一种柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型荧光RT-PCR检测试剂及方法

技术领域

本发明涉及病原微生物检测技术，具体地说涉及柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型的核酸检测。

背景技术

手足口病是以手、足、口腔等部位皮疹或疱疹、发热、咽喉痛、全身不适为主要特征的常见传染病，1957年在新西兰被首次报道。手足口病由肠道病毒感染而引起，主要经粪-口传播，也可经接触患者的粪便、唾液和疱疹液传播。不同年龄人群均可感染发病，以5岁以下儿童为主，尤以3岁以下儿童发病率最高。

肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，病毒颗粒呈球状，直径28～30nm，病毒衣壳呈立体对称的二十面体，由VP1、VP2、VP3和VP4四种衣壳蛋白组成。基因组为单股正链RNA，全长约7.5kb，两端为保守的非编码区，中间为连续开放读码框，包含结构蛋白编码区和非结构蛋白编码区，结构蛋白编码区依次编码VP4、VP2、VP3和VP1共四个衣壳蛋白。

肠道病毒属现有12个种(species)：肠道病毒A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、鼻病毒A、B、C。其中可感染人体的有肠道病毒A、B、C、D和鼻病毒A、B、C七个种，经抗体中和测试已分离出240多个血清型，其中肠道病毒A、B、C、D共已发现100多个血清型，主要包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A组(Coxsackievirus A，CA)、柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B，CB)、埃可病毒(Echovirus)、新肠道病毒等；鼻病毒A、B、C已经先后发现140多个血清型。其中引起手足口病的肠道病毒包括柯萨奇病毒A组的2、4、5、6、7、9、10、16型(CA16)等，B组的1、2、3、4、5型等，肠道病毒71型(EV71)及埃可病毒等，其中以CA16和EV71型较为常见。CA16于1955年在南非被首次发现，而EV71是1969年在美国加州被首次发现，两者均会引起手足口病，且临床症状很难分辨，需通过实验室的病毒检验技术来鉴别。

实验室检验通过对病人的血清、咽拭子或咽喉洗液、粪便或肛拭子、脑脊液或疱疹液及脑、肺、脾、淋巴结等标本进行病毒分离、血清学检测或核酸检测等方法，对肠道病毒进行定性检验和分型。

Taqman荧光RT-PCR是手足口病分子诊断的重要手段，比传统的ELISA等方法更灵敏、更特异、定量更准确、窗口期更短、更快速。Taqman荧光RT-PCR的检测原理是：通过生物信息学研究选取CA16、EV71或其它相关肠道病毒的基因组中既特异又保守的RNA序列作为目标检测序列，在逆转录酶(RT)的作用下病毒RNA被逆转录成cDNA，然后在DNA聚合酶的作用下，利用特异性引物，经过多个循环的变性、退火、延伸步骤，扩增出目标DNA序列,同时通过特异性Taqman探针检测扩增产物。但是，常规荧光RT-PCR检测试剂均为液体试剂，运输和保存有严格的冷链要求(通常为-20℃)以保持试剂活性，保存、运输和使用过程中的温度升高、反复冻融都会降低试剂的检测性能。长途运输时一旦遇到交通受阻，试剂失效的风险及冷链管理成本大大增加，可见液体试剂不能适应长途运输中及冷链条件较差的基层检测机构的应用。

为解决常规液体荧光RT-PCR检测试剂因冷链要求所造成的诸多问题和不便，一种有益的替代方案是将CA16和EV71荧光RT-PCR检测试剂制成常温下稳定的冻干型试剂，目前文献中尚无CA16和EV71荧光冻干型RT-PCR检测试剂的报道。同时，由于新发现的CA16和EV71核酸序列不断增加，基于原有的核酸序列信息设计的CA16和EV71荧光RT-PCR检测试剂面临越来越大的漏检风险。市场需要一种更加准确可靠，且可常温保存的CA16和EV71荧光RT-PCR检测试剂。

