有一定含量的益生菌和有机酸、含有多种消化酶并具有一定的活力和特殊风味的发酵豆粕。

本发明的第一个目的是提供一株米曲霉(Aspergillus oryzae)HS-3，已于2023年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.40549，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所提供的米曲霉HS-3用于豆粕的深度发酵。

本发明的第二个目的是针对豆粕中存在的大量抗营养因子导致的动物消化利用率低、幼龄畜禽断奶后腹泻的问题，以及现有发酵豆粕产品发酵程度不够，营养指标不佳的问题提供一种适用于养殖业的深度发酵豆粕，所提供的深度发酵豆粕使用上述的米曲霉HS-3发酵豆粕制备而成。

所述的深度发酵豆粕，其制备方法如下：

1)制备米曲霉斜面种子：以土豆培养基做斜面，划线接种米曲霉，培养72h，至斜面长满黄绿色孢子。

2)制备麸皮种子：称量麸皮8.5g，豆粕1.5g，加去离子水9mL，混匀灭菌，冷却后接种一环米曲霉斜面种子，30度培养72h，至麸皮培养基上下表面均长满黄绿色孢子。

3)豆粕发酵：称量豆粕65-85g，麸皮30-10g，糖蜜5g，添加去离子水至水分占物料总质量的35-40％，混匀灭菌。从麸皮种子中取出1g接种至灭菌后的豆粕发酵培养基，混匀后30度培养72h。发酵24h后注意观察，当白色菌丝将豆粕培养基板结之后需翻曲透气。

4)添加乳酸菌厌氧发酵和酶解：豆粕发酵结束之后检测物料水分，添加液体乳酸菌液3-5％，加无菌水至水分含量35-40％，37度厌氧酶解48h，烘干粉碎即获得营养物质丰富的深度发酵豆粕。

以下通过具体实施例来进一步描述本发明，但不应以此限定本发明的保护范围。

实施例1：筛选目的菌株及检测

本发明的米曲霉HS-3菌株的具体筛选过程如下：

1)菌种的筛选和分离纯化

从豆粕工厂附近泥土样品和酱油曲中筛选目的菌株，取5g样品，加入45mL无菌生理盐水，振荡混匀10min，制成初始混悬液，然后以生理盐水10倍递增逐级稀释样品。选择5个合适的稀释度，取100μL稀释液涂布于土豆培养基平板上，倒置于30℃恒温培养箱内培养3-5天。

挑选不同来源、生长状态良好单菌落共4个，在土豆培养基平板上多次划线分离得到纯培养物，并分别以HS-1～4进行命名，加上实验室原来保存的一株米曲霉HS-5共5株菌进行后续的豆粕发酵实验。

2)菌株产蛋白酶活力测定

将五株待检测的菌株分别划线接种土豆斜面培养基培养72h，至斜面长满黄绿色孢子。再分别将一环孢子接种至麸皮种子培养基，30度培养72h，至麸皮培养基上下表面均长满黄绿色孢子，搅拌均匀后分别取样检测蛋白酶活力，结果如下表1所示。

表1：五株待检测的菌株产蛋白酶的活性检测数据表

3)发酵豆粕效果检测

从上述五株菌的麸皮种子中分别取出1g接种至灭菌后的豆粕发酵培养基，混匀后30度培养72h。发酵结束之后添加液体乳酸菌液3％，调整水分至40％，37度厌氧酶解48h，烘干粉碎，检测各样品中粗蛋白、小肽、有机酸等成分的含量及是否有黄曲霉毒素，结果如下表2所示。

表2：五株待检测的菌株发酵豆粕效果检测表

小肽即酸溶蛋白，为三氯乙酸沉淀去除大分子蛋白之后的小分子肽。由以上结果可知，五株曲霉菌发酵酶解豆粕，所得几个样品的粗蛋白含量相差无几，但菌株HS-5发酵产品检测出含有黄曲霉菌素，不予考虑。菌株HS-3的发酵产品小肽和有机酸含量都较高。此外，在生长过程中，菌株HS-2比其他几株菌生长缓慢，最终长势也不好，且蛋白酶活力比较低。综合考虑，选择菌株HS-3为最佳菌株，用于深度发酵豆粕的进一步研究。

对HS-3菌株进行分类学地位鉴定，用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(生工生物)提取菌株HS-3基因组DNA，作为PCR扩增模板，利用ITS引物对(引物ITS1和ITS4)，进行PCR扩增。

