一株鞘氨醇单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于麦角硫因生物合成领域，具体涉及一株产麦角硫因的鞘氨醇单胞菌及其高产麦角硫因的培养方法。

背景技术

麦角硫因(ergothioneine，EGT)又名为2-硫基-L-组氨酸三甲基内盐，是存在于很多动植物体内含量丰富的天然抗氧化剂，仅在部分微生物(放线菌、链霉菌)、蕈菌、某些蓝细菌中合成，不能由动物机体自身合成。EGT纯品是白色晶体，水溶性，在生理pH值下和强碱溶液中不会自身氧化。

多项研究表明，EGT具有多种重要的生理功能，如抗炎功能、细胞保护功能、抗抑郁功能、眼睛保护功能、心脑血管保护功能、预防和治疗神经退行性疾病功能等。另外EGT水溶液的稳定性以及重金属离子螯合特性，是理想的移植器官保护液；EGT能够最大程度清除自由基的特性，可以保护细胞免受辐射损伤。其本身具有极佳的稳定性与生物安全性，因此在医药、食品和化妆品等领域具有广泛的应用前景。

由于化学合成EGT成本高昂，目前工业化的EGT生产方式主要是食用菌菌丝深层发酵，此方法EGT产量较低、发酵周期长且提取工艺复杂，因此，探索新的EGT合成菌株十分有必要。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一株鞘氨醇单胞菌。

本发明的另一目的在于提供上述鞘氨醇单胞菌的应用。

为了克服现有EGT生产来源菌株选择少、产量低、提取工艺复杂的缺点与不足，本发明提供一株高产EGT的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.HBJ-193及其高产EGT的培养方法。利用本方法对鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.HBJ-193进行发酵，其EGT产量由1.58mg/L提升至100.04mg/L。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一株鞘氨醇单胞菌，命名为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.HBJ-193，是从酒曲中分离得到。

所述的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.HBJ-193的保藏信息：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2022年03月29日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.24613。

所述的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.HBJ-193具有以下形态特征：菌落在LB平板上呈规则圆形，颜色为金黄色至橙黄色之间，菌落表面光滑，易挑起。

本发明还提供一种上述鞘氨醇单胞菌在液体发酵生产麦角硫因中的应用。

液体发酵所用的改良LB液体培养基的配方为：碳源2.5～15g/L，氮源2.5～17.5g/L，NaCl 10～15g/L，前体物0～64mM，pH4.4～9.4。

进一步，改良LB液体培养基的配方为：碳源2.5～10g/L，氮源7.5～17.5g/L，NaCl10～15g/L，前体物0～64mM，pH5.4～8.4。

再进一步，改良LB液体培养基的配方为：碳源2.5～7.5g/L，氮源10～15g/L，NaCl10～15g/L，前体物0～64mM，pH5.4～8.4。

所述的碳源为酵母提取粉、淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖醇、半乳糖、甘油、甘露醇中的至少一种；优选为甘油。

所述的氮源为硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵、硝酸钠、明胶、胰蛋白胨中的至少一种；优选为胰蛋白胨。

所述的前体物为半胱氨酸、组氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸中的至少一种；优选为半胱氨酸。

当前体物为半胱氨酸时，其含量为0～64mM；进一步为8～64mM；再进一步为32～48mM；更进一步为40mM。

当前体物为组氨酸时，其含量为0～32mM；进一步为0～8mM；更进一步为8mM。

当前体物为谷氨酸时，其含量为0～8mM；

当前体物为甲硫氨酸时，其含量为0～24mM；

液体发酵所用的发酵温度为25℃～37℃；进一步为25℃～30℃；更进一步为28℃。

液体发酵所用的发酵时间为96～192h；进一步为120～168h；更进一步为132～156h；再进一步为144h。

液体发酵所用的装液量为25～150mL/250mL；进一步为25～100mL/250mL；再进一步为25～50mL/250mL；更进一步为25mL/250mL。

本发明还提供一种利用上述鞘氨醇单胞菌高产麦角硫因的方法，包括如下步骤：

将鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.HBJ-193种子液接种至改良LB液体培养基中，振荡发酵培养，获得发酵液，实现高产麦角硫因的目的。

