等电聚焦样品基质

技术领域

本公开文本提供了增加PEG化蛋白质和肽的成像毛细管等电聚焦分析的分辨率的组合物和方法。

背景技术

PEG化是聚乙二醇(PEG)链与蛋白质或其他分子缀合的过程(Veronese和Mero(2008)BioDrugs 22:315-329)。PEG化已经被用作增强治疗性蛋白质的药代动力学特性(Holm等人(2015)PloS One 10(7):e0133584；Jevsevar等人(2010)Biotechnol.J.5:113-128；Harris和Chess(2003)Nat.Rev.Drug Discov.2:214-221)以及降低免疫原性和毒性(Nucci等人(1991)Advanced Drug Delivery Reviews 6:133-151；Veronese和Pasut(2005)Drug Discov.Today 10:1451-1458)的策略，增强的药代动力学特性以及降低的免疫原性和毒性为治疗相关蛋白质的有吸引力的属性。

PEG-蛋白质缀合可以通过化学反应或酶促反应(Basle等人(2010)Chemistry&Biology 17:213-227；O'Hare等人(2007)Current Opinion in Structural Biology 17:488-494)，以及通过半合成方法如表达蛋白连接(Muir(2003)Annual Review ofBiochemistry72:249-289)形成。可替代地，已经将非天然氨基酸作为化学处理物掺入重组蛋白中用于缀合聚乙二醇(Liu和Schultz(2010)Annual Review of Biochemistry 79:413-444)。

成像毛细管等电聚焦(icIEF)是当前用于确定蛋白质等电点(pI)以及电荷种类相对定量的行业标准(Sosic等人(2008)Electrophoresis 29:4368-4376；Cousteils等人(2019)Chromatography Today,2月26日)。然而，PEG化蛋白质的icIEF分离是有难度的。在PEG化蛋白质的icIEF分离中观察到相对较宽且扭曲的峰形。PEG化蛋白质的电荷变体在等电聚焦期间合并成一个宽峰，很可能是由于蛋白质被包围的聚乙二醇链掩蔽以及流体力学体积增加(Molineux(2002)Cancer Treat Rev.28:13-16)。改变例如载体两性电解质含量、甲基纤维素浓度、蛋白质浓度、聚焦时间以及添加其他添加剂不能产生合理的峰形(Li等人(2007)Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 43:963-972)。

因此，需要允许区分PEG化蛋白质的电荷变体的新的icIEF方法。

发明内容

本公开文本提供了一种成像毛细管等电聚焦(icIEF)样品基质，所述icIEF样品基质包含甘氨酸和/或牛磺酸。在一些方面，甘氨酸的浓度在约1mM与约200mM之间。

在所述icIEF样品基质的一些方面，甘氨酸的浓度在约1mM与约150mM、约1mM与约100mM、约1mM与约90mM、约1mM与约80mM、约1mM与约70mM、约1mM与约60mM、约1mM与约50mM、约1mM与约40mM、约10mM与约200mM、约10mM与约150mM、约10mM与约100mM、约10mM与约90mM、约10mM与约80mM、约10mM与约70mM、约10mM与约60mM、约10mM与约50mM、约10mM与约40mM、约20mM与约200mM、约20mM与约150mM、约20mM与约100mM、约20mM与约90mM、约20mM与约80mM、约20mM与约70mM、约20mM与约60mM、约20mM与约50mM、约20mM与约40mM、约30mM与约200mM、约30mM与约150mM、约30mM与约100mM、约30mM与约90mM、约30mM与约80mM、约30mM与约70mM、约30mM与约60mM、约30mM与约50mM、约30mM与约40mM、约40mM与约200mM、约40mM与约150mM、约40mM与约100mM、约40mM与约90mM、约40mM与约80mM、约40mM与约70mM、约40mM与约60mM或约40mM与约50mM之间。

在所述icIEF样品基质的一些方面，甘氨酸的浓度为约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM或约120mM。在一些方面，甘氨酸的浓度在约30mM与约50mM之间。在一些方面，甘氨酸的浓度在约36mM与约44mM之间。在一些方面，甘氨酸的浓度为约40mM。

