一种应用于冰冻切片的固定液及其制备方法和基于其制备冷冻切片的方法

技术领域

本发明属于冷冻切片固定液制备技术领域，具体涉及一种应用于冰冻切片的固定液及其制备方法和基于其制备冷冻切片的方法。

背景技术

冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的技术，该方法是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。冰冻切片的优点是能够较完好的保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原(膜抗原)，采用冰冻切片得到的染色结果会更好。

切片的固定环节是影响冰冻切片质量的因素之一，现有的用于冰冻切片的固定试剂，主要有以下几大类：丙酮、甲醛、乙醇和乙酸。在这几类固定液中，丙酮能使蛋白质沉淀，渗透力强，但对核的固定欠佳，且使组织收缩剧烈；甲醛穿透力强，固定均匀，能增加组织的韧性；乙醇能迅速沉淀球蛋白和核蛋白，但可引起组织的轻微收缩；乙酸有使组织膨胀的作用(陈敬文，张伟，崔华娟，几种冰冻切片固定液固定效果的比较[J],中国组织化学与细胞化学杂志，2012,19,(6):617-618)。

上述几种常用的固定试剂存在的缺陷和不足如下：

(1)现有的固定液均为有机试剂，对操作者及环境带来一定程度的危害；

(2)不同固定液的使用可能会使组织中被“封闭”的阳性信号检出或使细胞结构更加清晰，但仍有部分阳性信号不能被检出或可以被检出但信号很弱，影响操作人员对结果的判断。

因此，开发新的固定液以获得更加环保、灵敏度更高及背景更清楚的染色结果显得尤为重要。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种应用于冰冻切片的固定液及其制备方法和基于其制备冷冻切片的方法，能够有效解决现有技术的固定试剂环保性差、灵敏度低且显色背景不清楚的缺陷性问题。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种应用于冰冻切片的固定液，该固定液是由中药粉末配制而成的溶液；或者，

该固定液是由中药粉末与聚乙烯醇配制而成的混合液；

其中，所述中药粉末为黄芪粉末、茯苓粉末或党参粉末。

优选地，当该固定液为中药粉末直接配制而成的溶液时：是采用PBS将中药粉末配制成中药粉末终浓度为10μg/ml～1g/ml的固定液。

优选地，当该固定液是由中药粉末与聚乙烯醇配制而成的混合液时：混合液中，中药粉末的终浓度为5μg/mL～500μg/mL，聚乙烯醇的终浓度为0.125mol/L～0.5mol/L。。

优选地，该固定液的使用温度为37～60℃。

优选地，其特征在于，该固定液的固定时间为30～60min。。

本发明还公开了上述的应用于冰冻切片的固定液的制备方法，当该固定液为中药粉末直接配制而成的溶液时，制备方法如下：将中药粉末采用PBS配制成浓度为10μg/mL～1g/m L的溶液；

当该固定液是由中药粉末与聚乙烯醇配制而成的混合液时，制备方法如下：

先将中药粉末采用PBS配制成浓度为10μg/mL～1g/m L的溶液A，然后将聚乙烯醇配制成浓度为0.25mol/L～1mol/L的溶液B，将溶液A和溶液B按照1:1的体积比混合，使最终固定液中中药粉末的终浓度为5μg/mL～500μg/mL，聚乙烯醇的终浓度为0.125mol/L～0.5mol/L。

本发明还公开了采用上述的应用于冰冻切片的固定液制备冷冻切片的方法，包括以下步骤：

1)将组织切块进行包埋处理，然后进行冷冻切片；

2)采用上述的应用于冰冻切片的固定液对冷冻切片处理后的组织进行固定，获得组织冷冻切片。

优选地，步骤1)中，冷冻切片的处理温度为-15～-20℃，切片厚度为5μm～30μm。

优选地，步骤2)中，固定是在37℃～60℃下处理30min～60min。

优选地，处理的组织切块包括脑组织、心脏组织、肾脏组织、肝脏组织、肺组织、肠组织及神经组织。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开的应用于冰冻切片的固定液，首次将中药黄芪、茯苓和党参用于组织的固定，形成的固定液只需要采用聚乙烯醇溶液将中药粉末配制即可获得固定剂，完全规避了有毒、有害试剂的使用，从而减少对实验人员以及环境所带来的危害。与此同时，本发明的固定液与现有技术的固定液相比，能够得到同等的信号或高于既往固定液的信号，在一定程度上提高了待检样本的灵敏度，为临床的诊断和治疗，提供了更明确的指导意义。

