用于治疗糖尿病的方法和试剂

交叉引用

本申请要求2018年7月19日提交的美国临时专利申请序列号62/700583以及2018年7月19日提交的美国临时专利申请序列号62/700587的优先权，将每篇所述专利通过引用以其全文并入。

背景技术

国际糖尿病联合会(IDF)估计，2011年患糖尿病的人数为3.66亿，并且预期该数字到2030年增长至5.5亿。大多数患者患有2型糖尿病(T2DM)。在肥胖、胰岛素抵抗与T2DM的发生之间存在联系，但是确切的潜在机制仍然未知，并且鉴定可以最终解决这一关键问题的潜在治疗性靶标变得至关重要。

T2DM中受胰岛素抵抗影响的经典靶组织是肌肉、肝脏和脂肪。这些外周组织通过有效地响应胰岛素而维持葡萄糖稳态，并且胰岛素激活其受体失败和下游信号传导级联导致缺乏葡萄糖处理。另外，胰岛素可以刺激其在胰腺β细胞上的受体，且从而直接有助于胰岛素生物合成和分泌的正反馈回路。

发明内容

在一方面，本公开提供了用于治疗糖尿病或限制糖尿病的发生的方法，所述方法包括向患有糖尿病或有糖尿病风险的受试者的眼睛中移植有效治疗或限制糖尿病发生的量的胰岛素产生细胞，所述胰岛素产生细胞经工程化以降低Cav的β3亚基(Cavβ3)的表达。在一个实施方案中，所述胰岛素产生细胞经工程化以破坏所述Cavβ3基因的每个拷贝。在另一个实施方案中，所述胰岛素产生细胞经工程化以降低apoCIII的表达，诸如通过破坏所述apoCIII基因的每个拷贝来降低。在另一个实施方案中，所述胰岛素产生细胞经工程化以降低一种或多种趋化因子和/或一种或多种细胞因子的表达，所述一种或多种趋化因子包括但不限于CCL2、CCL3、CCL5、CXCL1、CXCL9、CXCL10和/或CXCL11，所述一种或多种细胞因子包括但不限于IL-6和/或IL-8。在一个实施方案中，所述胰岛素产生细胞经工程化以降低一种或多种主要组织相容性复合物(MHC)I类蛋白的表达，所述一种或多种蛋白质包括但不限于人HLA-A、HLA-B和/或HLA-C基因。在另一个实施方案中，所述胰岛素产生细胞经工程化以破坏所述一种或多种MHC I类蛋白的每个拷贝。在一个实施方案中，所述胰岛素产生细胞经工程化以增加一种或多种对胰岛素产生细胞有益的蛋白质的表达，所述一种或多种蛋白质包括但不限于GLP1受体、胰岛素受体和/或细胞因子IL1B。在另一个实施方案中，所述胰岛素产生细胞包括分离的胰岛或分离的胰腺β细胞，诸如分离的人胰岛或分离的人胰腺β细胞。在另一个实施方案中，所述向眼睛中移植包括向眼睛的前房中移植，包括但不限于向眼睛的前房中移植包括通过角膜的注射。在一个实施方案中，所述受试者，诸如人受试者患有糖尿病，并且所述移植包括向患有糖尿病(包括但不限于1型和2型糖尿病)的受试者的眼睛中移植有效治疗糖尿病的量。在另一个实施方案中，所述受试者，诸如人受试者有糖尿病风险，并且所述移植包括向有糖尿病(包括但不限于1型和2型糖尿病)风险的受试者的眼睛中移植有效限制糖尿病发生的量。在另一个实施方案中，所述受试者，诸如人受试者与对照相比过表达Cavβ3。