在所述icIEF样品基质的一些方面，牛磺酸的浓度在1mM与200mM之间。在一些方面，牛磺酸的浓度在约1mM与约150mM、约1mM与约100mM、约1mM与约90mM、约1mM与约80mM、约1mM与约70mM、约1mM与约60mM、约1mM与约50mM、约1mM与约40mM、约10mM与约200mM、约10mM与约150mM、约10mM与约100mM、约10mM与约90mM、约10mM与约80mM、约10mM与约70mM、约10mM与约60mM、约10mM与约50mM、约10mM与约40mM、约20mM与约200mM、约20mM与约150mM、约20mM与约100mM、约20mM与约90mM、约20mM与约80mM、约20mM与约70mM、约20mM与约60mM、约20mM与约50mM、约20mM与约40mM、约30mM与约200mM、约30mM与约150mM、约30mM与约100mM、约30mM与约90mM、约30mM与约80mM、约30mM与约70mM、约30mM与约60mM、约30mM与约50mM、约30mM与约40mM、约40mM与约200mM、约40mM与约150mM、约40mM与约100mM、约40mM与约90mM、约40mM与约80mM、约40mM与约70mM、约40mM与约60mM或约40mM与约50mM之间。

在所述icIEF样品基质的一些方面，牛磺酸的浓度为约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM或约120mM。在一些方面，牛磺酸的浓度在约40mM与约60mM之间。在一些方面，牛磺酸的浓度在约45mM与约55mM之间。在一些方面，牛磺酸的浓度为约50mM。

在一些方面，所述icIEF样品基质进一步包含载体两性电解质。在一些方面，所述载体两性电解质是

在一些方面，所述icIEF样品基质进一步包含甲基纤维素。在一些方面，甲基纤维素的浓度为约0.35％(w:v)。在一些方面，所述icIEF样品基质包含约40mM甘氨酸和约50mM牛磺酸。在一些方面，所述icIEF样品基质包含约4％(v:v)

本公开文本还提供了一种降低基质导致的基线干扰的方法，所述方法包括在icIEF期间使用本文公开的icIEF样品基质。在一些方面，所述干扰是碱性区域干扰。在一些方面，所述基线干扰相比于在使用不含牛磺酸的参考样品基质时观察到的基线干扰降低。在一些方面，所述不含牛磺酸的参考样品基质是含有尿素的基质。

本公开文本还提供了一种测量PEG化蛋白质的等电点(pI)的方法，所述方法包括对包含本文公开的icIEF样品基质和PEG化蛋白质的样品进行icIEF。本公开文本还提供了一种增强icIEF中PEG化蛋白质的共迁移峰的分离的方法，所述方法包括对包含本文公开的icIEF样品基质和PEG化蛋白质的样品进行icIEF。在一些方面，所述PEG化蛋白质的浓度在约0.25mg/mL与约0.75mg/mL之间。在一些方面，所述PEG化蛋白质的浓度为约0.5mg/mL。

在本文公开的方法的一些方面，所述icIEF包括(i)施加第一电压持续第一预定时间段，使得所述载体两性电解质在毛细管内形成pH梯度；以及(ii)施加第二电压持续第二预定时间段以在所述毛细管内聚焦所述蛋白质的电荷变体的迁移，使得所述变体的总电荷是中性的。在一些方面，所述第一电压为约1500V，并且所述第一预定时间段为约1分钟。在一些方面，所述第二电压为约3000V，并且所述第二预定时间段为约8分钟。

本公开文本还提供了一种确定PEG化蛋白质的稳定性的方法，所述方法包括使用本文公开的icIEF样品基质。在一些方面，所述稳定性是热稳定性。在一些方面，在37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃下孵育所述PEG化蛋白质后确定所述热稳定性。在一些方面，将所述PEG化蛋白质孵育1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天。在一些方面，确定所述稳定性是定量的。

附图说明

图1示出了PEG化蛋白质A在有2M尿素情况下的电泳图。一条30kDa的单链线性甲氧基聚乙二醇链经由非天然氨基酸与蛋白质A缀合。样品基质含有4％(v:v)

图2示出了

图3示出了PEG化蛋白质A的电泳图叠加，其中将含甘氨酸作为唯一添加剂的样品基质与包含甘氨酸和牛磺酸两者作为添加剂的样品基质进行了比较。样品基质含有4％(v:v)

