一种罗非鱼饲料

技术领域

本发明涉及水产饲料技术领域，尤其涉及一种罗非鱼饲料。

背景技术

罗非鱼，俗称非洲鲫鱼，非鲫、越南鱼、南洋鲫等。原指以莫桑比克为模式产地的口孵非鲫属鱼类物种：莫桑比克口孵非鲫(Oreochromis mossambicus)，现为慈鲷科非鲫属及口孵非鲫属等属数种鱼类的共同俗称。现在它是世界水产业的重点科研培养的淡水养殖鱼类，且被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。通常生活于淡水中，也能生活于不同盐份含量的咸水中，也可以存活于湖，河，池塘的浅水中。它有很强的适应能力，在面积狭小之水域中亦能繁殖，甚至在水稻田里能够生长，且对溶氧较少之水有极强之适应性。绝大部分罗非鱼是杂食性，常吃水中植物和碎物。每100克肉中含蛋白质约20.5g，脂肪约6.93g，热量约148千卡，钙约70mg，钠约50mg，磷约37mg，铁约1mg，维生素B1约0.1mg，维生素B2约0.12mg，罗非鱼已成为世界性的主要养殖鱼类。罗非鱼的肉味鲜美，肉质细嫩，含有多种不饱和脂肪酸和丰富的蛋白质。

然而，随着集约化养殖面积的扩大和养殖密度的增高，再加上饲料品质不佳、饲料营养不均衡等因素，罗非鱼的病害问题日益严重，会造成罗非鱼免疫能力和抗氧化能力下降。另外，肠道消化不良与营养性脂肪肝病也是困扰罗非鱼养殖的常见问题，其直接导致罗非鱼生长缓慢，成活率降低。

发明内容

有鉴于此，为了解决上述问题，本发明的提供了一种能提高罗非鱼免疫力、减少脂肪肝的罗非鱼饲料。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种罗非鱼饲料，包括孜然提取物和基础饲料，所述孜然提取物占饲料总重量的0.05～0.2％，所述孜然提取物包括孜然多糖或孜然黄酮。

优选的，所述基础饲料包含以下重量百分比的营养成分：粗蛋白35～45％，粗脂肪3～5％，灰分7～9％，碳水化合物30～50％，水分9～11％。

优选的，所述罗非鱼饲料包括以下重量份数的组分：孜然提取物0.05～0.2份，玉米粉45～55份，鱼粉20～23份、次粉10～12份，豆粕16～18份，复合维生素0.1～0.2份，复合矿物质0.1～0.2份，氯化胆碱0.4～0.6份，磷酸二氢钙0.8～1.2份。

优选的，所述孜然多糖提取物的提取方法，包括如下步骤：

S1.取孜然果实或茎杆与碳酸钠溶液混合，浸泡20～25h后于75～85℃超声浸提40～60min，收集滤渣和提取液；

S2.对滤渣重复S1中超声浸提的操作2～3次，收集提取液；

S3.合并提取液，调节pH值至7～8，分别用体积分数为58～62％、68～72％、88～92％的乙醇进行分级醇沉，收集沉淀，为孜然多糖提取物。

优选的，所述孜然果实或茎杆与碳酸钠溶液的重量比为1:4～6。

优选的，所述超声的功率为200～300W，所述超声的频率20～40kHZ，超声浸提的时间为40～60min。

优选的，所述提取液与乙醇溶液1的体积比为1:3～6；所述溶液1与乙醇溶液2的体积比为1:3～6；所述溶液2与乙醇溶液3的体积比为1:3～6。

优选的，所述孜然黄酮提取物的提取方法，包括如下步骤：将所述醇沉后的溶液进行旋转蒸发浓缩，得到孜然黄酮提取物，旋转蒸发浓缩后的溶液体积与孜然果实或茎杆的重量比为50～60mL:100g。