发明内容

本发明的目的是依据最新的核酸序列信息，提供一种准确可靠且可常温保存的CA16和EV71荧光RT-PCR检测试剂及其使用方法，摆脱传统液体荧光RT-PCR检测试剂对冷链的苛刻要求。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：

1.检测CA16和EV71的引物、探针的设计

本发明中用于检测CA16和EV71核酸的荧光RT-PCR引物探针组合是基于公众核酸数据库最新的CA16和EV71核酸信息设计、筛选而成，其中：

CA16的特异正向引物序列为5’-ATGTGTGTTGAACCATCACTCCAC-3’(即SEQ ID No.1)和5’-AGATGTGTGTTGAATCATCACTCCA-3’(即SEQ ID No.2)，反向引物序列为5’-CCCGTGGTGGGCATTGT-3’(即SEQ ID No.3)，探针序列为5’-ACAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-3’(即SEQ ID No.4)和5’-ACAGCCATTGGGAATTTCTTCAGCCGT-3’(即SEQ ID No.5)。两条正向引物和两条探针是分别针对该引物/探针所在位置的单核苷酸多态性而设计，可按一定比例混合后使用，优选按1:1的浓度混合后使用。该引物、探针的序列在已知CA16的核酸序列中高度保守，且对其它生物具有排他性，从而最大可能地防止了漏检和错检。

EV71的特异正向引物序列为5’-CCAAATGGTTATGCCAACTGG-3’(即SEQ ID No.6)，反向引物序列为5’-GGTGTGCACGCAACAAAAGT-3’(即SEQ ID No.7)和5’-GGAGTGCACGCAACGAAAGT-3’(即SEQ ID No.8)，探针序列为5’-ACTCTGCATCAAAGCGCATGTAGGTGAA-3’(即SEQ ID No.9)和5’-ATTCCGCATCAAAGCGCATATAGGTGAA-3’(即SEQ ID No.10)。两条反向引物和两条探针是分别针对该引物/探针所在位置的单核苷酸多态性而设计，可按一定比例混合后使用，优选按1:1的浓度混合后使用。该引物、探针的序列在已知EV71的核酸序列中高度保守，且对其它生物具有排他性，从而最大可能地防止了漏检和错检。

上述的CA16和EV71的探针的5’端用荧光报告基团修饰，3’端用荧光淬灭基团修饰。荧光报告基团可以选用FAM、VIC、HEX、JOE、TET、ROX和CY5中的任意一种；荧光淬灭基团可以选用TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的任意一种。作为优选，CA16和EV71的探针的5’端分别用FAM和JOE修饰，3’端均用BHQ1修饰。

2.CA16与EV17荧光RT-PCR检测试剂的反应体系的建立

本发明的CA16与EV17荧光RT-PCR检测试剂包含了除核酸模板外的所有荧光RT-PCR反应组分(见表1)，反应体积为25μl，可配成2x(即12.5μl/反应)的预混液保存于-20℃，使用时加水和待测样本核酸至25μl的反应体积即可上机检测。试剂的反应体积可按比例在5μl-100μl范围内扩大或缩小。

特别地，作为优选，可以在试剂中加入尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和dUTP(见表1)以防止PCR产物气溶胶可能造成的假阳性结果，进一步保证检测的准确性。其原理是：在PCR反应体系中加入dUTP可产生含dU的PCR产物,含dU的PCR产物气溶胶污染物在下次PCR反应前被试剂中的UDG降解，从而消除PCR产物气溶胶污染对检测结果的影响。

表1.CA16与EV71荧光RT-PCR检测试剂成分(按25μl反应体积计算)

3.CA16与EV17荧光RT-PCR检测试剂的冻干

本发明所述的CA16与EV71荧光RT-PCR检测试剂可以是常规的液体剂型，优选地，也可以通过冷冻干燥技术制成冻干型试剂。冻干所得的冻干型试剂的优点是：常温下稳定，无需冷链运输和保存，从而避免了常规液体荧光PCR检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险。