所述的振荡发酵培养的转速为150～200rpm；进一步为150rpm。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明不仅提供了一株高产EGT的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.HBJ-193，还通过优化实验提供了Sphingomonas sp.HBJ-193高产EGT的方法，为EGT的工业生产提供了新思路。

(2)本发明所提供的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.HBJ-193具有高效产麦角硫因的特点，并且该菌株在本发明中的发酵条件下具有更高效的产麦角硫因能力，具体体现在：

1)鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.HBJ-193合成的EGT主要分布在胞外，易于提取；

2)通过单因素及响应面实验获得鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.HBJ-193合成EGT最佳的发酵条件，其产量可高达100.04mg/L。本发明提供的鞘氨醇单胞菌Sphingomonassp.HBJ-193为新发现的EGT合成菌种，并且所提供菌株具有产量高、发酵时间短、发酵产物易于提取的特点，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是麦角硫因HPLC检测标准曲线。

图2是鞘氨醇单胞菌HBJ-193的菌株形态(左)及光学显微镜结果(右)。

图3是鞘氨醇单胞菌HBJ-193的系统进化树。

图4是麦角硫因层析液检测曲线。

图5是鞘氨醇单胞菌HBJ-193EGT的电喷雾电离质谱图。

图6是鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT最适碳源测定结果。

图7是鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT最适氮源测定结果。

图8是鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT最适碳源添加量测定结果。

图9是鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT最适氮源添加量测定结果。

图10是鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT最适培养基初始pH测定结果。

图11是鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT最适培养基装液量测定结果。

图12是鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT最适培养温度测定结果。

图13是培养温度-初始pH对鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT的响应面三维曲面图及等高线图。

图14是培养温度-氮源添加量对鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT的响应面三维曲面图及等高线图。

图15是氮源添加量-初始pH对鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT的响应面三维曲面图及等高线图。

图16是谷氨酸添加量对鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT影响的测定结果。

图17是组氨酸添加量对鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT影响的测定结果。

图18是甲硫氨酸添加量对鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT影响的测定结果。

图19是半胱氨酸添加量对鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT影响的测定结果。

图20是鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT最适培养时间测定结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特别说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例中所用LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.4；加入琼脂粉20g/L(仅固体培养基)。

实施例1 EGT合成菌株文库的构建

将酒曲添加到无菌水浸泡中，收集浸泡液并进行稀释后，涂布于平板上，恒温培养。挑取单菌落于平板上划线培养，反复纯化；得到单菌落后接种到相应的液体培养基，过夜培养获得种子液，以2％(v/v)的接种量接种到相应的液体培养基，细菌采用37℃，真菌采用25℃发酵，7d后取发酵液，10000r/min离心10min取菌体沉淀，ddH

HPLC检测条件为：使用岛津LC 2030 CN仪器进行麦角硫因高效液相色谱检测。所用色谱柱为Welch Ultimate HILIC AmphionⅡ色谱柱，检测波长为257nm，流动相为乙腈：水＝80：20，流速1mL/min，进样量20μL，柱温30℃。

麦角硫因标准曲线绘制：称取麦角硫因标准品，用少量超纯水溶解之后用超纯水定容，配置成梯度浓度的麦角硫因标准溶液：20、10、5、2.5、1.25mg/L。取约1mL各浓度的麦角硫因标准溶液过0.22μm水系微孔滤膜，然后在上述条件下分别进行HPLC检测。HPLC检测后记录不同浓度标准溶液所对应的峰面积，以峰面积为横坐标，以标准溶液浓度(mg/L)为纵坐标，制作线性回归方程。麦角硫因标准曲线见图1。测量样品后，可通过此方程换算出样品溶液中麦角硫因的浓度。

