一种基于GC-IMS分析特征气味成分、形性指标鉴别猪牛羊胆汁及其制成的胆南星的方法

技术领域

本发明涉及一种基于GC-IMS分析特征气味成分鉴别猪牛羊胆汁及其制成的胆南星的方法，属于药物检测鉴别领域。

背景技术

动物药来源于动物体，属于天然药物，具有资源丰富，疗效确切等特点，是中药的重要组成部分。动物胆汁更具有活性强、疗效好、副作用小等鲜明特性。是一种历史悠久的传统中药，其性味苦寒、无毒、具有清热解毒、止咳、平喘、利胆明目等功效。其药用价值早在《本草纲目》、《中国大药典》等中草药经典文献中都有记载。其中熊胆、蛇胆、猪胆、鸡胆等更具有活性强，疗效显著，副作用小等特性而广泛用于临床实践中。除了作为药材原料使用外，胆汁也是中药材炮制中常用的辅料，如胆汁炙黄连、胆汁制南星等。由于不同动物来源的胆汁功效成分有区别，为了保证药效的稳定，针对胆汁的来源鉴别，以及不同胆汁的药材炮制品的区分、鉴别尤为重要。

目前已有相关文献报道胆汁中的成分，如杨春梅，几种动物胆汁组分的初步分析以及鹅去氧胆酸提取工艺的研究，新疆农业大学，2006年6月，公开了动物胆汁的主要成分，以及常见动物胆汁中分离、提取和纯化鹅去氧胆酸的工艺学研究。申请号：CN201510257048.5，发明名称：一种禽畜类胆粉中胆汁酸类成分的反相薄层色谱鉴别方法，公开了一种禽畜类胆粉中胆汁酸类成分的反相薄层色谱鉴别方法。现有对动物胆汁的鉴别主要集中在单一来源的动物胆汁，且主要围绕其胆汁酸类化学成分。胆汁作为动物来源物质，其腥臭味与其来源也密切相关，但目前对不同来源动物胆汁的挥发性成分的分析研究较少，还未见有以挥发性成分作为胆汁的鉴别指标。

胆南星为天南星科植物天南星Arisaema erubescens(Wall.)schott、异叶天南星A.heterophyllum Bl.或东北天南星A.amurense Maxim.的干燥块茎与胆汁加工的炮制品，味苦、微辛，性凉，归肺、肝、脾经，具有清热化痰、息风定惊的功效，可用于治疗痰热咳嗽、咯痰黄稠、中风痰迷、癫狂惊痫等症。胆南星的炮制方法记载最早见于宋代《小儿药证直诀》“腊月酿牛胆中，风干百日”，后代多沿用此法，并在其基础上发展为“九转南星”。羊胆汁炮制天南星的方法首次记载于《普济本事方》。建国后，随着对胆南星工艺的研究，猪胆汁逐渐成为主流的生产辅料，在《中药炮制经验集成》中记载，天南星可用猪胆制，此后《中国药典》从1977年版至今收载，猪、牛、羊胆汁均可用于胆南星的生产。

外观性状在中药品质鉴别中有重要地位，但因在实际应用中缺乏量化指标而显示出局限性。中药的“辨状论质”是通过对药材的外观性状的观察结果进行分析总结，从而判断药材的内在品质。中药炮制过程中对于气味的判断一般采用“鼻闻、口尝”等方法，主观因素较大，缺少客观的、量化的指标。随着科技发展，中药的性状特征在智能感官系统或分析技术的应用下使得感官评定量化、标准化。谭超群等通过电子鼻技术和LS-SVM技术分析不同胆汁发酵的胆南星在不同发酵时间对气味传感器的影响，从而实现对用不同胆汁生产的胆南星区别，但未阐明胆南星中挥发性成分的来源及胆汁与胆南星挥发成分的差异。胆汁作为胆南星的炮制辅料，牛、羊和猪均为偶蹄目，但牛和羊为牛科动物，猪为猪科动物，三种胆汁间气味相差较大，经传统发酵所制的胆南星在气味上是否存在差异尚未可知。

