一株蜡样芽胞杆菌及其在重金属污染治理中的应用

技术领域

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株蜡样芽胞杆菌及其在重金属污染治理中的应用。

背景技术

制革、电镀、无机盐生产、采矿等工业的不断发展产生了越来越多的铬污染水，含有大量以阴离子形式存在的Cr(VI)，污染土壤和地下水。Cr(VI)在碱性环境下主要以CrO

目前主流的修复原理是将Cr(VI)还原为毒性和迁移性更小的Cr(III)。应用广泛的化学修复方法使用了大量的能源和原材料，导致处理成本过高，大量的化学原料还会造成二次污染，修复后易于出现“返黄”现象。生物还原具有高效率、低成本、修复效果稳定和无污染的优势。诸多生物修复方法中，细菌修复利用污染场地筛选的细菌的生长过程进行现场处理，适应性及耐受性更强。由于Cr(VI)污染场地高盐、强碱、微氧、高铬等复杂条件，因此需要筛分合适的高效还原菌，同时对其还原体系进行优化设计以提高还原效率和稳定性。

发明内容

为解决相关问题，本发明的首要目的在于提供一株蜡样芽胞杆菌。这是一株能在厌氧、高盐、高碱、高铬等恶劣条件下高效还原Cr(VI)的细菌。

本发明的另一目的在于提供上述蜡样芽胞杆菌的应用。所述应用方法环保、高效、成本。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一株蜡样芽胞杆菌，该菌株命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)RCr，并于2023年6月13日保藏于广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCC No：63556。

上述蜡样芽胞杆菌在重金属污染治理中的应用。

进一步地，所述的重金属为Cr(VI)、Fe(III)中的任意一种或多种。

进一步地，所述的重金属污染治理的具体操作为：将所述的蜡样芽胞杆菌置于含有重金属的环境中培养，实现重金属的还原去除。

进一步地，所述的环境包括但不限于培养基、土壤和水体。

所述的培养基为LB液体培养基。

所述的培养基的组成为：蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、氯化钠5.0g，去离子水1L。

进一步地，所述的蜡样芽胞杆菌的接种量为1％～5％，培养时间为24～96h；更进一步地，所述的蜡样芽胞杆菌的接种量为4％～5％，培养时间为24～48h。

进一步地，所述的环境同时为高碱度环境、高盐度环境、高温度环境和/或厌氧环境。

所述的高碱度环境是指pH＝7～11的碱性环境；进一步指pH＝9～10的碱性环境；更进一步指pH＝9.3～10的碱性环境。

所述的高盐度环境是指NaCl浓度在5～10g/L范围内的环境；进一步指NaCl浓度在8～10g/L范围内的环境；更进一步指NaCl浓度在9～10g/L范围内的环境。

所述的高温度环境是指温度在25～45℃范围内的环境；进一步指温度在35～45℃范围内的环境；更进一步指温度在40～45℃范围内的环境。

进一步地，当所述的重金属为Cr(VI)时，其在环境中的浓度在400mg/L以内；进一步在150mg/L以内；更进一步在50mg/L以内。当体系中Cr(VI)的浓度为50mg/L，可在1d内全部还原。

进一步地，当所述的重金属为Cr(VI)时，所述的应用的操作为：将所述的蜡样芽胞杆菌置于含有重金属的环境中培养，同时外加Fe(Ⅲ)和/或碳源，实现重金属的还原去除。

所述的外加Fe(Ⅲ)为加入0.1～2g/L FeCl

所述的外加碳源为加入葡萄糖2～5g/L；进一步为加入葡萄糖3～4g/L。

进一步地，当所述的重金属为Fe(Ⅲ)时，其在环境中的浓度在2g/L以内；进一步在1.5g/L以内。

本发明的技术原理：本发明提供的菌株Bacillus cereusRCr为异化金属还原菌，有较强的还原能力，可以通过自身的生长代谢途径还原Cr(VI)，Fe(Ⅲ)的加入使该途径加强，体系中的铁易于形成Fe

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供的菌株Bacillus cereusRCr可在厌氧、高盐、高碱、高铬等恶劣条件高效还原Cr(VI)，接种对数期细菌培养液4.3％到最佳还原体系(LB培养基加入葡萄糖3g/L、FeCl

附图说明

图1为菌株RCr的形态观察图；其中，A为平板菌落形态，B为扫描电镜图。

图2为菌株RCr的系统发育树。

图3为厌氧环境LB培养基中菌株RCr在不同浓度下Cr(VI)的还原率图及生长曲线图。

图4为厌氧环境LB培养基中不同培养条件下对菌株RCr还原50mg/L Cr(VI)的影响图。

图5为厌氧环境菌株RCr对50mg/LCr(VI)还原的响应面图；图中：A为温度与接种量相互作用的3D直观图(左)和等高线图(右)；B为本发明中温度与pH相互作用的3D直观图(左)和等高线图(右)；C为温度和葡萄糖浓度相互作用的3D直观图(左)和等高线图(右)。