在上述测量方法下，编号为HBJ-193的菌株检测出EGT产量为0.6mg/gDW。

实施例2 HBJ-193的菌株鉴定

(1)形态学鉴定：将菌株HBJ-193涂布于LB平板上，30℃培养48h后观察其菌落特征如图2所示：菌落呈规则圆形，颜色为金黄色至橙黄色之间，菌落表面光滑，易挑起，光学显微镜观察，菌体呈细长的梭状结构。

(2)16S rDNA分子鉴定：

为确认HBJ-193的种属，采用16S rDNA测序比对方法对其进行鉴定。所用引物为16S通用引物27F和1492R，引物序列为：

27F：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′；

1492R：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；

模板制备方法为碱裂解。具体实施方法为：无菌环境下取50μL纯的菌株培养液，加入菌体裂解液50μL混匀，98℃金属浴30min，而后加入25μL菌体中和液混匀，得到用于分子生物学鉴定的分子扩增模板。菌体裂解液与菌体中和液的配置方法为：

菌体裂解液(50mM NaOH溶液)：称取2g NaOH，溶于80mL超纯水，彻底溶解后，使用超纯水定容至100mL，121℃，30min灭菌。

菌体中和液(1M Tris-HCl溶液，pH＝8.0)：称取15.76g Tris-HCl，溶于80mL超纯水，然后使用超纯水定容至100mL，使用NaOH调节pH至8.0，121℃，30min灭菌。

PCR扩增体系为：2×PrimeSTAR Max Premix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，分子扩增模板2μL，ddH

PCR扩增程序为：98℃2min；94℃30sec、55℃45sec、72℃8sec、30个循环；72℃5min。

得到菌株的rDNA扩增产物后，切胶回收相应片段进行Sanger法测序。获得下机数据后，使用软件Chromas解读峰图以去除接头污染与错读位点，使用软件seqMan拼接双向测序数据，得到用于比对的HBJ-193的16S rDNA核酸序列。得到菌株16S rDNA序列后，在NCBI网站的rDNA核酸库进行比对，比对结果显示，菌株HBJ-193与已报道的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas paucimobilis strain H4的16S rDNA基因序列同源性达到100％，以maximum score排序，取比对结果前50条序列，用MEGA v7.0.2做邻位归并法NeighborJoining做系统发育进化分析，取与HBJ-193分支接近的结果展示如图3所示，HBJ-193与Sphingomonas yabuuchia处于系统发育树同一分支，置信度为73，结合菌株HBJ-193的形态学特征，鉴定HBJ-193属于鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas sp.。

因此，将该菌株命名为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.HBJ-193，其保藏信息：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2022年03月29日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.24613。

所述的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.HBJ-193的16S rDNA基因序列如SEQ IDNO：1所示。

实施例3鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.HBJ-193发酵液EGT的纯化

(1)样品制备：鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.HBJ-193在装液量为100mL/250mL的LB液体培养基中30℃，150rpm震荡发酵6d，其接种量为2％(v/v)，得发酵液；取发酵液200mL，加入乙醇提取液(70％乙醇，0.17％SDS)800mL，4℃静置12h，8000rpm，20min离心取上清液，60℃，80rpm旋蒸浓缩至20mL以下，收集浓缩液，8000rpm，30min高速离心，取上清过0.22μm滤膜，待层析分离。

(2)葡聚糖凝胶预处理：称取25g葡聚糖凝胶Sephadex G-10置于烧杯中，加入适量去离子水浸泡溶胀24小时后静置，待凝胶完全沉降后倾去凝胶上层的水。再用2倍体积的去离子水缓缓倒入烧杯中，边倒边用玻璃棒轻轻将凝胶搅匀，避免颗粒破碎，静置5min使凝胶沉降，将悬浮与漂浮的细颗粒随上层水倒掉。浮选5次直至上层水中没有细颗粒为止；而后用保鲜膜将Sephadex G-10水溶液烧杯杯口封住，在保鲜膜上扎数个小孔，置于超声清洗器超声10min(应避免长时间超声振荡产生的高温)，除去凝胶溶液内的气泡。取出烧杯静置5min，倾去部分上层水使凝胶颗粒体积与上层水体积大致相当。