优选的，所述旋转蒸发浓缩的转速为60～120rpm，所述旋转蒸发浓缩的温度为75～85℃，所述旋转蒸发浓缩的真空度为0.03～0.05MPa。

优选的，当所述孜然提取物包括孜然多糖和孜然黄酮时，孜然多糖和孜然黄酮的质量比为1:0.5～2。

通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明通过在孜然果实或茎杆中提取孜然多糖和孜然黄酮，并在罗非鱼饲料中添加提取孜然多糖或孜然黄酮提取物，制备出了含孜然多糖或孜然黄酮0.05～0.2份，玉米粉45～55份，鱼粉20～23份、次粉10～12份，豆粕16～18份，复合维生素0.1～0.2份，复合矿物质0.1～0.2份，氯化胆碱0.4～0.6份，磷酸二氢钙0.8～1.2份的罗非鱼饲料。该饲料能够提升罗非鱼的生长性能、提高罗非鱼的消化能力、减少肝脏脂质沉积并提升罗非鱼的免疫力和抗氧化性能。

附图说明

图1为不同组别罗非鱼肝脏组织形态图；其中A，CK，空白对照组；B，FR，添加1％孜然果实；C，WA，添加10％孜然提取后废弃物；D，PO，添加0.2％孜然多糖提取物；E，FL，添加0.2％孜然黄酮提取物；F，AE，添加0.2％孜然醇提物；G，OI，添加0.2％孜然精油。黑色箭头表示脂质沉积。比例尺＝100μm；放大倍数×200。

图2为不同组别罗非鱼肝脏抗氧化性能图；数值以“平均值±标准误”表示(n＝3)，柱状图上不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)。

图3为不同组别罗非鱼肠道形态变化，柱状图上不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)。

图4为不同组别罗非鱼血清参数，其中：数值以“平均值±标准误”表示(n＝3)，柱状图上不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)。ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；TG，甘油三酯；CHO，总胆固醇；HDL，高密度脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白。CK，空白对照组；FR，添加1％孜然果实；WA，添加10％孜然提取后废弃物；PO，添加0.2％孜然多糖提取物；FL，添加0.2％孜然黄酮提取物；AE，添加0.2％孜然醇提物；OI，添加0.2％孜然精油。

图5为饲料中添加孜然多糖或黄酮提取物对罗非鱼肝脏形态的影响；其中：A，CK，空白对照组；B，PO-L，添加0.05％孜然多糖提取物；C，PO-M，添加0.1％孜然多糖提取物；D，PO-H，添加0.2％孜然多糖提取物；E，FL-L，添加0.05％孜然黄酮提取物；F，FL-M，添加0.1％孜然黄酮提取物；G，FL-H，添加0.2％孜然黄酮提取物。黑色箭头表示脂质沉积。比例尺＝200μm；放大倍数×100。

图6为饲料中添加孜然多糖或黄酮提取物对罗非鱼肠道形态的影响；其中：柱状图上不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)。A，CK，空白对照组；B，PO-L，添加0.05％孜然多糖提取物；C，PO-M，添加0.1％孜然多糖提取物；D，PO-H，添加0.2％孜然多糖提取物；E，FL-L，添加0.05％孜然黄酮提取物；F，FL-M，添加0.1％孜然黄酮提取物；G，FL-H，添加0.2％孜然黄酮提取物；H，绒毛长度(μm)。比例尺＝200μm；放大倍数×100。

图7为饲料中添加孜然多糖或黄酮提取物对罗非鱼抗氧化性能的影响；其中：数值以“平均值±标准误”表示(n＝3)，柱状图上不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)。SOD，超氧化物歧化酶；MDA，丙二醛；GSH-PX，谷胱甘肽过氧化物酶；T-AOC，总抗氧化能力。CK，空白对照组；PO-L，添加0.05％孜然多糖提取物；PO-M，添加0.1％孜然多糖提取物；PO-H，添加0.2％孜然多糖提取物；FL-L，添加0.05％孜然黄酮提取物；FL-M，添加0.1％孜然黄酮提取物；FL-H，添加0.2％孜然黄酮提取物。

图8为饲料中添加孜然多糖或黄酮提取物对罗非鱼血清参数的影响；其中：数值以“平均值±标准误”表示(n＝3)，柱状图上不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)。ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；TG，甘油三酯；CHO，总胆固醇；HDL，高密度脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白。CK，空白对照组；PO-L，添加0.05％孜然多糖提取物；PO-M，添加0.1％孜然多糖提取物；PO-H，添加0.2％孜然多糖提取物；FL-L，添加0.05％孜然黄酮提取物；FL-M，添加0.1％孜然黄酮提取物；FL-H，添加0.2％孜然黄酮提取物。