图6为厌氧环境菌株RCr对50mg/LCr(VI)还原的响应面图；图中：A为接种量和葡萄糖浓度相互作用的3D直观图(左)和等高线图(右)；B为pH和接种量相互作用的3D直观图(左)和等高线图(右)；C为pH和葡萄糖浓度相互作用的3D直观图(左)和等高线图(右)。

图7为厌氧环境最佳还原体系中FeCl

图8为最佳还原体系还原Fe(III)的效果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。对于未特别注明的工艺参数，按照常规技术。

实施例1：蜡样芽胞杆菌RCr的筛选、鉴定与还原Cr(VI)的性能测定

(1)富集：在厌氧手套箱里，从采集自韶关市无机盐厂Cr(VI)重污染区域(Cr

(2)分离和纯化：在厌氧手套箱里，向已灭菌的5支离心管中加入4mL 50mg/L的铬液(PH＝8.5)，再用移液枪移取1mL上清液于1号离心管中，摇匀之后用移液枪移取1mL的1号稀释液于2号离心管，同样操作依次做到5号离心管，形成稀释倍数为10

LB液体培养基：蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、氯化钠5.0g，去离子水1L。

LB固体培养基：蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、氯化钠5.0g，琼脂15.0g，去离子水1L。

(3)鉴定：平板观察该菌落的形态(如图1中的A所示)，其呈灰白色、不透明，表面似融蜡状，边缘常呈扩展状。电子显微镜下观察该菌体的形态为短棒状(如图1中的B所示)。经16S rDNA测序(广州巡循生物医药科技有限公司)，得到基因序列(SEQ ID NO.1)。通过NCBIBLAST比对，获得与目标菌株相关菌株的碱基序列，随后在MEGA软件中构建系统发育树(如图2所示)，分析菌株之间的关系，确定菌种类型与蜡样芽胞杆菌属(Bacillus cereus)相似同源性达99％，因此推定该菌为蜡样芽孢杆菌。综上，初步判断该菌株为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus，将该菌株命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)RCr，并于2023年6月13日保藏于广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCC No：63556。

(4)性能：用LB培养基将菌株RCr培养至对数期，按1％(V/V)的比例分别将该菌悬液接种至含Cr(VI)50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L的LB培养基中，在35℃厌氧培养箱中静置培养，在第0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4天的同一时间分别取样测定培养液中Cr(VI)的剩余量，实验结果见图3。菌株对Cr(VI)的还原率较高。其中，50mg/L的实验组3.5天时菌株对Cr(VI)的还原率达99.91％。100mg/L的实验组4天时还原率有87.63％，150mg/L的实验组4天时还原率也有73.25％。随着Cr(VI)初始浓度继续增高，还原速率减慢，但400mg/L时，4天的还原率仍有15.5％。

本实施例说明分离的菌株RCr有较强的Cr(VI)还原能力。Cr(VI)最大浓度为400mg/L。

实施例2：菌株还原条件优化研究

采用Plackett Burman法、响应面法的Box-Benhnken模型研究温度、转速、接种量、初始Cr(VI)浓度、pH、葡萄糖浓度(碳源)、胰蛋白胨浓度(氮源)对六价铬还原菌株生长和还原性能的影响，从而对该菌株的还原条件进行优化，以提高菌株的还原能力。

1.Plackett Burman实验探究温度、转速、接种量、初始Cr(VI)浓度、pH、葡萄糖浓度、胰蛋白胨浓度对Cr(Vl)还原的影响程度。

表1Plackett Burman实验设计及结果

表2Plackett Burman实验显著性分析

选用LB培养基，调节pH为8.5，灭菌后趁热放入厌氧手套箱，冷却后调Cr(VI)浓度为50mg/L，分装12个厌氧瓶，每个液体量为100mL，按照表1中的实验设计进行实验。全部操作都在厌氧手套箱完成，最后放入恒温厌氧手套箱，培养2d，测定剩余Cr(VI)含量和OD600，计算还原率。由表2可知，各因素影响大小：pH>葡萄糖浓度>温度>接种量>胰蛋白胨浓度>NaCl浓度，可见，该菌对盐分、氮源并不敏感。

2.四种最敏感因素的单因素实验以确定中心点

于厌氧瓶加入50mL LB培养基，初始Cr(VI)浓度为50mg/L。做4组改变不同因素的实验：pH为7，8，9，10，11，温度为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，接种量为1％、2％、3％、4％、5％，葡萄糖浓度为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L，各组实验未另行规定的因素定为pH值8.5、温度35℃、接种量2％、葡萄糖浓度1g/L。所有操作均在厌氧手套箱内完成，所有试剂均脱氧，所有样品均在厌氧恒温箱培养。2d后取样，通过紫外分光光度计测定OD

