用于马铃薯帚顶病毒PCR检测的引物探针组、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，尤其涉及用于马铃薯帚顶病毒PCR检测的引物探针组、试剂盒及检测方法。

背景技术

马铃薯是我国第四大粮食作物，在生长过程中易受多种病毒侵染，其中马铃薯帚顶病毒(potato mop-top virus，PMTV)致病性强、危害严重，被我国列入进境植物检疫禁止进境物名录。其基因组包含三个分别包裹在衣壳蛋白中的线性正向单链(ss)RNA分子。这些RNA基于其编码产物命名为RNA-Rep：6043nt，RNA-CP：3134nt和RNA-TGB：2964nt。RNA-Rep与病毒复制有关，并编码RNA依赖性RNA聚合酶的成分；RNA-CP编码衣壳蛋白和通读蛋白，RNA-TGB编码运动蛋白和推定的富含半胱氨酸的微型8kDa蛋白的三基因块(TGB)。

与其他大部分病毒群体不同的是，PMTV在植株体内的移动并不依赖于外壳蛋白的表达或病毒颗粒的形成，其中RNA-TGB编码3个可能参与病毒细胞间运动类似蛋白质,与RNA长距离运输有关，这些裸露的RNA虽然没有外壳蛋白组装成病毒颗粒，但具有侵染能力。

由于PMTV诱导的症状表现差异大，亦受温度等环境因素的影响，植株症状及块茎症状易与其他病毒诱导的症状混淆，因此，有必要建立有效的检测方法。检测的方法有ELISA、RT-PCR、指示植物法和电镜观察法等，其中以RT-PCR与ELISA为为主。

ELISA检测PMTV的方法操作简单，灵敏性相对较高，适合大批量的样品检测。但对于PMTV这种植株中含量很低的病毒来说，其灵敏度和准确性不及RT-PCR，且无法检测裸露的病毒RNA。RT-PCR是最常用的RNA病毒检测方法之一。对于PMTV的检测，常在编码CP蛋白的区域和TGB区域设计RT-PCR特异引物。与ELISA相比，RT-PCR方法过程较复杂，花费较大，但是对于植株中含量很低的病毒来说，其灵敏度和准确性更高，可是也有检测结果呈假阳性和假阴性的情况。

发明内容

为解决现有ELISA检测方法和RT-PCR检测方法无法准确快速检测PMTV的问题，本发明提供了用于马铃薯帚顶病毒PCR检测的引物探针组、试剂盒及检测方法。

本发明的技术方案：

一种用于马铃薯帚顶病毒PCR检测的引物探针组，包括针对PMTV基因组中RNA-CPRNA链保守区的RT-PCR引物探针组-PMTV2和针对RNA-TGB RNA链保守区的RT-PCR引物探针组-PMTV3；

所述RT-PCR引物探针组-PMTV2包括正向引物PMTV2-F、反向引物PMTV2-R、探针PMTV2-P9和探针PMTV2-P8；

所述RT-PCR引物探针组-PMTV3包括正向引物PMTV3-F、反向引物PMTV3-R和探针PMTV3-P5；

所述正向引物PMTV2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述反向引物PMTV2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述探针PMTV2-P9的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述探针PMTV2-P8的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述正向引物PMTV3-F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述反向引物PMTV3-R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

所述探针PMTV2-P5的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；

所述反向引物PMTV2-R和所述反向引物PMTV3-R的5’端均标记地高辛，所述探针PMTV2-P9、所述探针PMTV2-P8和所述探针PMTV2-P5的5’端均标记氨基。

一种用于马铃薯帚顶病毒PCR检测的试剂盒，包括权利要求1所述的正向引物PMTV2-F、反向引物PMTV2-R、正向引物PMTV3-F和反向引物PMTV3-R，还包括连接有权利要求1所述的探针PMTV2-P9、探针PMTV2-P8和探针PMTV3-P5的芯片。