(3)装柱：将使用去离子水润洗后的1.6cm×60cm层析柱竖直夹定在铁架台上，打开柱入口，用恒流泵从柱出口注入去离子水(应避免产生气泡)，使管内最终水高3cm左右；轻轻搅动(防止再逸入空气)预处理好的Sephadex G-10溶液，形成均匀胶浆后迅速以玻璃棒引流沿壁倒入层析柱内，使胶浆自然沉淀出约2cm高的柱床后，打开柱出口使柱内水不停流出，同时从柱入口不停倒入胶浆，使柱内凝胶颗粒连续沉降最终柱高为40cm，如果柱床表面没有连续的凝胶颗粒沉降，应当使用玻璃棒轻轻搅动柱床表面使其重悬然后再加胶浆，否则会形成断层影响层析结果。装柱完成后需检查柱内凝胶是否有断层或气泡，如果有，应当重新装柱。检查无误后使柱床稳定15～20min，然后连接洗脱瓶和层析柱入口，使用恒流泵恒压过3～5倍柱体积的去离子水平衡层析柱，保持流速为1mL/min。

(4)上样和洗脱：上样前检查柱床表面是否平整，若不平整，可用玻璃棒轻轻搅动柱床，再使凝胶自然沉降为平整的柱床。关闭恒流泵，打开柱入口使柱内水自然流出，待液面下降至几乎露出柱床表面后关闭柱出口。使用移液枪浆2mL样品贴壁缓缓加入层析柱(避免冲击起柱床表面)，然后打开层析柱出口，使水缓慢流出以保证样品取代尽量的狭窄，样品全部进入凝胶后，贴壁在加入样品的地方轻轻加入去离子水(即洗脱液)，当液面高出柱床约3cm时，封闭柱入口并连接恒流泵，用洗脱液(去离子水)洗脱，控制出口流速保持为1mL/min，用15mL玻璃试管收集洗脱液，3mL/管，收集40管，分别使用HPLC法按照上述条件检测。检测结果如图4所示，第23～30管在EGT保留时间出峰，但是第23、24、29、30管麦角硫因含量较低，且峰面积占比小，杂质较多，因此将第25～28管收集液集中浓缩，制得EGT纯化提取物。

实施例4 HBJ-193合成EGT质谱确证

取实施例3所述HBJ-193发酵液的纯化提取液，进行LC-MS定性检测。检测委托给中山大学测试中心进行，仪器使用UPLC:Ultimate3000(Thermo Fisher，Germany)，MS:timsTOF(Bruker，Germany)，Mass参数为：Source type:ESI，Ion Polarity:positive，Capillary:4500V，Nebulizer:1.5Bar，Dry gas:8.0L/min，Dry temperature:220℃，色谱条件为：色谱柱使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18，柱温40℃，流动相A为0.1％FA，B为CH

表1 LC-MS流动相多级梯度比例

ESI-MS结果如图5所示，m/z中存在一个主分子离子[M+H]+，与计算的精确分子离子质量230.0963一致。离子片段的鉴定结果如下：m/z 186为2-(2-巯基-咪唑-5-基)N,N,N-三甲基-1-氨基(C

实施例5鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT的发酵体系的优化

(一)、鞘氨醇单胞菌HBJ-193的接种量为2％(v/v)，在装液量为150mL/250mL的LB液体培养基中37℃，150rpm震荡发酵168h，得发酵液；该发酵液中EGT产量为1.58mg/L。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.4。