申请号：CN201810638465.8，发明名称：一种鉴别猪胆汁炮制的发酵制胆南星和混合蒸制胆南星的方法，鉴别猪胆汁炮制的发酵制胆南星和混合蒸制胆南星的方法，通过猪胆酸(HCA)、猪去氧胆酸(HDCA)和鹅去氧胆酸(CDCA)作为一组标志物，以及甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)和甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)作为另一组标志物，在鉴别猪胆汁炮制的发酵制胆南星和混合蒸制胆南星中的应用。该方法也是仅用于猪汁胆炮制品的鉴别。

因此，如何找出一种用于快速鉴别猪牛羊胆汁及其加工的胆南星的方法是我们目前迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种快速鉴别猪牛羊胆汁及其加工的胆南星方法。

本发明提供了一种基于GC-IMS分析特征气味成分鉴别猪牛羊胆汁的方法，它是采用GC-IMS检测猪牛羊胆汁中挥发性有机物，通过对待测样品的特征指纹图谱分析，确定标志性挥发性有机物，通过挥发性有机物的浓度判断胆汁类型。

其中，所述的GC-IMS分析条件为：孵育条件：顶空进样体积200μL，孵育时间15min，孵育温度60℃，孵化转速500r/min，进样针温度85℃；

色谱柱类型：MXT-WAX(0.53mm×30m，1.0μm)，色谱柱温度60℃，载气/飘移气：高纯氮气(纯度≥99.99％)，载气流速：E1(漂移气流速)为150mL/min，E2(气相载气流速)为初始2mL/min，2min内保持不变；2～10min，E2：2～10mL/min；10～20min,E2：10～100mL/min，20min后一直保持100mL/min直至分析结束；

GC-IMS检测分析时间：45min。

其中，所述的分析方法是将GC-IMS三维谱图、相似度分析、PCA分析标志性挥发性有机物。

其中，所述的猪胆汁中浓度最高的物质有：2-甲基-1-丙醇、2-甲基丙醛、乙酸甲酯、氨、正丙醇和己醛；

羊胆汁中浓度最高的物质有：乙酸乙酯、2-甲基丁醛、丁醇、1-戊烯-3-醇、戊醇、辛醛、E-2-庚醛、己醇、壬醛、乙酸、苯甲醛、2-庚酮和庚醛；

牛胆汁中浓度最高的物质有：丙酮、2-丁酮、3-甲基-1-丁醇、2-丁醇和乙醛。

本发明提供了一种基于GC-IMS分析特征气味成分鉴别猪牛羊胆汁炮制的胆南星的方法，它是采用GC-IMS检测胆南星中挥发性有机物，通过对待测样品的特征指纹图谱分析，确定标志性挥发性有机物，通过挥发性有机物的浓度判断胆南星的炮制类型。

其中，所述的GC-IMS分析条件为：孵育条件：顶空进样体积200μL，孵育时间15min，孵育温度60℃，孵化转速500r/min，进样针温度85℃；

色谱柱类型：MXT-WAX(0.53mm×30m，1.0μm)，色谱柱温度60℃，载气/飘移气：高纯氮气(纯度≥99.99％)，载气流速：E1(漂移气流速)为150mL/min；E2(气相载气流速)为初始2mL/min，2min内保持不变；2～10min，E2：2～10mL/min；10～20min,E2：10～100mL/min，20min后一直保持100mL/min直至分析结束；

GC-IMS检测分析时间：45min。

其中，所述的分析方法是将GC-IMS三维谱图、相似度分析、PCA分析标志性挥发性有机物。

所述的猪胆南星显著高于牛胆南星和羊胆南星的物质有：乙酸甲酯、丁醇、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸丙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯、4-甲基-1-戊醇、乙酸和1-己醇；

