一种苜蓿-蚯蚓-白腐真菌联合修复多环芳烃污染土壤的方法

技术领域

本发明属于生物修复法修复多环芳烃污染土壤技术领域，具体涉及一种苜蓿-蚯蚓-白腐真菌联合修复多环芳烃污染土壤的方法。

背景技术

上世纪80年代发达国家就已经遭受到严重的多环芳烃有机污染，污染修复技术和相关产业已经成为发展热点，中国随着经济的发展，带来的环境问题越发严重，相关修复技术，从引进到消化吸收，并根据自身的土地资源特点和实际国情各项工作在循序渐进。但由于技术难度大等因素，实际的发展速度很慢，目前植物修复是国内工作的重点。国内的微生物降解研究工作也不断有突破，国内最新研究提出了基于土壤自然微生物群落构建复合微生物组的生物修复策略，并将其用于高分子量多环芳烃污染土壤的生物修复。目前各种污染场地常见的多环芳烃有机污染土壤主要靠物理修复、化学修复、生物修复等技术。

生物修复技术是在生物降解的基础上发展起来的一种新兴的清洁技术，它是传统的生物处理方法的发展。与物理、化学修复污染土壤技术相比，它具有成本低、不破坏植物生长所需要的土壤环境、污染物氧化安全、无二次污染、处理效果好、操作简单等特点。生物修复可通过环境因素的最优化而加速自然生物降解速率，是一种高效、经济和生态可承受的清洁技术。

目前，治理多环芳烃污染土壤的生物修复技术主要有两类：一类是微生物修复技术，按修复的地点又可分为原位生物修复和异位生物修复；另一类是植物修复法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用苜蓿-蚯蚓-白腐真菌联合修复多环芳烃污染土壤的方法，对多环芳烃污染土壤进行修复，从而达到恢复地方土壤自然生态环境。

本发明采用的技术方案是：

一种苜蓿-蚯蚓-白腐真菌联合修复多环芳烃污染土壤的方法，包括如下步骤：

1)将多环芳烃污染土壤过3mm筛，每盆装500g，备用；

2)将10g白腐真菌剂均匀施撒于多环芳烃污染土壤上，并与地表至0～10cm深的多环芳烃污染土壤混合均匀后，放入5条蚯蚓；

3)播种20粒苜蓿种子，覆多环芳烃污染土壤1～2cm，一周后间苗，每盆保留6株；修复60天。

进一步的，上述的一种苜蓿-蚯蚓-白腐真菌联合修复多环芳烃污染土壤的方法，步骤2)中，所述白腐真菌剂的制备方法包括如下步骤：

1)将10mL白腐真菌菌种在无菌条件下接种到培养基中；

2)将已接种白腐真菌菌种的培养基放入恒温振荡器中培养7天，得到白腐真菌剂，备用。

更进一步的，上述的一种苜蓿-蚯蚓-白腐真菌联合修复多环芳烃污染土壤的方法，所述培养基的制备方法包括如下步骤：

1)将200g土豆去皮，切成条状置于1000mL沸水中煮沸，保持20min，降温后将土豆捏碎并用纱布过滤，取滤液；

2)向步骤1)得到的滤液中加入20g葡萄糖，装入1000mL容量瓶并用去离子水定容，然后利用超声辅助20min使其分散均匀；

3)将容量瓶中的培养基分装入250mL三角瓶中，每个三角瓶装量为100mL，并将其用纱布以及牛皮纸封口，最后湿热灭菌，放入冰箱中备用。

更进一步的，上述的一种苜蓿-蚯蚓-白腐真菌联合修复多环芳烃污染土壤的方法，步骤2)中，所述恒温振荡器的设置条件为：28℃，150r/min。

进一步的，上述的一种苜蓿-蚯蚓-白腐真菌联合修复多环芳烃污染土壤的方法，所述的苜蓿种子为紫花苜蓿种子。

进一步的，上述的一种苜蓿-蚯蚓-白腐真菌联合修复多环芳烃污染土壤的方法，所述蚯蚓为赤子爱胜蚓。

更进一步的，上述的一种苜蓿-蚯蚓-白腐真菌联合修复多环芳烃污染土壤的方法，所述赤子爱胜蚓为龄期二个月、重量0.25g的赤子爱胜蚓。

更进一步的，上述的一种苜蓿-蚯蚓-白腐真菌联合修复多环芳烃污染土壤的方法，所述赤子爱胜蚓，首先将其在实验室内进行培养2周，然后用去离子水充分清洗，使其体表与肠道内的菌根孢子彻底去除，然后将其放入无菌塑料培养皿中培养24小时，让其清空肠内物，使用前再次用去离子水清洗。