(二)、鞘氨醇单胞菌HBJ-193高产EGT的发酵体系的优化通过以下步骤实施：

(1)不同碳源：发酵培养基的配方在LB液体培养基的基础上改进，菌株HBJ-193在改良LB液体培养基中振荡发酵，在培养基碳源分别为酵母提取粉、淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖醇、半乳糖、甘油、甘露醇时，其中，接种量为2％(v/v)，装液量为100mL/250mL的LB液体培养基中30℃，150rpm震荡发酵168h，得发酵液；碳源是甘油的发酵液经过提取纯化并使用HPLC法检测的EGT产量最高(图6)。

(2)不同氮源：发酵培养基的配方在LB液体培养基的基础上改进，菌株HBJ-193在改良LB液体培养基中振荡发酵，在培养基氮源分别为硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵、硝酸钠、明胶、胰蛋白胨时，其他发酵条件参照上述步骤(1)；氮源为胰蛋白胨的发酵液经过提取纯化并使用HPLC法检测的EGT产量最高(图7)。

(3)不同用量的甘油：菌株HBJ-193分别在碳源甘油含量为2.5g/L、5g/L、7.5g/L、10g/L、12.5g/L、15g/L的改良LB液体培养基中振荡发酵，其他发酵条件参照上述步骤(1)；当培养基中的甘油含量为7.5g/L时的发酵液经过提取纯化并使用HPLC法检测的EGT产量最高(图8)。

(4)不同用量的胰蛋白胨：菌株HBJ-193分别在氮源胰蛋白胨含量为2.5g/L、5g/L、7.5g/L、10g/L、12.5g/L、15g/L、17.5g/L的改良LB液体培养基中振荡发酵，其他发酵条件参照上述步骤(1)；当培养基中的胰蛋白胨含量为12.5g/L时的发酵液经过提取纯化并使用HPLC法检测的EGT产量最高(图9)。

(5)不同初始pH：发酵培养基的初始pH为7.4的LB液体培养基的基础上改进，菌株HBJ-193分别在初始pH为3.4、4.4、5.4、6.4、7.4、8.4、9.4振荡发酵时，其他发酵条件参照上述步骤(1)；当初始pH为5.4时的发酵液经过提取纯化并使用HPLC法检测的EGT产量最高(图10)。

(6)不同装液量：发酵培养基的装液量在100mL/250mL的LB液体培养基的基础上改进，菌株HBJ-193分别在25mL/250mL、50mL/250mL、75mL/250mL、100mL/250mL、150mL/250mL、200mL/250mL的装液量下振荡发酵时，其他发酵条件参照上述步骤(1)；当装液量为25mL/250mL时的发酵液经过提取纯化并使用HPLC法检测的EGT产量最高(图11)。

(7)不同培养温度：菌株HBJ-193分别在25℃、28℃、30℃、34℃、37℃的温度下振荡发酵时，除了培养温度，其他发酵条件均参照上述步骤(1)；当温度为28℃时的发酵液经过提取纯化并使用HPLC法检测的EGT产量最高(图12)。

根据上述优化实验，对氮源(胰蛋白胨)添加量、初始pH、培养温度进行三因素三水平响应面优化，其中，改良LB液体培养基中除了氮源(胰蛋白胨)，其余组分及含量为：甘油7.5g/L，NaCl 10g/L；接种量为2％(v/v)，装液量为100mL/250mL，150rpm震荡发酵6d。使用软件Design-Expert.V8.0.6.1软件进行Box-Behnken实验设计，所得因素水平表如表2所示，实验结果如表3所示。根据表格中的数据进行回归拟合，得到以麦角硫因产量为响应值的二次多元回归方程：

P＝+23.29+0.87A-0.21B+0.65C+1.26AB+1.73AC+0.69BC-3.70A

(其中，P：EGT产量；A：pH；B：温度；C：氮源添加量)