PCR反应过程如下：98℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环，72℃保持5min。将PCR产物送生工生物公司测序，测序后的菌株序列与Genbank数据库中的序列进行同源性比对，确认菌株HS-3为米曲霉(Aspergillus oryzae)。

所筛选的米曲霉(Aspergillus oryzae)HS-3，已于2023年3月31日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.40549，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2：利用HS-3株发酵豆粕平行试验一

利用米曲霉发酵制备深度发酵豆粕，具体步骤如下：

(1)制备米曲霉斜面种子：以土豆培养基做斜面，划线接种米曲霉，培养72h，至斜面长满黄绿色孢子。

(2)制备麸皮种子：称量麸皮8.5g，豆粕1.5g，加去离子水9mL，混匀灭菌，冷却后接种一环米曲霉斜面种子，30度培养72h，至麸皮培养基上下表面均长满黄绿色孢子。

(3)豆粕发酵：称量豆粕85g，麸皮10g，糖蜜5g，添加去离子水至水分占物料总质量的40％，混匀灭菌。从麸皮种子中取出1g接种至灭菌后的豆粕发酵培养基，混匀后30度培养72h。发酵24h后注意观察，当白色菌丝将豆粕培养基板结之后需翻曲透气。

(4)添加乳酸菌厌氧发酵和酶解：豆粕发酵结束之后检测物料水分，添加液体植物乳杆菌菌液5％，加无菌水至水分含量40％，37度厌氧酶解48h，烘干粉碎即获得营养物质丰富的深度发酵豆粕。

实施例3：利用HS-3株发酵豆粕平行试验二

利用米曲霉发酵制备深度发酵豆粕，具体步骤如下：

(1)制备米曲霉斜面种子：以土豆培养基做斜面，划线接种米曲霉，培养72h，至斜面长满黄绿色孢子。

(2)制备麸皮种子：称量麸皮8.5g，豆粕1.5g，加去离子水9mL，混匀灭菌，冷却后接种一环米曲霉斜面种子，30度培养72h，至麸皮培养基上下表面均长满黄绿色孢子。

(3)豆粕发酵：称量豆粕85g，麸皮10g，糖蜜5g，添加去离子水至水分占物料总质量的40％，混匀灭菌。从麸皮种子中取出1g接种至灭菌后的豆粕发酵培养基，混匀后30度培养72h。发酵24h后注意观察，当白色菌丝将豆粕培养基板结之后需翻曲透气。

(4)添加乳酸菌厌氧发酵和酶解：豆粕发酵结束之后检测物料水分，添加液体乳酸片球菌菌液5％，加无菌水至水分含量40％，37度厌氧酶解48h，烘干粉碎即获得营养物质丰富的深度发酵豆粕。

实施例4：利用HS-3株发酵豆粕平行试验三

利用米曲霉发酵制备深度发酵豆粕，具体步骤如下：

(1)制备米曲霉斜面种子：以土豆培养基做斜面，划线接种米曲霉，培养72h，至斜面长满黄绿色孢子。

(2)制备麸皮种子：称量麸皮8.5g，豆粕1.5g，加去离子水9mL，混匀灭菌，冷却后接种一环米曲霉斜面种子，30度培养72h，至麸皮培养基上下表面均长满黄绿色孢子。

(3)豆粕发酵：称量豆粕75g，麸皮20g，糖蜜5g，添加去离子水至水分占物料总质量的35％，混匀灭菌。从麸皮种子中取出1g接种至灭菌后的豆粕发酵培养基，混匀后30度培养72h。发酵24h后注意观察，当白色菌丝将豆粕培养基板结之后需翻曲透气。

(4)添加乳酸菌厌氧发酵和酶解：豆粕发酵结束之后检测物料水分，添加液体植物乳杆菌菌液5％，加无菌水至水分含量35％，37度厌氧酶解48h，烘干粉碎即获得营养物质丰富的深度发酵豆粕。

实施例5：制备的深度发酵豆粕的小肽含量检测

以上所述实施例2和3所用乳酸菌菌种不同，实施例4调整了豆粕和麸皮的比例，降低了发酵和酶解的水分。对三个实施例中制备的深度发酵豆粕，以及筛菌过程中获得的另两株米曲霉HS-4、HS-1株，按照实施例2方法发酵制备的发酵豆粕样品一起进行检测，分析其中粗蛋白、小肽、有机酸等营养成分的含量，结果如下表3所示。