附图说明

图1为20μg/mL黄芪溶液固定组织后染色；

图2为20μg/mL茯苓溶液固定组织后染色；

图3为20μg/mL党参溶液固定组织后染色；

图4为0.25mol/L聚乙烯醇溶液固定组织后染色；

图5为20μg/mL黄芪和0.25mol/L聚乙烯醇混合溶液固定组织后染色；

图6为20μg/mL茯苓和0.25mol/L聚乙烯醇混合溶液固定组织后染色；

图7为20μg/mL党参和0.25mol/L聚乙烯醇混合溶液固定组织后染色；

图8为未固定组织直接染色；

图9为丙酮固定组织后染色；

图10为4％多聚甲醛固定组织后染色；

图11为乙醇固定组织后染色(乙醇和甲醇固定组织后假阳性率较高，故此图不能反映真实的阳性信号)；

图12为各种固定液的检出率统计图(去掉对比例4后的结果进行统计)。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明的制备冷冻切片的方法，包括以下步骤：

步骤1组织的获取

使用PBS对动物进行灌注，然后取组织，将组织切块；

所述的动物包括鼠、兔子、羊、猴或牛等常用的实验动物；

所述的组织包括脑组织、心脏、肾脏、肝脏、肺、坐骨神经、视神经、肠及实验所需组织；

所述的组织块的大小为0.4cm

步骤2包埋

所述的包埋是将步骤1获得的组织块放置在含有足够量的OCT包埋化合物的包埋盒中，使其完全覆盖组织，放入冷冻切片机的冷冻台，待组织完全冷冻后进行切片；

所述的包埋还可以是将组织块放置在含有足够量的OCT包埋化合物的包埋盒中，用锡箔纸叠一个略微大于包埋盒的小船，然后将包埋盒放进小船中，置液氮中冷冻3min～5min，至组织中间略有透明时即可；

步骤3切片

使用冷冻切片机将包埋好的组织块切片，并使组织薄片粘贴在粘附载玻片上；

所述的冷冻切片机的温度为-15～-20℃；

所述的组织切片厚度为5μm～30μm；

步骤4组织片子的固定

使用固定液对步骤3所得的组织片子进行固定；

所述的固定液是采用中药黄芪、茯苓、党参制成的固定液，还可以是黄芪与聚乙烯醇的混合液、茯苓与聚乙烯醇的混合液或者党参与聚乙烯醇的混合液；

所述的固定液为黄芪时，使用PBS将黄芪配制成浓度为10μg/mL～1g/mL的固定液；

所述的固定液为茯苓时，使用PBS将茯苓配制成浓度为10μg/mL～1g/mL的固定液；

所述的固定液为党参时，使用PBS将党参配制成浓度为10μg/mL～1g/mL的固定液；

所述的固定液为黄芪和聚乙烯醇混合液时，先用PBS将黄芪配制成浓度为10μg/mL～1g/mL溶液，聚乙烯醇配制成浓度为0.25mol/L～1mol/L的溶液，然后将配制好的黄芪溶液与聚乙烯醇溶液按照1:1体积比混合，使得黄芪的终浓度为5μg/mL～500μg/mL，聚乙烯醇的终浓度为0.125mol/L～0.5mol/L；

所述的固定液为茯苓和聚乙烯醇混合液时，先用PBS将茯苓配制成浓度为10ug/mL～1g/mL溶液，聚乙烯醇配制成浓度为0.25mol/L～1mol/L的溶液，然后将配制好的茯苓溶液与聚乙烯醇溶液按照1:1体积比混合，使得茯苓的终浓度为5μg/mL～500μg/mL，聚乙烯醇的终浓度为0.125mol/L～0.5mol/L；