图9为本实验用孜然果实及茎秆。

具体实施方式

本发明提供了一种罗非鱼饲料，包括孜然提取物和基础饲料，所述孜然提取物占饲料总重量的0.05～0.2％，进一步优选为0.1～0.15％，更优选为0.13％。

本发明所述基础饲料包括以下重量份数的组分：粗蛋白35～45％，粗脂肪3～5％，灰分7～9％，碳水化合物30～50％，水分9～11％。

在所述基础饲料中，所述粗蛋白的重量百分比为35～45％，进一步优选为37～42％，更优选为40％；

所述粗脂肪的重量百分比为3～5％，进一步优选为3.5～4.5％，更优选为4％；

所述灰分的重量百分比为7～9％，进一步优选为7.5～8.5％，更优选为8％；

所述碳水化合物的重量百分比为30～50％，进一步优选为35～45％，更优选为40％；

所述水分的重量百分比为9～11％，进一步优选为9.5～10.5％，更优选为10％。

本发明所述罗非鱼饲料包括以下重量份数的组分：孜然多糖或孜然黄酮0.05～0.2份，玉米粉45～55份，鱼粉20～23份、次粉10～12份，豆粕16～18份，复合维生素1～2份，复合矿物质1～2份，氯化胆碱0.4～0.6份，磷酸二氢钙0.8～1.2份。

在所述罗非鱼饲料中，所述孜然多糖或孜然黄酮的重量份数为0.05～0.2份，进一步优选为0.1～0.15份，更优选为0.13份；

所述玉米粉的重量份数为45～55份，进一步优选为48～53份，更优选为50份；

所述鱼粉的重量份数优选为20～23份，进一步优选为21～22份，更优选为21.5份；

所述次粉的重量份数优选为10～12份，进一步优选为10.5～11.5份，更优选为11份；

所述豆粕的重量份数优选为16～18份，进一步优选为16.5～17.5份，更优选为17份；

所述复合维生素的重量份数优选为0.1～0.2份，进一步优选为0.13～0.17份；更优选为0.15份；

所述复合矿物质的重量份数优选为0.1～0.2份，进一步优选为0.13～0.17份；更优选为0.15份；

所述氯化胆碱的重量份数为0.4～0.6份，进一步优选为0.5份；

所述磷酸二氢钙的重量份数为0.8～1.2份，进一步优选为0.9～1.1份，更优选为1份。

在本发明中，所述孜然提取物包括孜然多糖或孜然黄酮中的一种或两种混合，所述孜然多糖和孜然黄酮的质量比为1:0.5～2，优选为1:0.8～1.7，更优选为1:1。

本发明所述孜然多糖提取物的提取方法，包括如下步骤：

S1.取孜然果实与碳酸钠溶液混合，浸泡20～25h后于75～85℃超声浸提40～60min，收集滤渣和提取液；

S2.对滤渣重复S1中超声浸提的操作2～3次，收集提取液；

S3.合并提取液，调节pH值至7～8，将提取液与体积分数为58～62％的乙醇混合，得沉淀1和溶液1；将溶液1与体积分数为68～72％的乙醇混合，得沉淀2和溶液2；将溶液2与体积分数为88～92％的乙醇混合，得沉淀3和溶液3；收集沉淀1、沉淀2和沉淀3，获得孜然多糖提取物。

本发明将孜然果实洗净、晾干后，与碳酸钠溶液混合，浸泡，超声浸提，收集滤渣和提取液。孜然果实与碳酸钠溶液的重量比为1:4～6，进一步优选为1:4.5～5.5，更优选为1:5；所述碳酸钠溶液的pH值为8.5～9.5，更优选为9；使用碳酸钠溶液提取是因为黄酮化合物易溶于碱性溶液，同时稀碱对多糖提取影响不大，较好的保留了孜然果实中多糖和类黄酮成分的生理和药理活性，同时稀碱可中和在提取过程中释放的不利于多糖提取的酸性物质，相对于用有机溶剂浸提减少了脂溶性杂质。

所述浸泡的时间为20～25h，进一步优选为21～24h，更优选为22h；所述超声浸提的温度为75～85℃，进一步优选为78～82℃，更优选为80℃；所述超声的功率为200～300W，进一步优选为220～280W，更优选为250W；所述超声的频率为20～40kHZ，进一步优选为25～35kHZ，更优选为30kHZ；超声浸提的时间为40～60min，进一步优选为45～55min，更优选为50min，本发明设定的超声功率、频率、时间更有利于孜然有效成分的溶出。