在另一方面，本公开提供了重组细胞，所述重组细胞包括经工程化以降低Cav的β3亚基(Cavβ3)的表达的胰岛素产生细胞。在一个实施方案中，所述胰岛素产生细胞经工程化以破坏所述Cavβ3基因的每个拷贝。在另一个实施方案中，所述胰岛素产生细胞经工程化以降低apoCIII的表达，诸如通过破坏所述apoCIII基因的每个拷贝来降低。在另一个实施方案中，所述胰岛素产生细胞经工程化以降低一种或多种趋化因子和/或一种或多种细胞因子的表达，所述一种或多种趋化因子包括但不限于CCL2、CCL3、CCL5、CXCL1、CXCL9、CXCL10和/或CXCL11，所述一种或多种细胞因子包括但不限于IL-6和/或IL-8。在一个实施方案中，所述胰岛素产生细胞经工程化以降低一种或多种主要组织相容性复合物(MHC)I类蛋白的表达，所述一种或多种蛋白质包括但不限于人HLA-A、HLA-B和/或HLA-C基因。在另一个实施方案中，所述胰岛素产生细胞经工程化以破坏所述一种或多种MHC I类蛋白的每个拷贝。在一个实施方案中，所述胰岛素产生细胞经工程化以增加一种或多种对胰岛素产生细胞有益的蛋白质的表达，所述一种或多种蛋白质包括但不限于GLP1受体、胰岛素受体和/或细胞因子IL1B。在另一个实施方案中，所述胰岛素产生细胞包括分离的胰岛或分离的胰腺β细胞，诸如分离的人胰岛或分离的人胰腺β细胞。

附图说明

图1.Ca

图2.Ca

图3.Ca

图4.喂养HFD的Ca

图5.用靶向Ca

图6.Ca

图7.Ad-Ca

具体实施方式

本文中引用的所有参考文献均通过引用以其全文并入本文。在本申请中，除非另有说明，否则所利用的技术可以在诸如以下的若干篇熟知的参考文献中找到：MolecularCloning:A Laboratory Manual(Sambrook等人,1989,Cold Spring Harbor LaboratoryPress)；Gene Expression Technology(Methods in Enzymology,第185卷,由D.Goeddel编辑,1991.Academic Press,San Diego,CA)；“Guide to Protein Purification”，Methodsin Enzymology(M.P.Deutshcer编辑,(1990)Academic Press,Inc.)；PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications(Innis等人1990.Academic Press,San Diego,CA)；Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,第2版(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,NY)；Gene Transfer and ExpressionProtocols,第109-128页,E.J.Murray编辑,The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.)；以及Ambion 1998目录(Ambion，Austin，TX)。

如本文所用，不使用数量词修饰时包括复数种/个指示物，除非上下文另外明确规定。如本文所用，“和”与“或”可互换使用，除非另外明确说明。

本公开的任何方面的所有实施方案均可以组合使用，除非上下文明确另外规定。

电压门控Ca

在第一方面，本公开提供了用于治疗或限制糖尿病的发生的方法，所述方法包括向患有糖尿病或有糖尿病风险的受试者的眼睛中移植有效治疗或限制糖尿病发生的量的经工程化以降低或消除Cav的β3亚基(Cavβ3)的表达的胰岛素产生细胞。如在实施例中公开的，本发明人已经发现，与经工程化以降低或消除Cavβ3的表达的移植胰岛相比，本公开的方法和重组细胞显著改善了治疗或限制糖尿病发生的能力。

在一个实施方案中，人胰岛素产生细胞经工程化以减少或消除人Cavβ3的表达。如本领域技术人员将理解的，存在人Cavβ3的多种同种型，并且所述方法可用于降低或消除任何此类同种型、或编码此类同种型的基因的表达。在各种非限制性实施方案中，人Cavβ3可以包含氨基酸序列，或可以由核酸编码，如以下中所述：NCBI基因ID条目784、EnsembleENSG00000167535(基因CACNB3)、UniProt数据库登录号P54284和GenBank mRNA参考序列NM_000725、NM_001206915、NM_001206916和NM_001206917；GenPept蛋白质参考序列NP_000716、NP_001193844、NP_001193845和NP_001193846。

细胞工程化可以包括用于降低Cavβ3的表达的任何合适手段，包括但不限于使用可得的基因工程技术对细胞进行工程化以降低Cavβ3基因表达/转录或蛋白质翻译。表达的任何合适降低都将提供益处(即：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多，或表达的完全消除)。

