一种缓解重症哮喘的药物、应用及动物模型构建方法

技术领域

本发明属于重度哮喘作用机制技术领域，尤其涉及一种缓解重症哮喘的药物、应用及动物模型构建方法。

背景技术

目前全球约有3亿哮喘患者，我国约有3千万哮喘患者，是全球哮喘病死率最高的国家之一。因此，研究哮喘发生与发展新的分子机制，寻找新的哮喘治疗方法仍是哮喘研究人员急迫而又紧要的任务。临床研究发现40％以上的哮喘以中性粒细胞炎症为主。同时约有10％～15％重度哮喘患者对于即使是大剂量的糖皮质激素吸入治疗也不敏感，或存在一定程度的抵抗[2]。这些患者大多为重症哮喘，其炎症特征不同于轻度哮喘，而与慢阻肺相似。传统的Th2型免疫反应无法解释这一复杂性，新的信号途径如Th17/IL-17在哮喘中的作用越来越受关注[3]。临床上对该类哮喘不易诊断且治疗措施缺乏针对性，造成社会生产能力降低和严重社会经济负担[4]。因此，研究该类型哮喘的发病机制是当前呼吸疾病研究领域的重要挑战之一。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)中性粒细胞为主的重症哮喘发病机制尚未明确

(2)Th17/IL-17在重症哮喘中的具体作用机制尚未清楚

(3)表观遗传修饰能否调控Th17/IL-17，改善重症哮喘症状尚未明确

解决以上问题及缺陷的难度为：

本发明所提出的科学假设是在我们前期研究基础上，综合本研究领域最新研究进展进行总结和引申出来的。研究假设合理，有临床意义。通过本课题的研究，我们将明确HDAC10在重症哮喘中的作用及分子机制，为确立HDAC10作为治疗重症哮喘的新靶点提供更充分的科学依据。

解决以上问题及缺陷的意义为：

既往哮喘分子机制的研究主要集中在Th2型免疫反应介导的嗜酸性粒细胞性气道炎症反应，鉴于中性粒细胞为主的重症哮喘存在激素抵抗，临床治疗棘手。而本发明则集中在Th17/IL-17A细胞介导的中性粒细胞性为主的重症哮喘。因此，本课题的研究具有重要的临床意义。应用HDAC10抑制剂治疗重症哮喘动物模型小鼠，观察及评估其对炎症反应、粘液分泌及气道高反应性的疗效，为临床开发应用HDAC10抑制剂治疗中性粒细胞性为主的重症哮喘潜在靶标提供重要理论基础及实验依据。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种缓解重症哮喘的药物、应用及动物模型构建方法。

本发明是这样实现的，一种缓解重症哮喘的药物，所述缓解重症哮喘的药物为HDAC10抑制剂。

进一步，所述HDAC10抑制剂调控重症哮喘中Th17/IL-17A的表达。

进一步，所述HDAC10抑制剂乙酰化STAT3调控重症哮喘Th17/IL-17A表达。

本发明的另一目的在于提供一种所述缓解重症哮喘的药物在HDAC10靶向治疗重症哮喘中的用途。

本发明的另一目的在于提供一种验证所述缓解重症哮喘的药物的动物模型构建方法，所述动物模型构建方法利用HDM联合LPS致敏、激发的方法建立小鼠重症哮喘模型，利用HDAC10

进一步，所述动物模型构建方法具体包括：

(1)利用HDAC10淋巴细胞条件性敲除HDAC10

(2)小鼠肺组织的处理剪下右侧肺叶装于冻存管中，置于液氮罐中，待小鼠全部处理完毕后，统一转移至-80℃冰箱保存。用0.4ml，4％甲醛灌注左侧肺叶，使左肺膨胀，然后剪切整个肺叶放入装有4％甲醛的5ml EP管中，固定1-2天后，进行脱水、包埋、切片、染色、免疫组化；用HE染色观察气道炎症，PAS染色法观察气道粘液表达，用Masson染色观察胶原沉积；