本发明对孜然果实浸提后，收集滤渣和提取液，对滤渣重复上述超声浸提的操作2～3次，再次收集提取液。合并提取液，将所述提取液旋转蒸发浓缩至400～500mL，得孜然提取液浓缩液，盐酸调节pH值至7～8，进一步优选为7.3～7.7，更优选为7.5；将提取液浓缩液与乙醇溶液1混合，得沉淀1和溶液1；将溶液1与乙醇溶液2混合，得沉淀2和溶液2；将溶液2与乙醇溶液3混合，得沉淀3和溶液3，收集沉淀1、沉淀2和沉淀3，获得孜然多糖提取物。上述醇沉过程中，加入乙醇后混合均匀，静置18～24h，进一步优选为20～22h，更优选为21h；离心，分离溶液和沉淀，所述离心的转速为8000～12000rpm，优选为9000～11000rpm，更优选为10000rpm；所述离心的时间为8～12min，进一步优选为9～11min，更优选为10min。

乙醇溶液1的体积分数为58～62％，进一步优选为59～61％，更优选为60％；乙醇溶液2的体积分数为68～72％，进一步优选为69～71％，更优选为70％；乙醇溶液3的体积分数为88～92％，进一步优选为89～91％，更优选为90％。

孜然提取液浓缩液与乙醇溶液1的体积比为1:3～6，进一步优选为1:4～5，更优选为1:4.5；所述溶液1与乙醇溶液2的体积比为1:3～6，进一步优选为1:4～5，更优选为1:4.5；所述溶液3与乙醇溶液3的体积比为1:3～6，进一步优选为1:4～5，更优选为1:4.5。本发明收集沉淀1、沉淀2、沉淀3，洗涤、烘干后得到孜然多糖提取物。将溶液3进行旋转蒸发浓缩，得到孜然黄酮提取物，所述旋转蒸发浓缩的转速为60～120rpm，进一步优选为80～100rpm，更优选为90rpm；所述旋转蒸发浓缩的温度为75～85℃，进一步优选为78～83℃，更优选为80℃；所述旋转蒸发浓缩的真空度为0.03～0.05MPa，更优选为0.04MPa。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明实施例的孜然样品来自新疆吐鲁番地区。

本发明实施例的每克所述复合矿物质包含Mg 310mg、Fe 310mg、Mn60mg、I 10mg、Cu 50mg、Zn 250mg、Se 2mg、Co 8mg。

每克所述维生素包括2400IU维生素D、1100IU维生素A、10.28mg维生素E、0.5mg维生素K、0.19mg生物素、0.5mg叶酸、22mg肌醇、1.5mg烟酸、4.5mg泛酸钙、63mg维生素C、5mg维生素B

实施例1

将孜然果实清洗后自然晾干后粉碎过80目筛，取100g孜然粉末样品，与400mLpH＝8.5的碳酸钠溶液混合后浸泡20h，后于75℃超声浸提40min，超声的功率为200W，超声的频率为20kHZ。重复提取2次至提取液颜色变浅，合并提取液。将提取液在60rpm、75℃、0.03MPa旋转蒸发浓缩至400mL，盐酸调节提取液浓缩液pH值至7，将提取液与1.2L体积分数58％的乙醇溶液混合，静置18h后，8000rpm离心8min，得沉淀1和溶液1；将溶液1与4.80L体积分数为68％的乙醇混合，静置18h后，8000rpm离心8min得沉淀2和溶液2；将溶液2与19.2L体积分数为88％的乙醇混合，静置18h后，8000rpm离心8min得沉淀3和溶液3；收集沉淀1、沉淀2和沉淀3，获得孜然多糖提取物。将溶液3在60rpm、75℃、0.03MPa旋转蒸发浓缩至50mL，得到孜然黄酮提取物。

本实施例的罗非鱼饲料包含0.05g孜然多糖提取物、玉米粉45g、鱼粉20g、次粉10g、豆粕16g、复合维生素0.1g、复合矿物质0.1g，氯化胆碱0.4g、磷酸二氢钙0.8g。

