金合欢烯在制备植物源脲酶抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及脲酶抑制剂技术领域，特别是涉及金合欢烯在制备植物源脲酶抑制剂中的应用。

背景技术

尿素是氮肥最为常见的肥料品种，养分高且成本低，在农业生产中被广泛施用。但是尿素直接施用存在养分转化快、氮素利用率低的缺点，施入土壤中的尿素在脲酶的水解下快速生成铵态氮，只有30％～60％的氮被作物吸收利用，大量的尿素施用在造成经济和资源浪费的同时，也导致了土壤酸化板结、水体富营养化和大气污染等环境问题。20世纪60年代以来，世界各国围绕提高尿素利用率，开展了系列延缓尿素水解和养分转化的研究工作，研制了各种新型尿素。其中添加脲酶抑制剂的稳定性尿素可有效提高尿素氮肥利用率。脲酶抑制剂通过作用于脲酶和产脲酶生物来减缓土壤中尿素--酰胺态氮至氨态氮的水解，来调控尿素水解速率，进而降低后续氨挥发损失及经由硝化作用生成的硝酸盐浓度，进而减少硝酸盐淋溶损失以及N

目前已经确定的脲酶抑制剂主要有重金属离子类、金属配合物类、磷酰胺类、羟肟酸类等，然而以上的脲酶抑制剂多存在效果不稳定、毒性大、易降解等问题，因此难以在不同区域大面积推广应用，且长期施用可能会对环境带来污染，与人工化学合成的脲酶抑制剂相比，来源于植物的提取物是天然的化合物，对生态环境影响小，因此，筛选新型高效低毒的脲酶抑制剂可有助于农业的绿色发展。

发明内容

本发明的目的是提供金合欢烯在制备植物源脲酶抑制剂中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明通过研究发现，常被应用于皂用、洗涤剂香精和日化香精的制备和轮胎制造中的金合欢烯具有抑制脲酶活性的作用，为新型高效低毒的脲酶抑制剂的发展提供了一定的基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：金合欢烯在制备植物源脲酶抑制剂中的应用。

更进一步地，所述金合欢烯为枇杷叶提取物。

更进一步地，所述金合欢烯(分子式为C

进一步地，所述金合欢烯抑制的脲酶包括洋刀豆脲酶和土壤脲酶。

进一步地，所述金合欢烯的使用浓度为20～80μM。

进一步地，所述应用的方法包括：将金合欢烯添加到肥料中使用。

更进一步地，将所述的植物源脲酶抑制剂(金合欢烯)添加到尿素中，可以制备得到植物肥料。

金合欢烯可以有效减缓尿素水解速率，提高肥料氮素利用率，进而增加作物产量和减少环境污染。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明的植物源脲酶抑制剂以天然植物枇杷叶为原料制备得到，10μM浓度就可以实现对脲酶具有较强的抑制作用，低毒高效，对生态环境影响小。

(2)本发明制备得到的金合欢烯可以作为脲酶抑制剂应用，拓宽了金合欢烯的应用领域，丰富了植物肥料领域的脲酶抑制剂种类，将有助于解决现有抑制剂作用脲酶活性位点单一的问题，不同的脲酶抑制机理可提高脲酶抑制效果，且金合欢烯作为天然植物源脲酶抑制剂，不同于化学合成的商用脲酶抑制剂，具有绿色环保高效的特点，因此未来应用前景十分可观。

(3)本发明的脲酶抑制物质由于来源于植物，具有天然产物的“绿色”的特性，生物安全性高，且化学结构简单、稳定，脲酶抑制效果显著，可解决常规化学合成脲酶抑制剂毒性大、易降解、稳定性差的问题，同时为创建高效抑制农田尿素快速水解、提高尿素氮肥利用率的生物生态技术提供新思路，具有良好的应用价值与开发前景。

(4)本发明制备得到的金合欢烯可以有效抑制洋刀豆脲酶和土壤脲酶的活性，效果可与商用脲酶抑制剂乙酰氧肟酸相当。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同浓度的金合欢烯对洋刀豆脲酶活性的抑制效果图；