所述的固定剂为党参和聚乙烯醇混合液时，先用PBS将党参配制成浓度为10μg/mL～1g/mL溶液，聚乙烯醇配制成浓度为0.25mol/L～1mol/L的溶液，然后将配制好的党参溶液与聚乙烯醇溶液按照1:1体积比混合，使得黄芪的终浓度为5μg/mL～500μg/mL，聚乙烯醇的终浓度为0.125mol/L～0.5mol/L；

所述固定液的使用温度为37℃～60℃；

所述固定液的固定时间为30min～60min；

步骤5免疫荧光染色观察结果。

实施例1

步骤1组织的获取

选成年大鼠，麻醉，待老鼠四肢硬化，打开腹腔，暴露出心尖，从左心尖灌注PBS，以便全身循环，分别取新鲜的鼠脑组织、肝脏、脾脏、肠组织放入含有PBS的培养皿中，将组织切成0.5cm

步骤2包埋

将足够量的OCT包埋化合物涂在鼠脑组织块上，使其完全覆盖组织，放入-20℃冷冻切片机的冷冻台，待组织略微发白时用OCT在标本表面涂一薄层，继续冷冻20min，切片；

步骤3切片

使用冷冻切片机将包埋好的鼠脑组织块切成厚度为5um～30um的薄片，当切好的组织薄片从冷冻块上脱落时，放置一个粘附载玻片，使组织薄片粘贴在载玻片上；

步骤4组织片的固定与染色

使用上述制得的鼠脑组织片，一抗采用副肿瘤综合征患者的血清，该血清中含有抗Hu的抗体；具体步骤：

1、将组织片子使用20μg/mL黄芪固定液固定30min；

2、一抗孵育：按照1:10的比例加入待检样本，室温孵育1h；

3、洗涤：PBST洗3次，每次5min；

4、二抗孵育：加入FITC标记的二抗，室温孵育1h；

5、洗涤：PBST洗3次，每次5min；

6、显微镜下观察结果，拍照。

实验结果如图1所示，从图1中可以看出，经黄芪固定液固定的组织片子上可以清晰的看出点状阳性信号，该信号比对照组丙酮(图9所示)固定的组织片子上的信号略强，比对照组未固定(图8所示)、对照组多聚甲醛(图10所示)固定、对照组乙醇(图11所示)固定的信号强。

实施例2

与实施例1不同的是，组织片的固定液采用20μg/mL茯苓固定液固定30min。实验结果如图2所示，从图2中可以看出经茯苓溶液固定的组织片子上可以清晰的看出点状阳性信号，该信号强度与对照组丙酮(图9所示)固定的结果相近，比对照组未固定(图8所示)、对照组多聚甲醛(图10所示)固定、对照组乙醇(图11所示)固定的信号强。

实施例3

与实施例1不同的是，组织片的固定液采用浓度为20μg/mL党参固定液固定30min。实验结果如图3所示，从图3中可以看出经党参溶液固定的组织片子上可以清晰的看出点状阳性信号，该信号强度与对照组丙酮(图9所示)固定的结果相近，比对照组未固定(图8所示)、对照组多聚甲醛(图10所示)固定、对照组乙醇(图11所示)固定的信号强。

实施例4

与实施例1不同的是，组织片的固定采用浓度为0.25mol/L的聚乙烯醇溶液固定30min，实验结果如图4所示，从图4中可以看出经聚乙烯醇溶液固定的组织片子上可以清晰的看出点状阳性信号，该信号强度与对照组丙酮(图9所示)固定的结果相近，比对照组未固定(图8所示)、对照组多聚甲醛(图10所示)固定、对照组乙醇(图11所示)固定的信号强，但是多次的实验结果显示，聚乙烯醇溶液在应用于冰冻切片的固定时，表现出了不稳定的现象，新鲜配制的固定液其固定效果优于放置一段时间后的固定液，固定液的保质期较短。