羊胆南星显著高于猪胆南星和牛胆南星物质有：1-戊醇、1,8-桉叶素、2-甲基丁醛、己醛、2-丁酮、辛醛、1-戊烯-3-醇、戊酸乙酯、E-2-己醛、己酸乙酯、E-2-庚醛和2-庚酮；

牛胆南星显著高于猪胆南星和羊胆南星的物质有：2-甲基丙醛、2-丁醇、苯甲醛、壬醛、庚醛和3-羟基-2-丁酮。

本发明还提供了一种基于形性指标鉴别猪牛羊胆汁及猪牛羊胆汁炮制的胆南星的方法，它包括如下步骤：

a、取待检样品，采用测色仪测定颜色指标L*、a*、b*值；

b、将检测的颜色指标值与下表比对，当L*、a*、b*三个值均在限定的范围内，即为相应的胆汁或胆南星炮制品；

本发明还提供了一种基于形性指标关联猪牛羊胆汁及猪牛羊胆汁炮制的胆南星的化学指标的方法，它包括下述步骤：

a、采用测色仪测定取待检样品的颜色指标L*、a*、b*值；

b、通过以下公式，预测样品中挥发性成分的含量：

为了对胆南星进行鉴别和质量提升，本发明以不同胆汁及其所制的胆南星为研究对象，采用GC-IMS检测其挥发性有机物(VOCs)，对比分析各待测样品的差异，研究胆汁与胆南星气味的变化及其内在关系，阐明不同胆汁对其经发酵所制胆南星(气味)的影响，通过对待测样品的特征指纹图谱分析，确定标志性挥发性有机物，通过挥发性有机物的浓度判断胆汁类型，该方法检测的准确性高，同时通过不同胆汁及其所制的胆南星的形性指标检测，达到快速鉴定胆汁及制成的胆南星。

附图说明

图1猪、牛、羊胆南星及胆汁图

图2化合物峰体积

图3猪、牛、羊胆汁GC-IMS三维谱图

图4猪、牛、羊胆汁的GC-IMS谱图

图5猪、牛、羊胆汁指纹图谱相似度分析(欧氏距离)

图6猪、牛、羊胆汁样品的PCA分析图

图7猪、牛、羊胆汁挥发性成分的GC-IMS指纹图谱

图8猪、牛、羊胆南星GC-IMS三维谱图

图9猪、牛、羊胆南星样品的气相离子迁移谱图

图10猪、牛、羊胆南星指纹图谱相似度分析(欧氏距离)

图11猪、牛、羊样品的PCA分析图

图12猪、牛、羊胆南星挥发性成分的指纹图谱

图13胆南星、胆汁样品及颜色值与27种挥发性成分的相关性分析(其中，A1：猪胆南星；A2：牛胆南星；A3：羊胆南星；B1：猪胆汁；B2牛胆汁；B3：羊胆汁)

具体实施方式

实施例1本发明鉴别方法

1仪器与试药

气相离子迁移谱联用仪(济南海能仪器股份有限公司)，TO-200粉碎机(上海市天祺盛世科技有限公司)，CS-520分光测色仪(杭州彩谱科技有限公司)。天南星购自陕西恒瑞万寿路中药材专业市场，经鉴定为天南星科植物天南星Arisaemaerubescens(Wall.)Schott的干燥块茎。新鲜猪、牛、羊胆均购自陕西省咸阳市咸阳秦都市场。

2实验方法

2.1样品的制备

生天南星粉碎，过5号筛，猪、牛、羊胆汁4层纱布过滤。将天南星粉末分别与不同胆汁按比例(1：4)混合均匀后装入各自的胆囊中，在30℃～35℃，70％～75％湿度下使其自然发酵，30d后取出胆南星，即得供试品(见图1)。