图2为不同浓度的乙酰氧肟酸对洋刀豆脲酶活性的抑制效果图；

图3为金合欢烯和乙酰氧肟酸对土壤脲酶活性的抑制效果图；

图4为不同浓度的金合欢烯对土壤产脲酶细菌的抑制效果图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

本发明通过研究发现枇杷叶提取物具有抑制脲酶的活性，经过鉴定确定该物质是金合欢烯，并测定了金合欢烯的脲酶抑制活性。

洋刀豆脲酶和脲酶抑制剂乙酰氧肟酸，均购自阿拉丁(aladdin)公司，均为分析纯；金合欢烯购自麦克林公司，纯度98％以上，为优级纯。

实施例1

无环倍半萜烯类化合物在制备植物源脲酶抑制剂中的应用：

(1)供试品溶液的配制

称取乙酰氧肟酸，用20mM的HEPES缓冲液(pH为7.5)配制成0.1μM、0.5μM、1μM、3μM、5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM的乙酰氧肟酸溶液，置于棕色瓶中存于4℃冰箱冷藏保存备用；

称取本发明实施例1制备的金合欢烯，用20mM的HEPES缓冲液(pH为7.5)配制成0.1μM、0.5μM、1μM、3μM、5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM的金合欢烯溶液，置于棕色瓶中存于4℃冰箱冷藏保存备用；

(2)洋刀豆脲酶溶液的配制

称取洋刀豆脲酶，溶于20mM的HEPES缓冲液(pH为7.5)中，配制成浓度为10U/mL的洋刀豆脲酶溶液，置于4℃冰箱中冷藏保存备用。

(3)尿素溶液的配制

称取尿素，溶解于20mM的HEPES缓冲液(pH为7.5)中，配制成浓度为150mM的尿素溶液，置于4℃冰箱中冷冻保存备用。

(4)Berthelot显色液的配制

A液：分别称取硝普钠和水杨酸钠粉末，溶解于20mM的HEPES缓冲液(pH为7.5)中，配制成含有9.73mM亚硝基铁氰化钠、700mM水杨酸钠的显色A液，置于4℃冰箱中冷藏保存备用。

B液：称取氢氧化钠9g，溶解于20mM的HEPES缓冲液(pH为7.5)中，放冷，加入12mL次氯酸钠，混匀，定容至50mL，置于4℃冰箱中冷冻保存备用。

(5)测定金合欢烯、乙酰氧肟酸对洋刀豆脲酶的抑制作用，结果见图1～2。

A.取50μL上述已配置不同浓度的金合欢烯溶液，分别加入100μL洋刀豆脲酶溶液混匀，置37℃孵育20min；加入100μL尿素溶液，室温条件下避光反应20min；加入Berthelot显色液A混匀，加入Berthelot显色液B，显色10min，得到孵育液；吸取250μL孵育液至96孔板上，利用酶标仪测定595nm下的OD绝对值，每个浓度平行做3次。空白样以各稀释液的溶剂(HEPES缓冲液)代替，其余操作同上，测得OD空白。根据公式1求得相应的OD相对值，根据公式2求得残余酶活性(Residual activity，RA)，并通过浓度-剩余酶活性曲线求得相应半数抑制浓度IC

公式1：OD相对值＝OD绝对值–OD空白值；

公式2：剩余酶活性(％)＝OD相对值(供试品)/OD相对值(空白)×100％。

B.方法同步骤A，区别在于，将金合欢烯溶液替换成乙酰氧肟酸溶液。

从图1和图2中可以看出，金合欢烯抑制洋刀豆脲酶活性的半数抑制浓度(IC

效果例2

测定金合欢烯、乙酰氧肟酸对土壤脲酶抑制效果，结果见图3。

(1)土壤预培养：将风干土(棕壤)过2mm筛后放入培养皿中，加入干土重量15％的蒸馏水，待水分浸透均匀，放入25℃的恒温培养箱中恒温预培养2周恢复其生物学活性，在此期间保持通气及水分恒定。

(2)称取预培养的土壤，分别加入金合欢烯和乙酰氧肟酸的DMSO溶液，使金合欢烯和乙酰氧肟酸的浓度均为50mg/kg(以干土计)，得到金合欢烯土壤混合物和乙酰氧肟酸土壤混合物。分别称取5g金合欢烯土壤混合物和乙酰氧肟酸土壤混合物置于玻璃试管(长15cm×直径15mm)中，然后分别向试管中加入5mL蒸馏水，使土壤处于液面以下，并用漩涡振荡器振荡，混匀；同时以未添加抑制剂的预培养土壤作为对照处理(CK)，一起放入25℃的恒温培养箱中恒温培养，在培养后的第1、7、14和28天(根据重量法每天补充水分，保持试管总重量不变)分别取样测定脲酶活性。

试剂配制：(1)pH6.7的柠檬酸盐缓冲液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。

(2)苯酚钠溶液：称62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，然后用乙醇稀释至100mL，此为A液，保存在冰箱中；称27g氢氧化钠溶于100mL水中，保存在冰箱中，此为B液。使用前，取A、B两液各20mL混合，并用蒸馏水稀释至100mL备用。