实施例2

将孜然果实清洗后自然晾干后粉碎过80目筛，取100g孜然粉末样品，与500mLpH＝9的碳酸钠溶液混合后浸泡24h，后于80℃超声浸提50min，超声的功率为250W，超声的频率为30kHZ。重复提取3次至提取液颜色变浅，合并提取液。将提取液在80rpm、80℃、0.04MPa旋转蒸发浓缩至500mL，盐酸调节提取液浓缩液pH值至7.2，将提取液与2L体积分数60％的乙醇溶液混合，静置24h后，10000rpm离心10min，得沉淀1和溶液1；将溶液1与7.5L体积分数为70％的乙醇混合，静置24h后，10000rpm离心10min得沉淀2和溶液2；将溶液2与40L体积分数为90％的乙醇混合，静置24h后，10000rpm离心10min得沉淀3和溶液3；收集沉淀1、沉淀2和沉淀3，获得孜然多糖提取物。将溶液3在80rpm、80℃、0.04MPa旋转蒸发浓缩至60mL，得到孜然黄酮提取物。

本实施例的罗非鱼饲料包含0.2g孜然多糖提取物、玉米粉50g、鱼粉21g、次粉11g、豆粕17g、复合维生素0.15g、复合矿物质0.15g、氯化胆碱0.5g、磷酸二氢钙0.8g。

实施例3

将孜然茎秆清洗后自然晾干后粉碎过80目筛，取100g孜然粉末样品，与600mLpH＝9.5的碳酸钠溶液混合后浸泡25h，后于85℃超声浸提60min，超声的功率为300W，超声的频率为40kHZ。重复提取3次至提取液颜色变浅，合并提取液。将提取液在100rpm、85℃、0.05MPa旋转蒸发浓缩至450mL，盐酸调节提取液浓缩液pH值至7.5，将提取液与2.7L体积分数62％的乙醇溶液混合，静置22h后，12000rpm离心12min，得沉淀1和溶液1；将溶液1与18L体积分数为72％的乙醇混合，静置22h后，10000rpm离心10min得沉淀2和溶液2；将溶液2与60L体积分数为92％的乙醇混合，静置22h后，12000rpm离心12min得沉淀3和溶液3；收集沉淀1、沉淀2和沉淀3，获得孜然多糖提取物。将溶液3在100rpm、85℃、0.05MPa旋转蒸发浓缩至55mL，得到孜然黄酮提取物。

本实施例的罗非鱼饲料包含0.1g孜然黄酮提取物、玉米粉55g、鱼粉23g、次粉12g、豆粕18g、复合维生素0.2g、复合矿物质0.2g、氯化胆碱0.6g、磷酸二氢钙1.2g。

实施例4

本实施例的罗非鱼饲料包含0.2g孜然黄酮提取物、玉米粉50g、鱼粉21g、次粉11g、豆粕17g、复合维生素0.15g、复合矿物质0.15g、氯化胆碱0.5g、磷酸二氢钙0.8g。本实施例中的孜然黄酮提取物按照实施例2中的方法制备。

对比例1

与实施例2不同的是，对比例1的饲料中未添加孜然多糖提取物。

对比例2

与实施例2不同的是，对比例2的饲料中添加1g孜然果实粉末，未添加孜然多糖提取物。

对比例3

与实施例2不同的是，对比例3的饲料中添加10g实施例2中的孜然提取后废弃物，未添加孜然多糖提取物。

对比例4

取100g孜然果实样品，以料液比1:5与75％乙醇混合，浸泡24h后，于80℃超声浸提50min，-0.1MPa，55～65℃减压回收乙醇，然后于80rpm、80℃、0.04MPa将提取液旋转蒸发浓缩至60mL，得到孜然醇提物。

与实施例2不同的是，对比例5的饲料添加0.2g孜然醇提物，未添加孜然多糖提取物。

对比例5

取100g孜然果实样品，以料液比1:5与蒸馏水混合，浸泡24h；蒸馏法回流提取5h得橙黄透明状挥发油，至不出油则停止，精油中加入无水硫酸钠，过滤硫酸钠获得孜然精油。