在一个非限制性实施方案中，所述方法包括通过任何合适技术对细胞进行工程化以降低Cavβ3基因的表达/转录，所述任何合适技术包括但不限于本文公开的方法。在一个实施方案中，破坏Cavβ3基因的每个拷贝以使得不发生基因表达/转录，或者消除Cavβ3基因的每个拷贝。

在多种实施方案中，细胞经工程化以降低其他蛋白质的表达，所述其他蛋白质包括但不限于载脂蛋白CIII(apoCIII)、一种或多种趋化因子(包括但不限于CCL2、CCL3、CCL5、CXCL1、CXCL9、CXCL10和/或CXCL11)、一种或多种细胞因子(包括但不限于IL-6和/或IL-8)和/或一种或多种主要组织相容性复合物(MHC)I类蛋白(包括但不限于人HLA-A、HLA-B和/或HLA-C基因)。细胞工程化可以包括用于降低这些其他蛋白质的表达的任何合适手段，包括但不限于使用可用的基因工程技术对细胞进行工程化以降低基因表达/转录或蛋白质翻译。表达的任何合适降低都将提供益处(即：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多，或表达的完全消除)。

在一个非限制性实施方案中，所述方法包括通过任何合适技术对细胞进行工程化以降低编码其他蛋白质的基因的表达/转录，所述任何合适技术包括但不限于本文公开的方法。在一个实施方案中，破坏蛋白质编码基因的每个拷贝以使得不发生基因表达/转录，或者消除蛋白质编码基因的每个拷贝。

在多种另外的实施方案中，细胞经工程化以增加对有益胰岛素产生细胞存活和功能有益的其他蛋白质的表达，所述其他蛋白质包括但不限于GLP1受体、胰岛素受体和细胞因子IL1B。细胞工程化可以包括用于增加这些其他蛋白质的表达的任何合适手段，包括但不限于使用可用的基因工程技术对细胞进行工程化以增加基因表达/转录或蛋白质翻译。表达的任何合适增加都将提供益处(即：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多)。

可以使用任何合适的胰岛素产生细胞。在一个实施方案中，胰岛素产生细胞包括分离的胰腺β细胞。如本文所用，“胰腺β细胞”是含有胰腺β胰岛细胞的任何细胞群。此类胰腺β胰岛细胞群包括胰腺、分离的郎格罕氏胰岛(“胰岛”)和分离的胰腺β胰岛细胞。如本领域技术人员将理解的，β细胞可以与其他细胞(包括但不限于其他胰岛细胞，诸如α细胞、δ细胞、ε细胞和/或γ细胞；或其他感兴趣的细胞类型)一起移植，其中此类其他细胞可以经工程化以例如降低其他蛋白质的表达，所述其他蛋白质包括但不限于一种或多种趋化因子(包括但不限于CCL2、CCL3、CCL5、CXCL1、CXCL9、CXCL10和/或CXCL11)、一种或多种细胞因子(包括但不限于IL-6和/或IL-8)和/或一种或多种主要组织相容性复合物(MHC)I类蛋白(包括但不限于人HLA-A、HLA-B和/或HLA-C基因)。

向眼睛中移植可以包括向眼睛的前房中移植。眼睛的前房包括眼睛的前部，并且包括玻璃状液前面的结构，以及角膜、虹膜、睫状体和晶状体。将细胞移植到眼睛的前房中可以包括将细胞放置到这些眼睛前房隔室中的任何一个或多个中。在一个非限制性实例中，将细胞经由通过角膜的注射来移植，这允许将移植的细胞移入到虹膜上，从而允许通过角膜进行观察和成像。

移植到眼睛的前房中、移入在虹膜上的胰岛素产生细胞(诸如胰腺β细胞)变得血管化和受神经支配、保留其细胞组成并对刺激做出应答。此外，它们可以通过允许对胰岛血管化、神经支配以及β细胞功能和胰岛素释放进行体内成像的非侵入性激光扫描显微镜法(LSM)进行监控。在这些实施方案中，可以对胰岛素产生细胞或其组分进行荧光标记，并且可以使用荧光成像来监测细胞活性。

可以通过本领域技术人员已知的任何技术来完成眼睛前房上的荧光成像，所述任何技术包括但不限于激光扫描显微镜法。在一个实施方案中，所述方法包括通过在适当的波长下的激光刺激来刺激来自感兴趣的标记细胞组分的荧光，以非侵入性地获得移植细胞中细胞成组分的荧光图像。