本发明的CA16和EV71荧光RT-PCR检测试剂是由表1的成分冻干而成，可按单个或多个反应的分量冻干在容器中，优选地，可按1份/管冻干在可直接上机的PCR管或由PCR管组合成的多连管或反应板中。冻干所得的CA16与EV71荧光RT-PCR检测试剂为白色颗粒，可在遮光、防潮条件下常温保存。每个反应的分量所含干物质的体积约相当于2μl，使用时直接加总体积为23μl的水和待测核酸样本即可配成25μl的反应体系，优选地，可直接加23μl适当浓度的核酸样本。试剂加水和核酸样本后经慢速震荡可加速溶解，溶解后即可上机检测。

4.CA16与EV17荧光RT-PCR检测试剂的反应程序及结果判定

本发明的CA16与EV71荧光RT-PCR检测试剂的反应程序按表2设置，根据探针荧光报告基团设置荧光信号。

表2.CA16与EV71荧光RT-PCR检测试剂反应程序

反应后CA16和EV71的检测结果分别根据以下条件进行判定：

a)阴性对照品(无核酸酶水)的Ct≥40或无Ct，且阳性对照的Ct值≤30，为有效结果。否则结果无效，须排除错误因素后重检。

b)检测样品Ct≤35，可报告为该病原体阳性。

c)检测样品35＜Ct＜40，报告为该病原体疑似阳性，需重复实验或通过独立方法进行确定。

d)检测样品Ct≥40或无Ct，则报告为该病原体阴性。

本发明的有益效果：

本发明的CA16及EV71冻干型荧光RT-PCR检测试剂所用的引物、探针序列是基于最新的CA16及EV71核酸序列信息设计筛选所得，具有良好的包容性、特异性和反应性能，试剂中的UDG和dUTP防止PCR产物气溶胶可能造成的假阳性结果，进一步保证检测的准确性。另外，本发明运用冷冻干燥技术将CA16及EV71荧光RT-PCR检测试剂制成冻干型试剂，避免了常规液体荧光PCR检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险，适应长途运输和冷链条件差的地区的使用需要。

附图说明

图1：本发明所述的CA16的检测目标序列以及特异引物和探针的位置，其中同源生物的核酸序列的差异位点用实线框显示。

图2：本发明所述的EV71的检测目标序列以及特异引物和探针的位置，其中同源生物的核酸序列的差异位点用实线框显示。

图3：冻干于PCR八连管中的CA16和EV71荧光RT-PCR检测试剂的形态，可见其形态为白色颗粒。

图4：本发明所述的CA16和EV71冻干型荧光RT-PCR检测试剂对CA16和EV71核酸阳性参考品的检测结果及重复性。

图5：本发明的CA16和EV71冻干型荧光RT-PCR检测试剂对CA16核酸阳性参考品的扩增效率和不同浓度间的线性关系。

图6：本发明的CA16和EV71冻干型荧光RT-PCR检测试剂对EV71核酸阳性参考品的扩增效率和不同浓度间的线性关系。

具体实施方式

以下仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。

实施例1.本实施例提供一种用于检测CA16和EV71的荧光RT-PCR引物及探针的设计方案。

本发明通过分析公众基因序列数据库中的CA16和EV71核酸序列信息，选取了图1和图2所示的核酸序列分别作为CA16和EV71的检测目标序列。利用Primer Express V3.0软件设计出以下用于扩增目标序列的引物和用于检测目标序列的探针序列：

CA16的特异性正向引物的序列为SEQ ID No.1(Tm＝59.7℃)和SEQ ID No.2(Tm＝59.4℃),反向引物的序列为SEQ ID No.3(Tm＝59.7℃),探针的序列为SEQ ID No.4(Tm＝68.8℃)和SEQ ID No.5(Tm＝69.6℃)。探针的5’端用荧光报告基团FAM修饰，3’端用荧光淬灭基团BHQ1修饰。扩增子长度为96bp或98bp。CA16的引物、探针序列可有效区分与CA16高度同源的EV71的核酸序列，即具有良好特异性，有利于防止错检。引物和探针序列在已知CA16病毒株中高度保守，有利于防止漏检(图1)。