本发明的有益效果为：

1、本发明中，紫花苜蓿是豆科苜蓿属，草本中的多年生植物，对自然条件适应性很强，在世界各地均有分布。因其是豆科植物，根系中伴生根瘤菌，而根瘤菌可以固定空气中游离态的氮，通过自身的转化除供给苜蓿生长发育，另外根瘤菌脱落留在土壤，其大量的氮素继续滋养土壤，起到改良土壤的作用。特别是其根系发达，适应于各种气候环境，对土壤环境条件要求不高，已被广泛应用于多环芳烃污染土壤的植物修复，并且取得了不错的效果。

2、本发明中，白腐真菌是一类可降解木质素、营腐生生活的白色丝状真菌，可以分泌胞外氧化酶，对木质素的降解能力优于降解纤维素，白腐真菌也能够依赖胞内酶降解一些多环芳烃。白腐真菌中的黄孢原毛平革菌拥有150多个功能未知的P450基因，是迄今所知的P450基因最丰富的真菌。P450是一类含高铁血红素IX的单加氧酶，参与多环芳烃的降解。白腐真菌分布也广，是典型的广布种，适应于不同的气候和土壤条件。通过微生物降解机理已知，白腐真菌通过细胞色素P450单加氧酶和木质素降解酶转化途径，既能把多环芳烃作为碳源，也能通过共代谢降解多环芳烃。

3、本发明，赤子爱胜蚓是环节动物门寡毛纲正蚓科爱胜蚓属，广泛分布于全球各地，是典型的土壤动物，适应于不同的土壤环境条件，蚯蚓吸收多环芳烃包括两个过程，一是取食吸收，二是皮肤接触吸收。进入蚯蚓体内的多环芳烃被蚯蚓代谢或富集于蚯蚓组织中或在空泡中，在各种微生物、分解酶和粘液的作用下，实现降解。其次，蚯蚓通过刺激土壤微生物的生长促进多环芳烃降解。一方面，蚯蚓的活动改变了土壤的结构，使其有利于微生物的生长。另一方面，蚯蚓的活动使土壤形成有氧环境，促进微生物降解多环芳烃。此外，蚯蚓的活动作用过的土壤，粒径变小、碳氮比降低，促进污染物与土壤微生物之间的接触。由此促进了微生物对多环芳烃的降解。

4、本发明，苜蓿-蚯蚓-白腐真菌三者联合使用，能相互协作、提高修复效果：一是三元体系(苜蓿-蚯蚓-白腐真菌)中就包括了三种二元体系，即苜蓿-微生物联合修复体系、苜蓿-蚯蚓联合修复体系以及蚯蚓-白腐真菌联合修复体系，多个二元体系共同发挥作用；二是蚯蚓强化植物-微生物修复作用；三是三元体系的相互促进作用更能提高土壤酶活性。三方面原因共同提高了土壤中菲的生物降解能力，达到了较好的去除效果。

附图说明

图1为不同处理条件下土壤中的菲残留量对比图。

图2为不同处理条件下土壤中的菲去除率对比图。

具体实施方式

实施例1

(一)多环芳烃污染土壤的制备：

1)将无污染历史的表层土壤(10-20cm)采集后风干，过筛(3mm)备用；

2)用200mL丙酮溶解实验所需要的菲，然后加入到100g土壤中，充分搅拌，制作成第一母体菲污染的土壤；

3)将第一母体菲污染土壤中的丙酮挥发干后，再加入到900g土壤中，充分搅拌后，制作成第二母体菲污染土壤，即获得标准的菲污染土样；

4)将标准的菲污染土样与未污染的土壤配制所需要的不同污染水平的土壤，配好后放置4天，每天混合1次，最后分装到带有底盘的盆中，每盆500g(盆直径15cm，高10cm)，放置1周平衡后备用。