进一步的，所述芯片以96孔板为基片，分为PMTV2探针组和PMTV3探针组，所述PMTV2探针组连接有权利要求1所述的探针PMTV2-P9和探针PMTV2-P8，所述PMTV3探针组连接有权利要求1所述的探针PMTV3-P5。

进一步的，所述芯片的制备方法为利用基因芯片点样液将所述探针PMTV2-P9、探针PMTV2-P8和探针PMTV3-P5分别稀释至浓度为50μM，将探针PMTV2-P9稀释液、探针PMTV2-P8稀释液和探针PMTV3-P5稀释液分别点样0.1μl到硅烷化的96孔板基片上，37℃温育12h得到芯片。

进一步的，还包括PCR Buffer、dNTP Mixture、Taq酶、ddH

一种用于马铃薯帚顶病毒PCR检测的检测方法，包括如下步骤：

步骤一、以待测样品RNA反转录的cDNA为模板，采用如权利要求1所述的正向引物PMTV2-F、反向引物PMTV2-R、正向引物PMTV3-F和反向引物PMTV3-R进行双重PCR反应；

步骤二、将步骤一所得PCR反应产物分别与连接有权利要求1所述的探针PMTV2-P9、探针PMTV2-P8和探针PMTV3-P5的芯片进行杂交反应，并进行显色，若芯片相应位置出现蓝紫色则判定为阳性。

进一步的，步骤一所述双重PCR反应的扩增体系为：检测样品cDNA 1.0μl，浓度均为10uM的正向引物PMTV2-F和反向引物PMTV2-R各0.5μl，浓度均为10uM的正向引物PMTV3-F和反向引物PMTV3-R各0.5μl，10×PCR Buffer 2.5μl，浓度为2.5mM的dNTP Mixture 2.0μl，浓度为5U/μl的Taq酶0.3μl和ddH

进一步的，步骤一所述双重PCR反应的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，72℃终延伸7min，4℃保温。

进一步的，所述芯片的制备方法为利用基因芯片点样液将所述探针PMTV2-P9、探针PMTV2-P8和探针PMTV3-P5分别稀释至浓度为50μM，将探针PMTV2-P9稀释液、探针PMTV2-P8稀释液和探针PMTV3-P5稀释液分别点样0.1μl到硅烷化的96孔板基片上，37℃温育12h得到芯片。

进一步的，所述杂交反应的操作步骤如下：在芯片每个检测孔中加入40μl杂交液，55℃预热5min，同时取步骤一所得PCR产物95-99℃孵育10min得到的变性后的PCR产物，取10μl变性后的PCR产物加入杂交液中，55℃杂交1.5h，清洗液清洗2次，加入40μl含抗地高辛AP酶的阻断液，所述含抗地高辛AP酶的阻断液中含1:1000的抗地高辛AP酶，37℃孵育30min，清洗液清洗2次，加入40μl显色液37℃孵育30min显色。

本发明的有益效果：

本发明针对PMTV基因组中RNA-CP与RNA-TGB两条RNA链保守区分别设计RT-PCR引物与杂交探针，能够同时检测RNA-CP与RNA-TGB两条链，避免了ELISA无法检测裸露的病毒RNA的缺点，且由于增加一步杂交，减少了RT-PCR方法的假阳性与假阴性情况。

本发明提供的用于马铃薯帚顶病毒PCR检测的检测试剂盒和检测方法将探针固定在96孔板做成的基片上，用样品核酸的PCR产物与探针进行杂交，能同时检测多个片段。本发明检测方法中目的片段被扩增至2

附图说明

图1为实施例4利用本发明提供的用于马铃薯帚顶病毒PCR检测试剂盒及检测方法检测马铃薯是否感染PMTV的显色结果照片，图中1-10号为阳性样品，11-12号为阴性样品。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例提供了一种用于马铃薯帚顶病毒PCR检测的引物探针组，包括针对PMTV基因组中RNA-CP RNA链保守区的RT-PCR引物探针组-PMTV2和针对RNA-TGB RNA链保守区的RT-PCR引物探针组-PMTV3。