EV71的特异性正向引物的序列为SEQ ID No.6(Tm＝58.8℃)，反向引物的序列为SEQ ID No.7(Tm＝58.3℃)和SEQ ID No.8(Tm＝59.9℃)，探针的序列为SEQ ID No.9(Tm＝68.2℃)和SEQ ID No.10(Tm＝68.3℃)。探针的5’端用荧光报告基团JOE修饰，3’端用荧光淬灭基团BHQ2修饰。扩增子长度为119bp。EV71的引物、探针序列可有效区分与EV71高度同源的CA16的核酸序列，即具有良好特异性，有利于防止错检。引物和探针序列在已知EV71病毒株中高度保守，有利于防止漏检(图2)。

上述CA16和EV71的正向引物、反向引物和探针的GC含量均在合理范围内；引物之间的Tm差别微小，有利于引物的同时退火；探针的Tm比引物高8℃以上，差别足够大，有利于探针早于引物完成退火。引物和探针的自身结构均维持较好，不会形成稳定的self dimer、pair dimer和hair pin等降低反应效率的二级结构。较短的扩增子也有利于提高PCR反应效率。

上述的正向引物、反向引物、探针由华大基因合成，用TE缓冲液配成100uM的保存液和10uM的工作液于-20℃保存。

实施例2：本实施例演示通过真空冷冻干燥技术将本发明所述的CA16和EV71荧光RT-PCR检测试剂制成冻干型试剂。

按表1中所述的优选成分及含量配制CA16和EV71荧光RT-PCR液体检测试剂，按1份/管分装于200μl PCR八连管中后进行真空冷冻干燥，得到的CA16和EV71冻干型荧光RT-PCR检测试剂为白色颗粒(图3)。向一份试剂中加入23μl无核酸酶水，慢速震荡10s，试剂即完全溶解，用移液枪测得体积为25μl，可知试剂复溶前体积相当于2μl。为防止试剂受潮和曝光，CA16和EV71冻干型荧光RT-PCR检测试剂先和硅胶干燥剂一起作真空处理，再包装于铝箔袋中，在常温中保存。

实施例3：本实施例演示用本发明所述的CA16和EV71冻干型荧光RT-PCR检测试剂对CA16和EV71核酸阳性参考品的检测效果。

对CA16和EV71核酸阳性参考品混合液进行10倍梯度稀释，每个浓度取5μl和18μl无核酸酶水混合，然后加到1份按实施例2制备的CA16和EV71冻干型荧光RT-PCR检测试剂中；23μl无核酸酶水作为阴性对照。得到体积为25μl的反应混合液，慢速震荡溶解、离心后在荧光PCR仪上机检测，反应程序按表2设置。每个处理做3个重复。

检测结果如图4所示，本发明所述的CA16和EV71冻干型荧光RT-PCR检测试剂对不低于10个拷贝的CA16和EV71核酸阳性参考品的检测结果均显阳性，重复之间Ct的差异系数(CV)＜5％，阴性对照品没有扩增信号。模板浓度的常用对数及其Ct之间呈良好的线性关系(CA16和EV71相关系数均为-0.999)，CA16和EV71核酸的扩增效率分别为100.10％和99.56％(图5、6)。

可见，本发明的CA16和EV71冻干型荧光RT-PCR检测试剂对CA16和EV71核酸的检测表现良好，同时具有多项优点：(1)可常温保存，无传统液体试剂对保存温度(-20℃)的要求；(2)使用前无需解冻，完全避免了反复冻融对试剂活性的影响；(3)已按单份分装，使用时无需配液、分装步骤，减少了试剂损耗和试剂污染的风险。

序列表

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<213> artificial sequence

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