(3)次氯酸钠溶液：将次氯酸钠用水稀释10倍即为含活性氯为0.9％的溶液，溶液稳定。

(4)10％尿素液。

(5)甲苯。

(6)氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，则得1mL含0.1g氮的标准溶液。

标准曲线的绘制：吸取稀释的标准液1、3、5、7、9、11、13mL，分别移于50mL容量瓶中，然后加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液。随加随摇匀，20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲线。

具体测定方法为：分别随机挑取10g上述恒温培养的玻璃试管样品(5g样品和5mL水的混合样品)，将其转移至50mL三角瓶中，加1mL甲苯，15min后加10mL 10％的尿素溶液和20mL pH6.7的柠檬酸盐缓冲液，同时以10mL蒸馏水代替10mL尿素溶液作空白对照。摇匀后在37℃恒温箱中培养5h。过滤后取3mL滤液注入50mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。脲酶活性以单位时间内单位土壤水解的尿素量表示。每个处理重复3次，并设无底物处理作为对照。

脲酶活性计算公式如下：脲酶活性以5h后1g土壤中NH

NH

式中：a为从标准曲线上查得的NH

2000为换算成1kg土的系数。

从图3中可以看出，金合欢烯可以有效抑制土壤脲酶活性，抑制效果长达14天，且抑制效果与商用脲酶抑制剂乙酰氧肟酸相当，说明本发明所选金合欢烯具有可观的抑制脲酶能力。

效果例3

测定金合欢烯对土壤产脲酶细菌的抑制效果，结果见图4。

(1)土壤预培养：将风干土(棕壤)过2mm筛后放入培养皿中，加入干土重量15％的蒸馏水，待水分浸透均匀，放入25℃的恒温培养箱中恒温预培养2周恢复其生物学活性，在此期间保持通气及水分恒定，得到预培养的土壤。

(2)称取预培养的土壤，按照200mg N kg

产脲酶细菌可分泌脲酶到土壤中从而加速尿素水解，因此对产脲酶细菌丰度的有效调控可延缓尿素水解，进而减少后续氮转化过程中的氮素损失。从图4中细菌ureC基因拷贝数变化可以看出，尿素添加显著刺激了产脲酶细菌的生长，金合欢烯可以有效抑制产脲酶细菌的增殖，效果显著，抑制效果长达14天，且抑制效果随着金合欢烯的用量增大而增强，尤其是在尿素快速水解的前期可显著抑制产脲酶细菌的生长，这说明本发明所选金合欢烯具有可观的抑制产脲酶细菌能力，可作为高效植物源脲酶抑制剂在未来多领域的应用。

效果例4

金合欢烯与尿素配施对玉米生长的影响

盆栽试验所需土壤采自沈阳的棕壤。将13g氮磷钾肥按照26-10-12的比例作底肥全层施用，添加金合欢烯和不添加金合欢烯作为对照，施入量为肥料中纯氮含量的0.5％，1％和5％。供试氮肥为尿素，磷肥为过磷酸钙，钾肥为硫酸钾。每个处理设置5个重复。将相当于16kg风干土的预处理土壤(过5mm筛并剔除石块、根系等)，平铺在边长为2m的正方形厚塑料纸上，然后将所需的提前混匀的肥料和抑制剂(若需)均匀施入，然后采用对角折叠法进行多次折叠，期间还需平铺再折叠，最后让其与肥料和抑制剂充分混匀，然后将其转移到塑料盆(直径28cm，高34cm)中，最后进行灌溉并使其土壤含水量达到最大田间持水量的60％。最后，土表与盆的顶端保留有约5cm的高度。每盆播3粒玉米种子，播种深度5cm，出苗后(约15天)将其间苗为每盆一株玉米。最后将所有盆栽玉米抬到四轮平板车上，最终转移至网室。如有雨天，则将其转移到棚内。玉米生长期间每天人工浇水，保持其土壤水分。种植密度约为每亩4000株，于秋季测定玉米干物质重和产量。结果表明(表1)，肥料配施本发明材料金合欢烯可有效提高玉米干物质重和产量，配施纯氮量0.5％、1％和5％金合欢烯的处理较同等养分未加金合欢烯的对照处理分别提高干物质重4.1％、8.6％和10.2％，产量分别提高4.5％、10.1％和12.2％。

表1不同处理盆栽玉米的干物质重和产量

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。