表3：不同实施例制备的发酵豆粕以及另两株米曲霉发酵制备的发酵豆粕组分比较表

由以上结果可知，发酵过程中水分条件对发酵的影响比较大，实施例4的小肽含量明显低于实施例2和实施例3。但三个实施例与HS-4发酵豆粕及HS-1发酵豆粕相比，所发酵的豆粕在小肽含量上都有显著的提高，说明本发明所筛选的米曲霉所产蛋白酶对豆粕原料中的大分子抗原蛋白质降解比较彻底，提高了蛋白质的利用率。此外，三个实施例的有机酸含量提高也较为明显，说明制备方法中使用乳酸菌与米曲霉相互作用，起到了较好的补充发酵的效果。

分析本发明实施例2深度发酵制备的豆粕中的抗原蛋白降解具体情况。将各样品以去离子水振荡提取30分钟，离心处理后以高效液相色谱法分析小肽分子量分布，结果如下表4。

表4：不同发酵豆粕的小肽组成比较表

根据定义，分子量在3000以下的即为小肽。未发酵的豆粕中小肽总量为3.31％，HS-4发酵豆粕小肽总量为15.49％，本发明实施例2的小肽总量为39.50％。由上述结果可以看出，本发明所述深度发酵豆粕的水溶性蛋白质中98％以上为分子量3000以下的小肽和游离氨基酸，其中分子量180-1000的功能性活性小肽(2-8个氨基酸)含量为15.83％，占小肽总量的40％，都远高于豆粕和普通发酵豆粕。本发明所述米曲霉HS-3对豆粕的深度发酵显著提高了蛋白质的利用率，降低了抗营养因子的含量。

经以上分析可知，大豆中分子量大于22KD的热稳定性大豆抗原蛋白(主要为7s球蛋白和11s球蛋白)及分子量为102KD的脂肪氧化酶在发酵酶解过程中降解完全；低聚糖类抗营养因子棉子糖、水苏糖也降解彻底；而分子量为8KD-21.5KD的胰蛋白酶抑制剂为热敏性抑制因子，在发酵前的灭菌过程中已被破坏失活。因此，经本发明菌株米曲霉HS-3的深度发酵，豆粕中存在的多种热敏性和热稳定性抗营养因子基本降解完全，所得深度发酵豆粕是一个优质的零抗原、高可溶性蛋白和高小肽含量的功能性添加剂。

实施例6：蛋白组分检测

以实施例2为研究对象，加上市售的米曲霉发酵豆粕产品，分析各样品抗原蛋白的降解情况，所得SDS-PAGE凝胶电泳图如图3所示。大豆抗原蛋白中的主要组分为7S球蛋白(亚基分子量分别为76、72、53KD)和11S球蛋白(亚基分子量分别为35-40KD、22KD)。由泳道2豆粕的蛋白条带分布情况可以看出，电泳图中几条显色最深的条带即大豆抗原蛋白。泳道3、4、5、7几个其他米曲霉菌株发酵豆粕的蛋白质组成与豆粕差不多，特别是样品3、4，抗原基本没有降解。样品6(1)是HS-4菌株发酵豆粕，其35KD以上的大分子抗原降解明显，蛋白集中在25KD以下。泳道6(2)的实施例2制备的深度发酵豆粕抗原蛋白降解最为彻底，大分子蛋白完全降解，分子量在14.4KD以下的的小分子蛋白和小肽含量有了明显的增加，而更多的蛋白降解成了分子量更小的活性肽和游离氨基酸(从电泳图下端跑出已无法显示)。说明通过米曲霉HS-3的发酵酶解之后，不可利用的大分子抗原蛋白完全降解成了可利用的小分子蛋白、活性小肽和游离氨基酸，提高了蛋白质的利用率。

以实施例2所得样品为研究对象，加上收集来的几个米曲霉发酵豆粕产品，分析各样品低聚糖(主要是水苏糖和棉籽糖)的降解情况，薄板层析图如图4所示。由薄板层析结果可知，泳道6(2)即实施例2的深度发酵豆粕样品水苏糖和棉子糖降解都比较彻底，优于其他发酵豆粕。