图4示出了包含甘氨酸和牛磺酸作为添加剂的样品基质中PEG化蛋白质A的电泳图。样品基质含有4％(v:v)

图5示出了在设定为10℃的自动进样器中于0小时和24小时包含甘氨酸和牛磺酸的样品基质中PEG化蛋白质A的电泳图。样品基质含有4％(v:v)

图6示出了JMP合意度剖析图。表4中列出的

图7示出了与包含尿素作为添加剂的样品基质相比，包含甘氨酸和牛磺酸作为添加剂的样品基质中PEG化抗体B的电泳图。样品基质含有4％(v:v)

图8示出了(i)对照PEG化蛋白质A样品和(ii)已经在40℃下强制降解7天的PEG化蛋白质A样品的电泳图。样品基质含有4％(v:v)

图9示出了(i)对照PEG化蛋白质A样品和(ii)已经掺有通过AEX HPLC收集的天冬酰胺脱酰胺的PEG化蛋白质A(图8中约pH 5.25处的峰)的PEG化蛋白质A样品的电泳图。样品基质含有4％(v:v)

具体实施方式

制药工业已经将PEG化用作增强治疗性蛋白质的药代动力学特性的策略。成像毛细管等电聚焦(icIEF)是当前用于蛋白质和抗体的等电点(pI)确定和电荷变体定量的行业标准技术。然而，分辨与PEG化蛋白质的电荷变体相对应的离散峰仍然具有挑战性。本公开文本提供了包含添加剂甘氨酸和牛磺酸的组合的新型样品基质配方，其显著改善了PEG化蛋白质中电荷变体的分离。因此，不再需要在PEG化之前对蛋白质进行等电聚焦，这并不反映PEG化和纯化过程引起的变化。因此，本文公开的样品基质使得能够对处于其实际缀合状态下的PEG化蛋白质进行icIEF分析。

本公开文本的样品基质能够包括甘氨酸，其使得能够分离共迁移的PEG化蛋白质电荷变体。样品基质还可以包括牛磺酸，一种通常用于蛋白质制剂的非必需氨基酸(Brosnan和Brosnan(2006)J Nutr.136:1636-1640；Amino Acids:Chemistry,Biology andMedicine.Lubec和Rosenthal编辑Springer Science&Business Media,2012)，其通过消除基质导致的基线干扰进一步改进icIEF测定。因此，本公开文本的包括甘氨酸和牛磺酸的组合的样品基质使得能够对PEG化蛋白质的酸性种类和碱性种类与主峰进行icIEF分离，允许对离散的PEG化蛋白质种类进行鉴定/分离、表征和定量。通过使用本公开文本的样品基质经由icIEF来表征PEG化蛋白质，实现了可重复性、线性、准确性、样品稳定性和方法稳健性。

在更详细地描述本公开文本之前，应理解本公开文本不限于所描述的特定组合物或方法步骤，因此当然可以变化。在阅读本公开文本之后，如对于本领域技术人员将清楚的是，本文描述和说明的单独方面中的每一个具有离散的组成部分和特征，所述组成部分和特征可以在不脱离本发明的范围或精神的情况下容易地与任何其他若干方面的特征分离或组合。可以按所叙述的事件的顺序或按逻辑上可能的任何其他顺序来执行所叙述的任何方法。

本文提供的标题不是对本公开文本的各个方面的限制，所述各个方面可以通过参考说明书作为整体而定义。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定方面的目的，并不旨在是限制性的，因为本公开文本的范围将仅由所附权利要求限定。

术语

为了可以更容易地理解本公开文本，首先定义某些术语。如本申请所用，除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一个应当具有下文所阐述的含义。另外的定义贯穿本申请进行阐述。

本公开文本包括这样的方面，其中组中恰有一个成员存在于、被用于或以其他方式关联于给定的产品或过程。本公开文本包括这样的方面，其中多于一个或所有组成员存在于、被用于或以其他方式关联于给定的产品或过程。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本公开文本所涉及领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。例如，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；TheDictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；以及OxfordDictionary of Biochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,OxfordUniversity Press为技术人员提供了本公开文本所用的许多术语的通用词典。