表2 Box-Behnken设计因素及水平表

表3 Box-Behnken设计实验结果

在上述方程中，系数绝对值的大小可表示该因素对产量的影响大小，且系数的正负值可以反映影响的方向。因此可得出，在本实验中，响应值麦角硫因的影响因素从大到小分别是：pH>氮源添加量>温度，且方程中的二次项系数均为负值，可知响应值的抛物面图形开口向下，在实验范围内具有极大值，可用于优化实验。

利用软件Design-Expert.V8.0.6.1进行多元二次拟合，得到响应面三维曲面图和等高线图，如图13、14、15。

三种因素中任意因素的增加均会导致EGT产量呈先增加后减少的趋势，三种交互组合中，三维曲面均开口向下，有一个极大值，通过等高线图分析可推断，培养温度与初始pH对菌株HBJ-193的EGT产量影响较强，可为菌株HBJ-193产EGT工业化发酵提供指导。

在优化后的培养基和培养条件下，以单因素实验的方法额外添加不同工作浓度的前体物：组氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸，其中，改良LB液体培养基：甘油7.5g/L，胰蛋白胨12.5g/L，NaCl 10g/L，pH5.4；培养条件为：接种量2％，温度28℃，装液量50mL/250mL，150rpm，培养6d。当半胱氨酸的工作浓度为40mM时的发酵液经过提取纯化并使用HPLC法检测的EGT产量最高(69.28mg/L)(图16、17、18、19)。

综上，根据上述优化实验，探索不同发酵时间的EGT产量：

菌株HBJ-193在优化后LB培养基(即改良LB液体培养基：甘油7.5g/L，胰蛋白胨12.5g/L，NaCl 10g/L，pH5.4)中，接种量2％，装液量25mL/250mL，培养温度28℃，转速150rpm，半胱氨酸添加量为40mM，每12h取一次发酵液，8000rpm离心分别收集菌体沉淀与上清，上清液加入4倍体积乙醇提取液，4℃过夜，菌体沉淀使用无菌水洗涤3次，然后加入1mL无菌水重悬，再加入4mL乙醇提取液4℃过夜，过夜提取液均经过高速离心取上清，过0.22μm滤膜后使用HPLC检测，结果如图20所示，在培养时间为144h时菌株HBJ-193的EGT产量达到最高，胞内外EGT产量总和达到100.04mg/L。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株鞘氨醇单胞菌及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp. HBJ-193的16S rDNA

<400> 1

tattgctagg ttggcgcaac gccttcgggt gaatccaact cccatggtgt gacgggcggt 60

gtgtacaagg cctgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta ctagcgattc 120

cgccttcatg ctctcgagtt gcagagaaca atccgaactg agacaacttt tggggattag 180

ctcgccctcg cagggtcgct gcccactgta gttgccattg tagcacgtgt gtagcccagc 240

gcgtaagggc catgaggact tgacgtcatc cccaccttcc tccggcttat caccggcggt 300

tcctttagag tacccaacca aatgatggta actaaaggcg agggttgcgc tcgttgcggg 360

acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacagcca tgcagcacct gtgtgtaggt 420

ccccgaaggg aagaaatcca tctctggaag tcgtcctacc atgtcaaacg ctggtaaggt 480

tctgcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcaggcc cccgtcaatt 540

cctttgagtt ttaaccttgc ggccgtactc cccaggcgga taacttaatg cgttagctgc 600

gccacccaag caccaagtgc ccggacagct agttatcatc gtttacggcg tggactacca 660

gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcacctc agcgtcaata ccagtccagt 720

cagccgcctt cgccactggt gttcttccga atatctacga atttcacctc tacactcgga 780

attccactga cctctcctgg attcaagcga tgcagtctca aaggcagttc tggagttgag 840

ctccaggctt tcacctctga cttacaaagc cgcctacgtg cgctttacgc ccagtaattc 900

cgaacaacgc tagccccctc cgtattaccg cggctgctgg cacggagtta gccggggctt 960

attctcccgg tacagtcatt atcttcccgg gtaaaagagc tttacaaccc tagggccttc 1020

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<210> 2

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<400> 3

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