与实施例2不同的是，对比例5的饲料添加0.2g孜然精油，未添加孜然多糖提取物。

实验例1

本实验用罗非鱼购自南宁市江南区亭子莫屋角鱼苗市场。在实验环境下，饲养在50cm×30cm×40cm的玻璃水箱中，每箱25条实验鱼(9.20±0.65g)。每个处理组三个平行。分别为CK组、FR组、WA组、PO组、FL组、AE组、OI组。其中，

CK组喂食对比例1的饲料，未添加孜然多糖和孜然黄酮；

FR组喂食对比例2的饲料，添加1％孜然果实；

WA组喂食对比例3的饲料，添加10％孜然提取后废弃物；

PO组喂食实施例2的饲料，添加0.2％孜然多糖提取物；

FL组喂食实施例4的饲料，添加0.2％孜然黄酮提取物；

AE组喂食对比例4的饲料，添加0.2％孜然醇提物；

OI组喂食对比例5的饲料，添加0.2％孜然精油。

正式实验开始前，用CK组饲料喂养14天，使实验鱼适应养殖环境。每天在8:00与18:00投喂两次。为防止饲料浪费，缓慢投喂，直至实验鱼没有明显的饥饿表现。实验进行8周(56天)，记录每个水箱的饲料消耗量。

饲养56天后，所有鱼被禁食24h，以减少肠道饲料残留。然后用丁香酚将鱼麻醉，从每个水箱中随机抽取鱼用于获得血液样本、肝脏和肠道切片样本。用1mL的无菌注射器从尾静脉采集血液，存于2mL离心管中。4℃静置5h后，4℃，2000r离心10min，获得上清血清，在-80℃下冷冻保存。将内脏分离，获得肝脏和中肠保存在多聚甲醛固定液中，作为切片样本。同时获取肝脏，用液氮速冻后保存在-80℃，用以测定肝脏抗氧化酶活性。

1.不同组别罗非鱼的生长性能

在试验周期结束后，称取每缸罗非鱼的重量，并计算总数，以计算生长指标。采用初始均重(initialbody weight，IBW)、终末均重(final body weight，FBW)、增重率(weight gainrate，WGR)、特定生长率(specific grown rate，SGR)、饲料系数(feedconversion ration，FCR)、摄食量(feed intake，FI)和存活率(survival rate，SR)来评估罗非鱼的生长性能，计算公式如下：

WGR(％)＝100×(终末体重均值-初始体重均值)/初始体重；

SGR(％/d)＝100x[Ln(终末体重均值)-Ln(初始体重均值)]/养殖天数；

FI(％/d)＝100×总摄食量/[(终末鱼总重+初始鱼总重)/2×养殖天数]；

SR(％)＝100×实验末剩余鱼尾数/实验初鱼投放数。

不同组别罗非鱼生长性能如表1所示。

表1不同组别罗非鱼的生长性能

注：数值以“平均值±标准误”表示(n＝3)，同一行数值后上标的不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)

由表1可知，摄食PO、FL组饲料的罗非鱼终末重量、体重增长率、特定生长量均显著高于CK组、AE组和WA组(P<0.05或0.01)，WA组的终末重量、体重增长率、特定增长率均最低；PO、FL的饲料系数显著低于CK组、AE组和WA组(P<0.05或0.01)，WA组的饲料系数最高；PO、FL的成活率最高且显著高于CK和OI组(P<0.05)；FR、WA、AE的摄食量显著高于其余处理组(P<0.05或0.01)，WA组最高；综上所述，添加孜然多糖提取物和孜然黄酮提取物的罗非鱼饲料取得了比其他组更好的养殖效果。

2.不同组别罗非鱼肝脏组织形态观察

石蜡切片及H&E染色参照陈启亮等(陈启亮.铜对黄颡鱼和矛尾复虾虎鱼脂类代谢的影响及机理研究.2015)的方法。大致流程如下：酒精梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片(厚度为5～7μm)和染色。染色的过程为：二甲苯脱蜡—100％～50％酒精逐级复水—苏木精染色—流水冲洗返蓝—50％～95％酒精逐级脱水—伊红染色—二甲苯透明—中性树胶封片—镜检拍照，结果如图1所示。图1显示，CK组罗非鱼出现明显病理变化，脂质沉积明显，WA、AE、OI组的罗非鱼出现不同程度的脂质沉积，而饲喂PO、FL、FR的罗非鱼肝脏中没有明显的病变，处于较为健康的状态。