单位、前缀和符号以其国际单位制(SI)认可的形式表示。数值范围包括定义所述范围的数字。本文提供的标题不是对本公开文本的各个方面的限制，所述各个方面可以通过参考说明书作为整体而获得。因此，通过从整体上参考说明书，更全面地定义下文紧接着定义的术语。

除非上下文另外清楚地规定，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”以及“所述(the)”包括复数指示物。术语“一个/一种(a)”(或“一个/一种(an)”)以及术语“一个或多个/一种或多种(one or more)”和“至少一个/至少一种(at least one)”可以在本文中可互换地使用。在某些方面，术语“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”意指“单个/单一(single)”。在一些方面，术语“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”包括“两个或更多个/两种或更多种(two or more)”或“多个/多种(multiple)”。例如，提及一种载体两性电解质涵盖单一载体两性电解质混合物或其组合。

如本文所用的术语“约”是指在如通过本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，所述可接受误差范围将部分取决于如何测量或确定所述值或组成，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在1个或多于1个标准差内。可替代地，“约”可以意指高达20％的范围。

当在本申请和权利要求中提供特定值或组成时，除非另外陈述，否则应当假定“约”的含义在该特定值或组成的可接受误差范围内。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展所阐述数值上下的边界来修饰该范围。因此，“约10-20”意指“约10至约20”。通常，术语“约”可以向上或向下(较高或较低)以例如10％的差异修饰高于和低于所陈述值的数值。

在本文中使用的情况下，将“和/或”视为对两个指定特征或组成部分中的每一个与或不与另一个的具体公开。因此，如在本文中以短语如“A和/或B”使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，如以短语如“A、B和/或C”使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

如本文所用，如应用于一个或多个目的值的术语“大约”是指类似于所陈述参考值的值。在某些方面，除非另外陈述或上下文另有明确含义，否则术语“大约”是指落在所陈述参考值的任一方向(大于或小于)上的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的一系列值(这个数字超过可能值的100％的情况除外)。

应理解，无论在哪里在本文中用语言“包括/包含(comprising)”描述方面，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”措辞描述的在其他方面类似的方面。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指代任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以包含经修饰的氨基酸。所述术语还涵盖已经天然修饰的或通过干预修饰的氨基酸聚合物；所述修饰是例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。所述定义内还包括例如含有氨基酸的一种或多种类似物(包括例如非天然氨基酸，如高半胱氨酸、鸟氨酸、对乙酰基苯丙氨酸、D-氨基酸和肌酸)以及本领域已知的其他修饰的多肽。在本公开文本的一个特定方面，多肽是PEG化多肽。

如本文所用，所述术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同系物、直系同源物、旁系同源物、片段以及前述项的其他等效物、变体和类似物。多肽可以是单一多肽，或者可以是多分子复合物，如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包含单链或多链多肽。在多链多肽中发现最常见的二硫键。术语多肽也可以应用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。在一些方面，“肽”可以具有小于或等于50个氨基酸的长度，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸的长度。

在本公开文本的一个特定方面，多肽已经被衍生化，例如化学衍生化，以掺入能够增强多肽特性(例如，血浆半衰期)的水溶性聚合物。在一些方面，多肽是PEG化的，即它包含至少一个与多肽链共价连接的PEG。

如本文所述，除非另外指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所叙述范围内的任何整数的值以及在适当时所述值的分数(如整数的十分之一和百分之一)。

“重组”多肽或蛋白质是指经由重组DNA技术产生的多肽或蛋白质。出于本公开文本的目的，将在工程化宿主细胞(例如，CHO细胞)中表达的重组产生的多肽和蛋白质视为是分离的，已经通过任何合适的技术分离、分级或者部分或基本上纯化的天然或重组多肽亦是如此。在本公开文本的一些方面，重组多肽可以是抗体。本文公开的抗体(例如，“抗体B”)可以使用本领域已知的方法重组产生。本文公开的蛋白质(例如，“蛋白质A”或“抗体B”)也可以化学合成。

icIEF样品基质和使用方法

本公开文本提供了用于等电聚焦(例如，毛细管等电聚焦(cIEF)或成像毛细管等电聚焦(icIEF))的样品基质，其能够有效地将用聚合亲水部分衍生化的蛋白质或肽(例如，PEG化蛋白质)的酸性种类和碱性种类与主峰分离。