3.响应面法中的Box-Benhnken模型

实验方法同单因素实验，实验设计如表3。以Cr(VI)还原率为响应值(Y)，对温度(A)、接种量(B)、pH(C)、葡萄糖浓度(D)四个因素进行回归拟合，得到二次多项回归方程：Y＝94.38+1.06A+2.20B+9.33C+0.93D-0.55AB-2.69AC-2.69AD-0.62BC-2.19BD-3.31CD-3.25A

表3 Box Benhnken实验设计及结果

表4Box Benhnken实验方差分析

(1)温度与接种量相互作用对还原的影响(图5中的A)

随着温度的增加还原率上升，至41℃时，达到最大；当温度为40℃时，接种量全范围的还原率都达到最大，这其中，接种量为4.3％时，处于3D直观图的最顶部区域，对应等高线图最内的椭圆区域，最大值为94.81％。

(2)温度与pH相互作用对还原的影响(图5中的B)

温度与pH的P<0.05，相互作用显著(表4)。随着pH的增加还原率上升，至9.3时，达到最大；当pH为9.3时，温度全范围的还原率都达到最大，这其中，温度为40℃时，处于3D直观图的最顶部区域，对应等高线图最内的椭圆区域，最大值为96.79％。

(3)温度与葡萄糖浓度相互作用对还原的影响(图5中的C)

温度与葡萄糖浓度的P<0.05，相互作用显著(表4)。随着温度的增加还原率上升，至40℃时，达到最大；当温度为40℃时，葡萄糖浓度全范围的还原率都达到最大，这其中，葡萄糖浓度为3.1g/L时，处于3D直观图的最顶部区域，对应等高线图最内的椭圆区域，最大值为94.48％。

(4)接种量和葡萄糖浓度相互作用对还原的影响(图6中的A)

接种量与葡萄糖浓度的P<0.05，相互作用显著(表4)。随着接种量的增加还原率上升，至4.3％时，达到最大；当接种量为4.3％时，葡萄糖浓度全范围的还原率都达到最大，这其中，葡萄糖浓度为3g/L时，处于3D直观图的最顶部区域，对应等高线图最内的椭圆区域，最大值为94.76％。

(5)pH和接种量相互作用对还原的影响(图6中的B)

随着接种量的增加还原率上升，至4.3％时，达到最大；当接种量为4.3％时，pH全范围的还原率都达到最大，这其中，当pH为9.3时，处于3D直观图的最顶部区域，对应等高线图最内的椭圆区域，最大值为97.06％。

(6)pH和葡萄糖浓度相互作用对还原的影响(图6中的C)

pH与葡萄糖浓度的P<0.05，相互作用显著(表4)。随着pH的增加还原率上升，至9.3时，达到最大；当pH为9.3时，葡萄糖浓度全范围的还原率都达到最大，这其中，当葡萄糖浓度为3g/L时，处于3D直观图的最顶部区域，对应等高线图最内的椭圆区域，最大值为96.83％。

以上结果说明，该菌对高盐分不敏感，对氮源的依赖性也较低，在中碱性有较宽的pH范围、中高温有较宽的温度范围、较低的葡萄糖浓度和接种量就可有很好的还原效果，最佳值分别为9.3、40℃、3g/L、4.3％。

实施例3：Fe(III)提升最佳体系还原Cr(VI)的性能

在最佳还原体系中加入FeCl

本实施例说明还原体系加入少量FeCl

实施例4：补充Fe(III)的最佳体系还原场地Cr(VI)污染水的性能

取40ml含97.6mg/LCr(VI)的场地污水于离心管中，加入0.8gLB培养基，加入葡萄糖0.12g，FeCl

本实施例说明补充Fe(III)的最佳还原体系对自然环境中的Cr(VI)污水有较高的还原率。

实施例5：最佳还原体系还原Fe(Ⅲ)的性能

在最佳还原体系中加入FeCl

本实施例说明最佳还原体系对Fe(Ⅲ)有较高的还原率。

实施例6：最佳还原体系还原Cr(VI)的性能对比

本发明的Bacillus cereus RCr与其它修复剂的去除能力对比(表5)，表明Bacillus cereus RCr构建的还原体系具有较好的修复效果。

表5不同修复剂的Cr(VI)去除能力对比

表5参考文献：

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以上为本发明的最优实施例，本领域技术人员完全可以不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多种修改及优化。而这些所有的修改和优化都包括在如本发明权利要求所限定的范围之内，并不脱离本发明所包含的精神实质和所要求的实用型范围。