2.2GC-IMS技术分析条件

孵育条件：顶空进样体积200μL，孵育时间15min，孵育温度60℃，孵化转速500r/min，进样针温度85℃。色谱柱类型：MXT-WAX(0.53mm×30m，1.0μm)，色谱柱温度60℃，载气/飘移气：高纯氮气(纯度≥99.99％)，载气流速：E1(漂移气流速)为150mL/min。E2(气相载气流速)为初始2mL/min，2min内保持不变；2～10min，E2：2～10mL/min；10～20min,E2：10～100mL/min，20min后一直保持100mL/min直至分析结束。GC-IMS检测分析时间：45min。

2.3GC-IMS检测分析方法

精密称取胆南星固体1.0g，过4号筛；液体胆汁过滤后0.8g；分别置于20mL顶空瓶中，60℃孵育15min后进样，分别平行3次实验。采用仪器配套的VOCal软件查看谱图进行挥发性成分的定性定量分析，通过比较挥发性成分的保留时间和离子迁移时间，在软件内置的气相保留指数数据库(NIST)和离子迁移谱数据库(IMS)可对物质进行定性分析。使用Reporter插件直接对比样品之间的谱图差异，Dynamic PCA插件进行动态主成分分析，用于将样品聚类分析等。

“最近邻”指纹分析：该功能可根据所选评估区域中化合物的强度对样本进行快速比较。该算法计算每两个样本的之间的欧几里得距离。这样，就可以通过检索最小距离来找到“最近邻”。首先确定欧式距离最远(最小相似度)的两个测量值，基于算法机制选择其中的一个开始，绘制一个表示该测量值的方框置于最左侧，随后选择它的“最近邻”置于它的右侧，依此类推，直到显示所有测量值为止。底部区域显示每个类(颜色)的正态分布。解读该图的方法不是寻找最遥远的，而是观察与更远的群体相比，相对紧密的群体测量结果。

2.4分光测色仪检测发方法

将胆南星样品粉碎，过4号筛，应用分光测色仪CS-520，对样品的颜色进行测定。开机稳定后，校正镜头曝光度和焦距，取样品适量均匀置于样品盘中，重复测量3次。记录样品L*(亮度)、a*(红绿色度)、b*(黄蓝色度)值。

2.5未知样品检测

从不同药店购买胆南星饮片样品3份，按同样的方法制备供试品并进行L*、a*、b*值测定，以L*、a*、b*值代入回归方程计算27种挥发性物质的理论峰体积，并与27种挥发性物质的峰体积实测值进行比较。

3结果与分析

3.1化合物定性鉴别分析

GC-IMS分析猪牛羊胆汁及其制成的胆南星，从猪胆汁、牛胆汁和羊胆汁中共检测出50种挥发性物质，识别出33种挥发性成分；从胆南星样品中共检测出113种挥发性物质，鉴定出61种物质。主要包括醇类，醛类，酯类，酮类，酸类，氨等。由于2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇、乙酸异戊酯、1-己醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、壬醛、3-羟基-2-丁酮、丁醇、醋酸、1-丙醇、己醛、2-庚酮、氨等化合物质量较高，出现2个峰，分别对应于单体和二聚体，可能是通过漂移区时被分析的离子和中性分子之间形成了加合物，详见下表1和图2。

表1样品中挥发性化合物定性分析表

3.2猪、牛、羊胆汁挥发性成分分析

通过图3、图4、图5和图6结果显示，猪、牛、羊胆汁GC-IMS三维谱图及相似度分析和PCA分析可以看出3种胆汁样品存在明显的差异。图7和表2可以直观看出猪、牛、羊胆汁中差异物质的种类，如图7A区域物质猪胆汁中浓度最高，主要物质有2-甲基-1-丙醇、2-甲基丙醛、乙酸甲酯、氨、正丙醇和己醛等。B区域物质在羊胆汁中浓度最高，主要物质有：乙酸乙酯、2-甲基丁醛、丁醇、1-戊烯-3-醇、戊醇、辛醛、E-2-庚醛、己醇、壬醛、乙酸、苯甲醛、2-庚酮和庚醛等。C区域物质在牛胆汁中浓度最高，主要物质有：丙酮、2-丁酮、3-甲基-1-丁醇、2-丁醇和乙醛等。