(3)肺组织蛋白提取称取肺组织约50mg，置于2.0ml均浆管中，按1:10比例加入500μ1RIPA裂解液及5μl 100*PMSF，用匀浆机匀浆50HZ，90s，以上所有操作均在冰上进行。于4℃离心机13000rpm，离心15min，吸取上清于另一新的1.5ml Ep管中，-80℃保存备用于检测细胞因子或WB实验。

进一步，气道炎症评分用Olympus光学显微镜同条件下观察和拍照切片内气道，直径在300μm-1000μm之间，长、短径比例大于0.6的完整气道，每张切片至少取10个视野；用半定量评分系统进行评分：0分，气道正常；1分，气道周围少许炎症细胞浸润；2分，有1层炎症细胞浸润气道；3分，有2﹣4层炎症细胞浸润气道；4分，超过4层的炎症细胞浸润气道。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明阐明HDAC10调控Th17/IL-17A表达在重症哮喘中的作用机制；明确HDAC10与STAT3相互作用模式；证实HDAC10去乙酰化STAT3调控Th17/IL-17A表达在重症哮喘中作用；确定HDAC10激活剂能缓解重症哮喘，为HDAC10靶向治疗重症哮喘提供实验依据。

本发明HDAC10与STAT3具有相互作用，在小鼠肺组织T淋巴细胞，通过免疫共沉淀(IP)方法可以检测到HDAC10与STAT3的互相结合。能确定HDAC10结合STAT3启动子区域。HDAC10能影响STAT3的乙酰化水平。STAT3介导HDAC10调控Th17/IL-17A表达，与WT小鼠、HDAC10

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的缓动物模型构建方法流程图。

图2是本发明实施例提供的利用CRISPR/Cas基因编辑构建示意图。

图3是本发明实施例提供的验证HDAC10在重症哮喘小鼠模型中的作用示意图。

图4是本发明实施例提供的HDAC10调控Th17细胞分化示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种缓解重症哮喘的药物、应用及动物模型构建方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明提供的动物模型构建方法包括以下步骤：

S101：利用HDAC10淋巴细胞条件性敲除(HDAC10

S102：小鼠肺组织的处理剪下右侧肺叶装于冻存管中，立即置于液氮罐中，待小鼠全部处理完毕后，统一转移至-80℃冰箱保存。用0.4ml，4％甲醛缓慢地灌注左侧肺叶，使左肺膨胀(内固定)，然后剪切整个肺叶放入装有4％甲醛的5ml EP管中(外固定)，固定1-2天后，进行脱水、包埋、切片、染色、免疫组化等。用HE染色观察气道炎症，PAS染色法观察气道粘液表达，用Masson染色观察胶原沉积。

S103：气道炎症评分用Olympus光学显微镜同条件下观察和拍照切片内气道(直径在300μm-1000μm之间，长、短径比例大于0.6的完整气道)，每张切片至少取10个视野。用半定量评分系统进行评分：0分，气道正常；1分，气道周围少许炎症细胞浸润；2分，有1层炎症细胞浸润气道；3分，有2﹣4层炎症细胞浸润气道；4分，超过4层的炎症细胞浸润气道。

S104：肺组织蛋白提取称取肺组织约50mg，置于2.0ml均浆管中，按1:10比例加入500μ1RIPA裂解液及5μl 100*PMSF，用匀浆机匀浆50HZ，90s。以上所有操作均在冰上进行。于4℃离心机13000rpm，离心15min，吸取上清于另一新的1.5ml Ep管中，-80℃保存备用于检测细胞因子或WB实验。

本发明提供的动物模型构建方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的动物模型构建方法仅仅是一个具体实施例而已。

下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。

第一部分：在T淋巴细胞上明确HDAC10与STAT3相互作用模式

本部分实验拟：首先，通过逆转录病毒及Cre/LoxP系统制备HDAC10

(1)T淋巴细胞及气道上皮细胞的分离：

T淋巴细胞：参照文献(J.Exp.Med，2015，212:607-617)方法，取6-8周龄雌性HDAC10

(2)逆转录病毒及Cre-LoxP系统获得HDAC10

1)Cre-LoxP系统敲除HDAC10基因原理及方法：

Cre-LoxP系统可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13bp的反向重复序列和一个8bp的核心序列。这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus ofX-over in P1)；②Cre重组酶，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)。本发明采用的HDAC10