RT-PCR引物探针组-PMTV2包括正向引物PMTV2-F、反向引物PMTV2-R、探针PMTV2-P9和探针PMTV2-P8；其中正向引物PMTV2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向引物PMTV2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；探针PMTV2-P9的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；探针PMTV2-P8的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

以PMTV的RNA反转录的cDNA为模板，采用正向引物PMTV2-F和反向引物PMTV2-R进行PCR扩增所得产物196bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

RT-PCR引物探针组-PMTV3包括正向引物PMTV3-F、反向引物PMTV3-R和探针PMTV3-P5；其中正向引物PMTV3-F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；反向引物PMTV3-R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；探针PMTV2-P5的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

以PMTV的RNA反转录的cDNA为模板，采用正向引物PMTV3-F和反向引物PMTV3-R进行PCR扩增所得产物137bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

反向引物PMTV2-R和反向引物PMTV3-R的5’端均标记地高辛，探针PMTV2-P9、探针PMTV2-P8和探针PMTV2-P5的5’端均标记氨基。

本实施例由生工生物工程有限公司负责合成本实施例中的引物、探针并进行标记。

实施例2

本实施例提供了一种含有实施例1引物探针组的检测试剂盒，具体包括正向引物PMTV2-F、反向引物PMTV2-R、正向引物PMTV3-F和反向引物PMTV3-R，还包括连接有探针PMTV2-P9、探针PMTV2-P8和探针PMTV3-P5的芯片，还包括PCR Buffer、dNTP Mixture、Taq酶、ddH

本实施例中连接有探针的芯片以96孔板为基片，分为PMTV2探针组和PMTV3探针组，PMTV2探针组连接有探针PMTV2-P9和探针PMTV2-P8，PMTV3探针组连接有探针PMTV3-P5。

探针连接到芯片的具体制备方法为利用基因芯片点样液将所述探针PMTV2-P9、探针PMTV2-P8和探针PMTV3-P5分别稀释至浓度为50μM，将探针PMTV2-P9稀释液、探针PMTV2-P8稀释液和探针PMTV3-P5稀释液分别点样0.1μl到硅烷化的96孔板基片同一孔的不同位置上，37℃温育12h得到芯片。

本实施例中基因芯片点样液购自北京博奥晶典生物技术有限公司，杂交液(货号Hyb-100)、含抗地高辛AP酶的阻断液和显色液均购自北京美莱博医学科技有限公司，清洗液为0.1％的SDS水溶液。10×PCR Buffer、dNTP Mixture、Taq酶和ddH

实施例3

本实施例提供了一种利用实施例2用于马铃薯帚顶病毒PCR检测试剂盒进行PMTV检测的具体检测方法，具体包括如下步骤：

步骤一、以待测样品RNA反转录的cDNA为模板，采用正向引物PMTV2-F、反向引物PMTV2-R、正向引物PMTV3-F和反向引物PMTV3-R进行双重PCR反应；

双重PCR反应的扩增体系为：检测样品cDNA 1.0μl，浓度均为10uM的正向引物PMTV2-F和反向引物PMTV2-R各0.5μl，浓度均为10uM的正向引物PMTV3-F和反向引物PMTV3-R各0.5μl，10×PCR Buffer 2.5μl，浓度为2.5mM的dNTP Mixture 2.0μl，浓度为5U/μl的Taq酶0.3μl和ddH

双重PCR反应的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，72℃终延伸7min，4℃保温。

步骤二、将步骤一所得PCR反应产物分别与连接有探针PMTV2-P9、探针PMTV2-P8和探针PMTV3-P5的芯片进行杂交反应，在芯片每个检测孔中加入40μl杂交液，55℃预热5min，同时取步骤一所得PCR产物95-99℃孵育10min得到的变性后的PCR产物，取10μl变性后的PCR产物加入杂交液中，55℃杂交1.5h，清洗液清洗2次，加入40μl含抗地高辛AP酶的阻断液，所述含抗地高辛AP酶的阻断液中含1:1000的抗地高辛AP酶，37℃孵育30min，清洗液清洗2次，加入40μl显色液37℃孵育30min显色。