3.不同组别罗非鱼抗氧化性能

对不同组别罗非鱼血清中的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、总抗氧化能力(T-AOC)进行测定，具体操作步骤为：将解冻后肝脏样本称重，以1:9(w/v)加入生理盐水，用高速组织研磨仪(KZ-II，Servicebio)4℃研磨10min，将研磨液4℃，3000～4000r，离心10min，取上清制备成10％的组织匀浆，用于测定抗氧化酶活性。使用南京建成生物工程研究所试剂盒(南京，中国)测定肝脏和血清的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(A001-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)(A005)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)(A003-1)含量，测定肝脏总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)(A015-2-1)。测定过程均参照试剂盒说明书进行。酶活测定过程中所需要的吸光度值利用酶标仪检测仪(Epoch，Biotek，USA)测定。

测定结果如图2所示。图2显示，摄食PO、FL、FR组饲料的罗非鱼SOD均显著高于CK组、AE、WA(P<0.05或0.01)，WA组的超氧化物歧化酶活性最小，PO组超氧化物歧化酶活性最高。PO、FL、FR组的丙二醛含量显著低于CK(P<0.05或0.01)，WA组的丙二醛水平最高，显著高于其他处理组(P<0.01)。此外，AE组的谷胱甘肽过氧化物酶活性显著低于其他处理组(P<0.01)，总抗氧化能力显著低于OI组、WA组。综上，食用添加孜然多糖提取物和孜然黄酮提取物的罗非鱼饲料的罗非鱼的抗氧化能力最佳。

4.不同组别罗非鱼肠道的形态变化

用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色对实验鱼的肝脏、肠道样本染色以进行形态学观察。取出保存在多聚甲醛中的肝脏、肠道切片样本，用30～70％的乙醇进行逐步脱水。然后用石蜡将其固定，制成5μm厚度的切片样本。染色后于显微镜(Olympus TS0X41microscope,Tokyo,Japan)下观察，并保存为图片。用ImageJ软件测量肠道切片的内绒毛长度(从绒毛顶端至隐窝开口处的垂直距离)，每个切片不少于6个绒毛。观察结果如图3所示。其中，A为CK，空白对照组；B，FR组，添加1％孜然果实；C，WA组，添加10％孜然提取后废弃物；D，PO组，添加0.2％孜然多糖提取物；E，FL组，添加0.2％孜然黄酮提取物；F，AE组，添加0.2％孜然醇提物；H，绒毛长度(μm)。比例尺＝200μm；放大倍数×100。

由图3可知，在饲料中添加孜然黄酮提取物和孜然多糖提取物后，罗非鱼绒毛形态规则，长度显著增加，说明孜然黄酮提取物和孜然多糖提取物增加了罗非鱼的肠绒毛长度，有利于提高罗非鱼的消化能力。

5.不同组别罗非鱼血清生化参数

使用全自动生化分析仪(深圳雷杜生命科技，Chemray 800)测定血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(cholesterol，CHO)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)水平、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)。以上指标采用相应的检测试剂盒(深圳雷杜生命科技)测定，测定过程参照试剂盒说明书进行，结果如图4所示。图4显示，在饲养八周后，摄食PO、FL、OI组饲料的罗非鱼ALT水平显著低于其余处理组(P<0.05或0.01)，FR的ALT活性显著低于CK，PO的ALT活性最低。摄食PO、FL、OI组饲料的罗非鱼AST水平显著低于CK(P<0.01)，AE的AST活性最高。添加孜然提取物的各处理组罗非鱼的血清TG均显著低于CK(P<0.01)，但CHO、HDL、LDL与CK相比无显著差异性。

实验例2不同浓度孜然多糖和黄酮对罗非鱼生长、抗氧化的影响

将实施例2中孜然成分提取获得的孜然多糖提取物(Polysaccharide)、孜然黄酮提取物(Flavone)应用到罗非鱼饲料中。设计了7个不同添加量的处理组，分别为CK(对照组)、PO-L(多糖提取物低浓度组，添加0.05％孜然多糖提取物)、PO-M(多糖提取物中浓度组，添加0.1％孜然多糖提取物)、PO-H(多糖提取物高浓度组，添加0.2％孜然多糖提取物)、FL-L(黄酮提取物低浓度组，添加0.05％孜然黄酮提取物)、FL-M(黄酮提取物中浓度组，添加0.1％孜然黄酮提取物)、FL-H(黄酮提取物高浓度组，添加0.2％孜然黄酮提取物)，喂食方式同实验例1。