利用CRISPR/Cas基因编辑构建(见图2)。该小鼠在HDAC10基因上下游各插入一个正向LoxP位点侧翼。本发明拟在分离小鼠T淋巴细胞后，向T淋巴细胞导入Cre酶，在Cre-LoxP的作用下，删除HDAC10基因。用RT-PCR及WB验证HDAC10基因敲除情况。

2)病毒转染过表达HDAC10

培养上述分离的HDAC10

(3)确定HDAC10与STAT3互相作用

1)检测HDAC10与STAT3结合：收集小鼠T淋巴细胞，用RIPA细胞裂解液裂解细胞，收集蛋白。用Co-IP方法检测它们的相互作用。分别用HDAC10抗体免疫沉淀，检测STAT3，或用STAT3抗体免疫沉淀，检测HDAC10表达。

2)检测HDAC10对STAT3的核定位及乙酰化影响：收集WT、HDAC10

3)检测HDAC10对STAT3转录活性：先将不同长度的STAT3基因启动子片段构建质粒转入上述细胞中。按照第一部分(1)的方法，利用荧光素酶报告系统检测荧光活性，寻找STAT3启动子关键区域。用双荧光素酶报告系统检测STAT3基因启动子各个片段的荧光活性。shHDAC10或HDAC10siRNA干扰，验证HDAC10对STAT3启动子活性影响。

第二部分确定HDAC10是否通过STAT3调控Th17/IL-17A表达

本部分主要从分离HDAC10

(1)确定HDAC10与STAT3相互作用对Th17/IL-17A表达影响

染色质免疫共沉淀(CHIP)检测IL-17A表达：收集WT、HDAC10

荧光素酶报告基因检测IL-17A表达：收集WT、HDAC10

(2)RNA干扰下调STAT3在HDAC10调控Th17/IL-17A表达中作用

利用RNA干扰STAT3表达，分别在WT、HDAC10

(3)逆转录病毒感染上调STAT3在HDAC10调控Th17/IL-17A表达中作用

利用STAT3逆转录病毒载体，通过Plat-E包装细胞制备过表达STAT3的逆转录病毒液，分别感染WT、HDAC10

(4)HDM联合LPS干预上述细胞，观察HDAC10对Th17/IL-17A表达影响

分离培养WT、HDAC10

第三部分验证HDAC10在重症哮喘小鼠模型中的作用

本发明参照文献(Exp TherMed.2017Sep；14(3):2126-2134.)方法(图3)，利用HDM联合LPS致敏、激发的方法已经成功建立了小鼠重症哮喘模型。本部分在此模型上，利用HDAC10

(1)HDAC10调控Th17细胞分化，如图4所示。

利用HDAC10淋巴细胞条件性敲除(HDAC10

(2)小鼠肺组织的处理剪下右侧肺叶装于冻存管中，立即置于液氮罐中，待小鼠全部处理完毕后，统一转移至-80℃冰箱保存。用0.4ml，4％甲醛缓慢地灌注左侧肺叶，使左肺膨胀(内固定)，然后剪切整个肺叶放入装有4％甲醛的5ml EP管中(外固定)，固定1-2天后，进行脱水、包埋、切片、染色、免疫组化等。用HE染色观察气道炎症，PAS染色法观察气道粘液表达，用Masson染色观察胶原沉积。

气道炎症评分用Olympus光学显微镜同条件下观察和拍照切片内气道(直径在300μm-1000μm之间，长、短径比例大于0.6的完整气道)，每张切片至少取10个视野。用半定量评分系统进行评分：0分，气道正常；1分，气道周围少许炎症细胞浸润；2分，有1层炎症细胞浸润气道；3分，有2﹣4层炎症细胞浸润气道；4分，超过4层的炎症细胞浸润气道。

(3)肺组织蛋白提取称取肺组织约50mg，置于2.0ml均浆管中，按1:10比例加入500μ1RIPA裂解液及5μl 100*PMSF，用匀浆机匀浆50HZ，90s。以上所有操作均在冰上进行。于4℃离心机13000rpm，离心15min，吸取上清于另一新的1.5ml Ep管中，-80℃保存备用于检测细胞因子或WB实验。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。