若芯片相应位置出现蓝紫色则判定为阳性，若芯片相应位置未出现蓝紫色则判定为阴性。

本实施例中PCR扩增体系中所用10×PCR Buffer、dNTP Mixture、Taq酶和ddH

本发明将探针固定在96孔板做成的基片上，用样品核酸的PCR产物与探针进行杂交，能同时检测多个片段。本发明的检测样品为经过PCR扩增之后的产物，目的片段被扩增至2

本发明针对PMTV基因组中RNA-CP与RNA-TGB两条RNA链保守区分别设计RT-PCR引物与杂交探针，能够同时检测RNA-CP与RNA-TGB两条链，避免了ELISA无法检测裸露的病毒RNA的缺点，且由于增加一步杂交，减少了RT-PCR方法的假阳性与假阴性情况。

基于此，本发明提供的用于马铃薯帚顶病毒PCR检测的引物探针组、试剂盒及检测方法能够更高效准确的检测出PMTV。

实施例4

本实施例利用实施例2的检测试剂盒与实施例3的检测方法对10个染病马铃薯样品是否感染PMTV进行了检测，同时对照进行了两个正常马铃薯样品的检测。

采用常规技术手段获得10个染病马铃薯样品染病部位和2个未染病马铃薯样品的总RNA，并反转录为cDNA。

利用实施例2的检测试剂盒按实施例3提供的检测方法进行检测，具体步骤如下：

步骤一、以待测样品RNA反转录的cDNA为模板，采用正向引物PMTV2-F、反向引物PMTV2-R、正向引物PMTV3-F和反向引物PMTV3-R进行双重PCR反应；

双重PCR反应的扩增体系为：检测样品cDNA1.0μl，浓度均为10uM的正向引物PMTV2-F和反向引物PMTV2-R各0.5μl，浓度均为10uM的正向引物PMTV3-F和反向引物PMTV3-R各0.5μl，10×PCR Buffer 2.5μl，浓度为2.5mM的dNTP Mixture 2.0μl，浓度为5U/μl的Taq酶0.3μl和ddH

双重PCR反应的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，72℃终延伸7min，4℃保温。

步骤二、将步骤一所得PCR反应产物分别与连接有探针PMTV2-P9、探针PMTV2-P8和探针PMTV3-P5的芯片进行杂交反应，在芯片每个检测孔中加入40μl杂交液，55℃预热5min，同时取步骤一所得PCR产物95-99℃孵育10min得到的变性后的PCR产物，取10μl变性后的PCR产物加入杂交液中，55℃杂交1.5h，清洗液清洗2次，加入40μl含抗地高辛AP酶的阻断液，37℃孵育30min，清洗液清洗2次，加入40μl显色液37℃孵育30min显色。

图1为本实施例检测的显色结果照片，图中1-5号在PMTV2-P8、PMTV2-P9对应的位置均出现蓝紫色颜色结果，说明1-5号检测孔对应的马铃薯样品为阳性样品，感染了PMTV。

6-10号在PMTV2-P5对应的位置出现蓝紫色颜色结果，说明6-10号检测孔对应的马铃薯样品为阳性样品，感染了PMTV。

11-12号在PMTV2-P8、PMTV2-P9和PMTV2-P5对应的位置均未出现蓝紫色颜色结果，说明11、12号检测孔对应的马铃薯样品为阴性样品，并未感染了PMTV。

本发明针对PMTV基因组中RNA-CP与RNA-TGB两条RNA链保守区分别设计RT-PCR引物与杂交探针，将探针固定在96孔板做成的基片上，用样品核酸的PCR产物与探针进行杂交，能够同时检测RNA-CP与RNA-TGB两条链，避免了ELISA无法检测裸露的病毒RNA的缺点，且由于增加一步杂交，减少了RT-PCR方法的假阳性与假阴性情况。