在一个实施方案中，所述方法用于治疗糖尿病。在该实施方案中，受试者已被诊断为患有1型或2型糖尿病。如本文所用，“糖尿病”的特征在于胰腺的胰岛素产生不足或不产生胰岛素，从而导致高血糖水平。

如本文所用，“治疗糖尿病”可能意指完成以下中的一项或多项：(a)降低糖尿病或糖尿病并发症的严重程度；(b)限制或预防糖尿病并发症的发生；(c)抑制糖尿病并发症或糖尿病特征性症状的恶化；(d)限制或预防糖尿病并发症或糖尿病特征性症状的复发；(e)限制或预防先前有症状的患者的糖尿病并发症或糖尿病特征性症状的复发。

可以通过本发明的方法治疗的糖尿病特征性症状包括但不限于升高的血糖水平、降低的胰岛素产生、胰岛素抵抗、蛋白尿和受损的肾小球清除率。可以根据本发明的方法治疗的糖尿病并发症包括但不限于神经中的并发症(诸如糖尿病性神经病)和与平滑肌细胞调节异常(dysregulaton)相关的并发症(包括但不限于勃起功能障碍、膀胱功能障碍和血管并发症，包括但不限于动脉粥样硬化、中风和外周血管疾病)。

在另一个实施方案中，所述方法用于限制糖尿病的发生。在该方面，受试者有1型或2型糖尿病的风险，并且益处是限制糖尿病和/或糖尿病并发症的发生。可以治疗有患糖尿病风险的任何受试者，包括但不限于患有以下中的一种或多种的受试者：代谢综合征、已知的糖尿病遗传风险因素、糖尿病家族史和肥胖症。

在另一个实施方案中，用于治疗或限制糖尿病和/或糖尿病并发症的发生的方法可以包括治疗已被鉴定为与对照相比过表达Cavβ3的那些个体。Cavβ3表达的增加可以在糖尿病并发症的发生之前，并且因此该实施方案允许及早检测合适使用本发明的方法进行治疗的患者。

如本文所用，“过表达”是高于对照的任何量的Cavβ3表达。可以使用任何合适的对照，包括来自已知未患有糖尿病的受试者的Cavβ3表达水平，或者来自相似患者样品群的先前确定的Cavβ3标准化表达水平。相对于对照任何增加量的Cavβ3表达都被认为是“过表达”；在各种实施方案中，与对照相比，过表达包括至少10％、20％、50％、100％、200％或更高的Cavβ3表达增加。可以使用任何合适技术来鉴定Cavβ3。

如本文所用，术语“受试者”或“患者”意指需要疗法的任何受试者，包括人、牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、昆虫、马、鸡等。更优选地，受试者是人。

在另一方面，本公开提供了用于进行本公开的方法的工程化细胞。所公开的用于所述方法的工程化细胞的所有实施方案适用于本公开的工程化细胞。在各种实施方案中，细胞经工程化以降低其他蛋白质的表达，所述其他蛋白质包括但不限于载脂蛋白CIII(apoCIII)、一种或多种趋化因子(包括但不限于CCL2、CCL3、CCL5、CXCL1、CXCL9、CXCL10和/或CXCL11)、一种或多种细胞因子(包括但不限于IL-6和/或IL-8)和/或一种或多种主要组织相容性复合物(MHC)I类蛋白(包括但不限于人HLA-A、HLA-B和/或HLA-C基因)。在各种另外的实施方案中，细胞经工程化以增加对有益胰岛素产生细胞存活和功能有益的其他蛋白质的表达，所述其他蛋白质包括但不限于GLP1受体、胰岛素受体和细胞因子IL1B。可以使用任何合适的胰岛素产生细胞。在一个实施方案中，胰岛素产生细胞包括分离的胰腺β细胞，诸如人胰腺β细胞。