等电聚焦是一种通过其等电点(pI)的差异来分离分子的技术，等电点即分子具有净零电荷的pH。icIEF涉及使用两性电解质(两性的电解质)溶液在施加分离电压的分离通道(即，连接正极和负极的流体通道，例如毛细管)内产生pH梯度。带负电的分子通过介质中的pH梯度向正极迁移，而带正电的分子向负极移动。在低于其等电点(pI)的pH区域中的分析物(例如，蛋白质或其他分子)将带正电，因此将向阴极(即，带负电的电极)迁移。蛋白质的总净电荷将随着它通过逐渐增加的pH梯度迁移而减少(例如，由于羧基或其他带负电的官能团的质子化)，直到它到达与其pI相对应的pH区域，在此点它没有净电荷，因此迁移停止。相反，在高于其等电点(pI)的pH区域中的分析物将带负电，因此将向阳极(即，带正电的电极)迁移。因此，由于酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基、N末端和C末端电荷或存在于与分析物连接的异源部分(例如，PEG化蛋白质中的PEG)中的其他电荷，分析物(例如，蛋白质)的混合物基于其相对电荷含量而分离。在icIEF运行结束时，分析物中的不同种类会聚焦成清晰的固定条带，其中每种分析物种类(例如，PEG化蛋白质的电荷变体)位于pH梯度中与其pI相对应的点。所述技术能够提供极高的分辨率，即能够区分相差单个电荷的蛋白质，这些蛋白质被分成单独的条带。cIEF比凝胶IEF快得多，但是在推峰时分离的分辨率可能受损。成像cIEF(icIEF)仪器和盒采用全柱成像检测(WCID)技术，其允许对cIEF过程进行实时成像。因此，icIEF分离不需要动员，因此当与采用单点检测的传统cIEF相比时，样品分析更快且更精确。进行cIEF的一般方法例如由Kilar,F.,"Isoelectric Focusing inCapillaries,"CRC Handbook on Capillary Electrophoresis:A Practical Approach,CRC Press,Inc.,第4章,第95-109页(1994)；以及Schwartz,H.和T.Pritchett,"Separation of Proteins and Peptides by Capillary Electrophoresis:Applicationto Analytical Biotechnology,"第266923部分(Beckman-Coulter,Fullerton,Calif.,1994)；Wehr,T.,Rodriquez-Diaz,R.和Zhu,M.,"Capillary Electrophoresis ofProteins,"(Marcel Dekker,NY,1999)描述，将这些文献通过引用以其整体并入本文。

本公开文本提供了成像毛细管等电聚焦(icIEF)样品基质，所述icIEF样品基质包含甘氨酸和/或牛磺酸。如本文所用，术语“icIEF样品基质”和“样品基质”可互换地用于指代在对混合物进行icIEF之前可以与分析物(例如，PEG化蛋白质)混合的试剂的组合。用于icIEF的样品基质包含两性电解质和一种或多种添加剂。例如，样品基质可以包含降低电渗流、允许更好的蛋白质溶解并通过增加电解质粘度来限制流体通道的毛细管内的扩散的添加剂，例如甲基纤维素或甘油。样品基质还可以包含减少蛋白质聚集、溶解样品基质中的蛋白质并因此提高测定可重复性的稳定添加剂，如尿素、甲酰胺或蔗糖。此外，样品基质可以包含pI参考标准品。

在一些方面，本文公开的icIEF样品基质含有浓度在约1mM与约200mM之间的甘氨酸。在一些方面，甘氨酸的浓度在约1mM与约150mM、约1mM与约100mM、约1mM与约90mM、约1mM与约80mM、约1mM与约70mM、约1mM与约60mM、约1mM与约50mM、约1mM与约40mM、约10mM与约200mM、约10mM与约150mM、约10mM与约100mM、约10mM与约90mM、约10mM与约80mM、约10mM与约70mM、约10mM与约60mM、约10mM与约50mM、约10mM与约40mM、约20mM与约200mM、约20mM与约150mM、约20mM与约100mM、约20mM与约90mM、约20mM与约80mM、约20mM与约70mM、约20mM与约60mM、约20mM与约50mM、约20mM与约40mM、约30mM与约200mM、约30mM与约150mM、约30mM与约100mM、约30mM与约90mM、约30mM与约80mM、约30mM与约70mM、约30mM与约60mM、约30mM与约50mM、约30mM与约40mM、约40mM与约200mM、约40mM与约150mM、约40mM与约100mM、约40mM与约90mM、约40mM与约80mM、约40mM与约70mM、约40mM与约60mM或约40mM与约50mM之间。