实验鱼与样品采集、生长性能测定、肝脏与肠道的形态观察、肝脏抗氧化酶活测定、血清参数测定、肠道形态检测同上述方法。

1.不同浓度的孜然黄酮和孜然多糖对罗非鱼的生长性能的影响

在饲养八周后，各组罗非鱼的生长性能如表2所示：

表2饲料中添加孜然多糖或黄酮提取物对罗非鱼生长性能的影响

注：数值以“平均值±标准误”表示(n＝3)，同一行数值后上标的不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)。IBW，初始重量(g)；FBW，终末重量(g)；WGR，体重增长率(％)；SGR，特定生长率(％/d)；FCR，饲料系数；FI，摄食量(％/d)；SR，存活率(％)。CK，空白对照组；PO-L，添加0.05％孜然多糖提取物；PO-M，添加0.1％孜然多糖提取物；PO-H，添加0.2％孜然多糖提取物；FL-L，添加0.05％孜然黄酮提取物；FL-M，添加0.1％孜然黄酮提取物；FL-H，添加0.2％孜然黄酮提取物。

表2显示，摄食多糖组饲料(PO-L、PO-M、PO-H)的罗非鱼FBW、WGR、SGR均显著增加(P<0.05或0.01)，且FCR显著降低(P<0.05或0.01)；FL-L饲料组的罗非鱼FBW显著增加(P<0.05)，FCR降低(P<0.05)。FL-M、FL-H对罗非鱼的生长性能的促进作用无显著性，各处理组之间FI、SR无显著性。

2.形态学观察与分析

如图5肝脏组织形态观察显示，在饲养八周后，CK组罗非鱼出现明显病理变化，脂质沉积明显，而饲喂添加孜然多糖或黄酮提取物饲料的罗非鱼肝脏中没有明显的病变，处于较为健康的状态。

如图6肠道组织形态观察显示，各处理组的肠道均未发现明显的病理变化。除FL-M和FL-H外，其余饲喂添加孜然多糖或黄酮提取物饲料(PO-L、PO-M、PO-H、FL-L)的罗非鱼的肠道绒毛长度均显著高于CK组。

3.肝脏抗氧化性能

将解冻后肝脏样本称重，以1:9(w/v)加入生理盐水，用高速组织研磨仪(KZ-II，Servicebio)4℃研磨10min，将研磨液4℃，3000-4000r，离心10min，取上清制备成10％的组织匀浆，用于测定抗氧化酶活性。使用南京建成生物工程研究所试剂盒(南京，中国)测定肝脏和血清的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(A001-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)(A005)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)(A003-1)含量，测定肝脏总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)(A015-2-1)。测定过程均参照试剂盒说明书进行。酶活测定过程中所需要的吸光度值利用酶标仪检测仪(Epoch，Biotek，USA)测定。

如图7结果显示，在饲养八周后，摄食PO-M、PO-H、FL-M、FL-H饲料的罗非鱼肝脏中SOD活性显著高于CK(P<0.05或0.01)；PO-L、PO-M、FL-L的MDA含量显著低于CK(P<0.01)；PO-H的GSH-PX最高，显著高于气体处理组(P<0.01)；T-AOC无差异性。

4.血清生化参数

如图8结果显示，在饲养八周后，摄食PO-M的罗非鱼血清中ALT活性显著低于CK(P<0.01)，但FL-M、FL-H的ALT活性增加；摄食多糖的罗非鱼AST活性显著低于CK(P<0.01)；添加孜然多糖或黄酮的罗非鱼的血清TG均显著低于CK(P<0.05或0.01)，但对血清CHO和HDL无显著影响，但添加PO-L使得LDL较CK显著增加(P<0.05)。

由以上实施例可知，本发明提供了一种罗非鱼饲料。该饲料中添加了0.05～0.2％的孜然黄酮提取物或孜然多糖提取物，能够提升罗非鱼的生长性能、提高罗非鱼的消化能力、减少肝脏脂质沉积并提升罗非鱼的免疫力和抗氧化性能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。