(二)白腐真菌剂的制备：

1)培养基的制备：

1.1)将200g土豆去皮，切成条状置于1000mL沸水中煮沸，保持20min，降温后将土豆捏碎并用纱布过滤，取滤液；

1.2)向步骤1.1)得到的滤液中加入20g葡萄糖，装入1000mL容量瓶并用去离子水定容，然后利用超声辅助20min使其分散均匀；

1.3)将容量瓶中的培养基分装入250mL三角瓶中，每个三角瓶装量为100mL，并将其用纱布以及牛皮纸封口，最后湿热灭菌，放入冰箱中备用。

2)将白腐真菌菌种在无菌条件下接种到培养基中；

3)将已接种白腐真菌菌种的培养基放入恒温振荡器(28℃，150r/min)培养7天，得到白腐真菌剂，备用。

(三)赤子爱胜蚓的培养：

首先将龄期二个月、重量0.25g的赤子爱胜蚓在实验室内进行培养2周，然后用去离子水充分清洗，使其体表与肠道内的菌根孢子彻底去除，然后将其放入无菌塑料培养皿中培养24小时，让其清空肠内物，使用前再次用去离子水清洗，备用。

(四)将多环芳烃污染土壤过筛(3mm)备用；

(五)将10g白腐真菌剂均匀施撒于多环芳烃污染土壤上，并与地表至0～10cm深的多环芳烃污染土壤混合均匀后，放入5条蚯蚓；

(六)播种20粒苜蓿种子，覆多环芳烃污染土1～2cm，一周后间苗，每盆保留6株；修复60天。

实施例2

(一)以南京一个农场的场地为实验地，如表1设置7个实验区域，每个实验区域划分5块。

表1 7个实验区域的修复处理方式和目的

本实验共设置7个实验区域，分别按照表1中的7种修复处理方式对多环芳烃污染土壤进行修复，每种处理方式设5个平行样，土壤中菲含量为151mg/kg，实验时间为60天。

(二)苜蓿-蚯蚓-白腐真菌联合修复(苜蚯白)方法

1)将多环芳烃污染土壤过筛(3mm)备用；

2)按每500g土壤，将10g白腐真菌剂均匀施撒于多环芳烃污染土壤上，并与地表至0～10cm深的多环芳烃污染土壤混合均匀后，放入5条赤子爱胜蚓；

3)播种20粒苜蓿种子，覆多环芳烃污染土1～2cm，一周后间苗，每盆保留6株；为了保证紫花苜蓿的生长，于土地施畜圈粪6-7kg/m

上述白腐真菌剂、赤子爱胜蚓、多环芳烃污染土壤的制备方法同实施例1。

(三)分析测定方法

在实验结束时，采集土壤、苜蓿和蚯蚓样品。其中苜蓿采集整个植株，地上部分为茎叶，地下部分为根。所有样品收集后，分成两组，一组用于生物分析，另一组用于化学分析。

苜蓿先用蒸馏水洗净后自然风干，然后用电子天平测定其生物量，最后粉碎研磨，供分析菲含量用。蚯蚓先用蒸馏水洗第一遍，然后用去离子水再洗净，然后放置24h，待其排尽体内杂质后，再用去离水洗净、用滤纸吸干、称重。最后用液氮将其冷冻后放于研钵中，加入其体重1.5倍的Na

(四)检测结果

1、修复60天后，经各处理方式修复的各样品的土壤中的菲残留量均比对照例低。从图1可见，苜蓿-蚯蚓-白腐真菌联合修复体系(苜蚯白)土壤中的菲残留量最低，说明了苜蓿-蚯蚓-白腐真菌联合修复体系(苜蚯白)效果最好。

2、修复60天后，经各处理方式修复的各样品的土壤中的菲去除率均比对照例高。从图2可见，苜蓿-蚯蚓-白腐真菌联合修复体系(苜蚯白)的去除率最高，达到93％，其次是苜蓿-白腐真菌联合修复、苜蓿-蚯蚓联合修复两种生物联合修复，去除率在74％-85％；最低是单一物种修复，去除率在33％-65％。这进一步说明了苜蓿-蚯蚓-白腐真菌联合修复体系(苜蚯白)效果最好。