表2猪牛羊胆汁样品中挥发性化合物峰体积结果分析表(

3.3猪、牛、羊胆南星中的挥发性成分分析

通过图8、图9、图10和图11结果显示，猪、牛、羊胆汁制成的胆南星GC-IMS三维谱图及相似度分析和PCA分析可以看出3种胆南星样品存在明显的差异。图12和表3中可以直观的看出3种胆南星样品存在的差异成分，A区域物质在3种样品中浓度差异不大，为3种胆南星的共有化合物，主要有：乙醛、二甲基硫醚、乙酸乙酯、乙醇、正丙醇、2-甲基-1-丙醇和3-甲基-1-丁醇等。B号区域物质在牛胆南星中浓度最高，主要物质有：2-甲基丙醛、2-丁醇、苯甲醛、壬醛、庚醛和3-羟基-2-丁酮等。C区域物质在猪胆南星中浓度最高，主要特征物质有：乙酸甲酯、丁醇、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸丙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯、4-甲基-1-戊醇、乙酸和1-己醇等。D区域物质在羊胆南星中浓度最高，主要物质有：1-戊醇、1,8-桉叶素、2-甲基丁醛、己醛、2-丁酮、辛醛、1-戊烯-3-醇、戊酸乙酯、E-2-己醛、己酸乙酯、E-2-庚醛和2-庚酮等。

表3猪牛羊胆南星样品中挥发性化合物峰体积结果分析表(

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3.4颜色测定结果

将胆南星样品粉碎，过5号筛。胆汁样品用纱布过滤4次。应用分光测色仪CS-520(杭州彩谱科技有限公司)，对样品的颜色进行测定。开机稳定后，校正镜头曝光度和焦距，取样品适量均匀置于样品盘中，重复测量3次，直接读取并记录样品L*(亮度)、a*(红绿色度)、b*(黄蓝色度)值。

不同胆汁及其炮制的胆南星L*、a*、b*值详见下表4。L*越大表示样品颜色亮度越高，a*越小表示颜色越偏向于绿色，b*越大表示颜色越偏向于黄色。

表4不同胆汁及胆南星样品颜色值(

3.5相关性分析

不同胆汁及其炮制的胆南星颜色与成分相关性结果如下图13，牛胆汁颜色最绿且偏黄，总体颜色较亮。猪胆汁颜色最深(色暗)，猪胆汁与羊胆汁绿色度接近，但羊胆汁偏黄。牛胆南星颜色最绿，猪胆南呈暗黄色，羊胆南星呈灰色。

在SPSS26.0软件中对已鉴别出的41种挥发性成分含量(半定量)和L*、a*、b*进行相关性分析，检出样品中有27种挥发性成分与色度值有显著的相关性，其中，L*，a*，b*与氨类和二甲基硫醚等化合物呈显著负相关，a*与己醇、戊醇、丙醇、乙酸甲酯、乙酸丁酯、2-丁基呋喃等成分呈显著正相关。即胆南星颜色越绿越黄亮，氨和二甲基硫醚等臭味物质越少。本实验中牛胆南星腥臭味最弱，猪胆南星次之，羊胆南星臭味最强。此外，牛胆南星呈强烈青草味或花果香，猪胆南星呈坚果味。

3.6回归分析

在SPSS26.0软件中，以GC-IMS检出的27种成分为因变量，以L*、a*、b*值为自变量，进行回归分析，探讨胆汁、胆南星中各挥发性成分含量与颜色值之间的定量关系，结果见下表5和表6。