实施例

在此，我们报吿了，Cavβ3在糖尿病胰岛中Ca2+动力学和随后胰岛素分泌的改变中起主要作用。我们观察到来自糖尿病小鼠的胰岛中的Cavβ3蛋白水平升高，并且响应于高葡萄糖浓度的[Ca2+]i动力学发生改变。Cavβ3的缺乏阻止了糖尿病进展过程中Ca2+信号传导的改变。与来自对照小鼠的胰岛相比，来自糖尿病小鼠的胰岛中Cavβ3的表达降低显示[Ca2+]i动力学和胰岛素分泌的改善，从而导致小鼠中的葡萄糖耐量改善。因此，靶向Cavβ3可能是糖尿病(诸如T2DM)的治疗策略。

结果

结果

来自ob/ob小鼠的胰岛过表达Ca

我们使用糖尿病小鼠模型B6.Cg-Lep

来自HFD喂养小鼠的胰岛过表达Ca

接下来，我们使用另一种T2DM模型高脂饮食(HFD)喂养小鼠研究Ca

胰岛中的Ca

为了研究糖尿病胰岛中的[Ca

来自暴露于HFD的Ca

我们检查了Ca

用靶向Ca

下一个问题是降低Ca

Ca

为了评估在体内糖尿病发作后靶向胰岛中的Ca

Ca

为了研究Ca

讨论

在本研究中，我们显示，Ca

胰岛中Ca

我们提议将Ca

方法细节

实验动物护理和胰岛/细胞制备

所有实验程序均已由浦项科技大学机构动物护理和使用委员会(PohangUniversity of Science and Technology Institutional Animal Care and UseCommittee)(POSTECH-2015-0055-R1，POSTECH IACUC，Korea)批准。使用了C57BL/6J、B6.Cg-Lep

[Ca

使用Fura2-AM方法测量[Ca

SDS-PAGE和免疫印迹分析

将胰岛在Laemmli样品缓冲液中裂解，并在95℃下加热5min。将蛋白质在SDS-page凝胶中分离(6％-16％梯度)，并转移至硝酸纤维素膜(Whatman，Maidstone，UK)。将印迹用5％脱脂乳封闭30min，与Ca

重组腺病毒和反义寡核苷酸

通过携带Flag2-WT或Flag2-Ca

葡萄糖和胰岛素耐量测试

对于葡萄糖耐量测试，将小鼠禁食过夜，并腹膜内注射1g/kg的d-葡萄糖(Sigma-Aldrich)。对于胰岛素耐量测试，将小鼠禁食4h，并且腹膜内注射0.2U/kg的胰岛素(EliLilly&Co.，Indianapolis，Indiana，USA)。在注射后0、15、30、60和120min，通过尾部出血收集血液样品。使用血糖仪(Accu-Check

胰岛素释放

将从相应小鼠中分离的十个胰岛合并，并以3mM或11mM葡萄糖在HEPES缓冲液中在37℃下孵育30min。收集调理缓冲液，并按照制造商的说明书，使用大鼠/小鼠胰岛素ELISA试剂盒(ALPCO Diagnostics，Salem，NH)测量胰岛素浓度。将GSIS数据通过胰岛的数量归一化。对于用人胰岛的实验，将用Ad-GFP或Ad-Ca

胰岛移植

将小鼠禁食过夜，且然后经由腹膜内注射向所述小鼠注射150mg/kg的链脲佐菌素(Sigma-Aldrich)。当葡萄糖水平>300mg/dl时，注射0.2U/kg/天的胰岛素(Eli Lilly&Co.)以维持糖血。从供体小鼠中分离出胰岛，并将约100个胰岛移植到受体小鼠的眼睛的前房中(Speier等人,2008)。

电生理记录

用EPC-10膜片钳放大器(HEKA Elektronik，Lambrecht/Pfalz，Germany)对腺病毒感染的单个胰岛细胞进行常规的全细胞膜片钳分析。将细胞浸入外部溶液(138mM NaCl、10mM TEACl、10mM CaCl

统计

所有结果呈现为平均值±SEM。对于成对比较使用未配对学生t检验。来自葡萄糖和胰岛素耐量测试的结果的统计显著性通过双向重复测量ANOVA之后通过与Bonferroni校正的多重比较来评估。p值<0.05被视为统计学上显著的。