实施例5

与实施例1不同的是，组织片的固定采用浓度为20μg/mL黄芪和浓度为0.25mol/L的聚乙烯醇溶液按照1:1的体积比配制成的混合液(混合液中黄芪的终浓度为10μg/mL，聚乙烯醇的终浓度为0.125mol/L)固定30min，实验结果如图5所示，从图5中可以看出经黄芪和聚乙烯醇的混合溶液固定的组织片子上可以清晰的看出点状阳性信号，该信号强度与对照组丙酮(图9所示)固定的结果相近，比对照组未固定(图8所示)、对照组多聚甲醛(图10所示)固定、对照组乙醇(图11所示)固定的信号强。通过与单独的聚乙烯醇溶液相比，黄芪和聚乙烯醇的混合液在固定冰冻切片时，表现出了较好的稳定性，该固定液的保质期比单独的聚乙烯醇溶液长。

实施例6

与实施例1不同的是，组织片的固定采用浓度为20μg/mL茯苓和浓度为0.25mol/L的聚乙烯醇溶液按照1:1的体积比配制成的混合液(混合液中茯苓的终浓度为10μg/mL，聚乙烯醇的终浓度为0.125mol/L)固定30min，实验结果如图6所示，从图6中可以看出经茯苓和聚乙烯醇的混合溶液固定的组织片子上可以清晰的看出点状阳性信号，该信号强度与对照组丙酮(图9所示)固定的结果相近，比对照组未固定(图8所示)、对照组多聚甲醛(图10所示)固定、对照组乙醇(图11所示)固定的信号强。通过与单独的聚乙烯醇溶液相比，茯苓和聚乙烯醇的混合液在固定冰冻切片时，表现出了较好的稳定性，该固定液的保质期比单独的聚乙烯醇溶液长。

实施例7

与实施例1不同的是，组织片的固定采用浓度为20μg/mL党参和浓度为0.25mol/L的聚乙烯醇溶液按照1:1的体积比配制成的混合液(混合液中党参的终浓度为10μg/mL，聚乙烯醇的终浓度为0.125mol/L)固定30min，实验结果如图7所示，从图7中可以看出经党参和聚乙烯醇的混合溶液固定的组织片子上可以清晰的看出点状阳性信号，该信号强度与对照组丙酮(图9所示)固定的结果相近，比对照组未固定(图8所示)、对照组多聚甲醛(图10所示)固定、对照组乙醇(图11所示)固定的信号强。通过与单独的聚乙烯醇溶液相比，党参和聚乙烯醇的混合液在固定冰冻切片时，表现出了较好的稳定性，该固定液的保质期比单独的聚乙烯醇溶液长。

对比例1

与实施例1不同的是，组织片不经过固定直接染色，实验结果如图8所示，从图8中可以看出，未固定的组织片子信号较弱。

对比例2

与实施例1不同的是，组织片的固定采用丙酮，实验结果如图9所示，从图9中可以看出，经丙酮固定后的组织片子，免疫荧光染色后，信号较好，其信号强度与黄芪溶液、茯苓溶液、党参溶液、聚乙烯醇溶液、黄芪和聚乙烯醇的混合液、茯苓和聚乙烯醇的混合液、党参和聚乙烯醇的混合液固定后的组织片信号强度相近。

对比例3

与实施例1不同的是，组织片的固定采用4％多聚甲醛，实验结果如图10所示，从图10中可以看出，多聚甲醛固定后组织片子信号较弱，该信号虽然比未固定的组织片信号略强，但比丙酮固定后的信号弱。

对比例4

与实施例1不同的是，组织片的固定采用乙醇，实验结果如图11所示，从图11中可以看出，乙醇固定后组织片子信号较弱，该信号虽然比未固定的组织片信号略强，但比丙酮固定后的信号弱。

此外，本实验还对不同固定液的阳性信号检出率进行了统计，取使用CBA(cell-basced assay，以细胞为基础的免疫荧光法)法检出的AQP4阳性血清140例，使用实施例1至实施例7及对比例1至对比例3的方法分别固定组织切片，进行阳性血清验证，阳性血清的检出数量分别是85例、75例、73例、84例、83例、83例、80例、15例、83例、66例、53例，检出率分别为60.71％、53.71％、52.14％、60％、59.29％、59.29％、57.14％、10.71％、59.29％、47.14％，如图12所示，由此组数据可以看出，本发明采用的中药黄芪、茯苓和党参固定液不仅具有与常规固定液相近的固定效果，在检出率方面也较为相近。因此，在冰冻切片领域具有良好的应用前景。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。