表5模型汇总及方差分析

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表6回归方程

3.7未知样品检测结果

市面收集的3批胆南星样品的L*、a*、b*值结果见表7，27种成分的理论值和以GC-IMS检出的27种成分的实测值见表8，推测市面购买的胆南星样品均为猪胆南星，建立的模型可从颜色较好地预测大部分挥发性成分的占比。有个别成分预测存在差异可能样品在空气的暴露时间、有可能是混合胆汁等原因有关。

市面收集的3批胆南星样品与前期实验室自制的9批胆南星样品的27种挥发性成分峰体积比较结果见表9，与已知的猪胆南星、羊胆南星和牛胆南星相比，市售胆南星样品丁酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸丙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯、4-甲基-1-戊醇、1-己醇、1-戊醇等远高于羊胆南星和牛胆南星；辛醛、(E)-2-己烯醛、正己酸乙酯和2-庚酮等接近猪胆南星样品，远低于羊胆南星；庚醛和3-羟基-2-丁酮接近猪胆南星样品，远低于牛胆南星；推测该三个样品为猪胆南星。

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表8挥发性成分峰体积的理论值和实测值结果(

表7不同胆南星样品颜色值(

表9市售样品与前期建模猪、牛、羊胆南星样品挥发性成分峰体积对比结果(

由以上结果可知，胆汁及胆南星中27种挥发性成分的含量与颜色具有密切的相关性，拟合的挥发性成分的含量与L*、a*、b*值间回归式在统计学上有显著性意义，可通过样品的颜色预测其挥发性成分含量。

4.结论

天南星粉末不同的工艺制备的胆南星气味和颜色等外在感官指标会发生如何变化尚未可知随着发酵的发生，外在的颜色和气味都会发生变化，外观性状指标的变化又会影响胆南星质量的评判，因此通过采用GC-IMS结合电子眼技术比较了不同胆汁及其制备的胆南星之间的气味和颜色等外在质量评价进行了初步的探索。结果发现，胆汁与胆南星挥发性物质存在明显差异，有少部分成分来源于胆汁，但发酵后有酯类成分产生，该类成分一般来源于羧酸与醇的酯化作用所产生的，有可能与发酵过程中微生物的代谢有关。

通过本次实验结果表明，采用GC-IMS方法可用于检测猪牛羊胆汁及其制成的胆南星样品，共鉴定出61种挥发性物质，除去单体和二聚体重复的共有41种挥发性物质。其中猪胆汁显著高于牛胆汁和羊胆汁的物质有2-甲基-1-丙醇、2-甲基丙醛、乙酸甲酯、氨、正丙醇和己醛等。猪胆南星显著高于牛胆南星和羊胆南星的物质有乙酸甲酯、丁醇、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸丙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯、4-甲基-1-戊醇、乙酸和1-己醇等。羊胆汁显著高于猪胆汁和牛胆汁的物质有乙酸乙酯、2-甲基丁醛、丁醇、1-戊烯-3-醇、戊醇、辛醛、E-2-庚醛、己醇、壬醛、乙酸、苯甲醛、2-庚酮和庚醛等。羊胆南星显著高于猪胆南星和牛胆南星物质有1-戊醇、1,8-桉叶素、2-甲基丁醛、己醛、2-丁酮、辛醛、1-戊烯-3-醇、戊酸乙酯、E-2-己醛、己酸乙酯、E-2-庚醛和2-庚酮等。牛胆汁显著高于猪胆汁和羊胆汁的物质有丙酮、2-丁酮、3-甲基-1-丁醇、2-丁醇和乙醛等。牛胆南星显著高于猪胆南星和羊胆南星的物质有2-甲基丙醛、2-丁醇、苯甲醛、壬醛、庚醛和3-羟基-2-丁酮等。其余化合物成分差异较小。胆南星中41种挥发性化学成分和颜色的Lab值有27种成分有显著性相关，说明在不同的胆汁发酵过程中颜色和气味存在的同向趋势的变化，用挥发性物质来区别不同胆汁来源的胆南星具有可行性。