在icIEF样品基质的一些方面，甘氨酸的浓度为约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、约100mM、约105mM、约110mM、约115mM或约120mM。在一些方面，甘氨酸的浓度在约30mM与约50mM之间。在一些方面，甘氨酸的浓度在约36mM与约44mM之间。在一些方面，甘氨酸的浓度为约40mM。通常，可以根据例如所使用的仪器的具体特征、所使用的毛细管的类型或所使用的蛋白质样品来调整甘氨酸的浓度，以实现蛋白质电荷变体(例如，不同PEG化蛋白质电荷变体)之间的最佳分离。

在icIEF样品基质的一些方面，牛磺酸的浓度在约1mM与约200mM之间。在一些方面，牛磺酸的浓度在约1mM与约150mM、约1mM与约100mM、约1mM与约90mM、约1mM与约80mM、约1mM与约70mM、约1mM与约60mM、约1mM与约50mM、约1mM与约40mM、约10mM与约200mM、约10mM与约150mM、约10mM与约100mM、约10mM与约90mM、约10mM与约80mM、约10mM与约70mM、约10mM与约60mM、约10mM与约50mM、约10mM与约40mM、约20mM与约200mM、约20mM与约150mM、约20mM与约100mM、约20mM与约90mM、约20mM与约80mM、约20mM与约70mM、约20mM与约60mM、约20mM与约50mM、约20mM与约40mM、约30mM与约200mM、约30mM与约150mM、约30mM与约100mM、约30mM与约90mM、约30mM与约80mM、约30mM与约70mM、约30mM与约60mM、约30mM与约50mM、约30mM与约40mM、约40mM与约200mM、约40mM与约150mM、约40mM与约100mM、约40mM与约90mM、约40mM与约80mM、约40mM与约70mM、约40mM与约60mM或约40mM与约50mM之间。

在icIEF样品基质的一些方面，牛磺酸的浓度为约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、约100mM、约105mM、约110mM、约115mM或约120mM。在一些方面，牛磺酸的浓度在约40mM与约60mM之间。在一些方面，牛磺酸的浓度在约45mM与约55mM之间。在一些方面，牛磺酸的浓度为约50mM。通常，可以根据例如所使用的仪器的具体特征、所使用的毛细管的类型或所使用的蛋白质样品来调整牛磺酸的浓度，以实现样品基质导致的基线干扰(例如，由于样品基质中存在甘氨酸而导致的基线干扰)的最佳消除或降低。

在一些方面，icIEF样品基质包含甘氨酸和牛磺酸两者。在一些方面，icIEF样品基质包含(i)浓度在约1mM与约200mM之间的甘氨酸，和(ii)浓度在约1mM与约200mM之间的牛磺酸。

在一些方面，icIEF样品基质包含(i)浓度在约1mM与约150mM、约1mM与约100mM、约1mM与约90mM、约1mM与约80mM、约1mM与约70mM、约1mM与约60mM、约1mM与约50mM、约1mM与约40mM、约10mM与约200mM、约10mM与约150mM、约10mM与约100mM、约10mM与约90mM、约10mM与约80mM、约10mM与约70mM、约10mM与约60mM、约10mM与约50mM、约10mM与约40mM、约20mM与约200mM、约20mM与约150mM、约20mM与约100mM、约20mM与约90mM、约20mM与约80mM、约20mM与约70mM、约20mM与约60mM、约20mM与约50mM、约20mM与约40mM、约30mM与约200mM、约30mM与约150mM、约30mM与约100mM、约30mM与约90mM、约30mM与约80mM、约30mM与约70mM、约30mM与约60mM、约30mM与约50mM、约30mM与约40mM、约40mM与约200mM、约40mM与约150mM、约40mM与约100mM、约40mM与约90mM、约40mM与约80mM、约40mM与约70mM、约40mM与约60mM或约40mM与约50mM之间的甘氨酸，和(ii)浓度在约1mM与约150mM、约1mM与约100mM、约1mM与约90mM、约1mM与约80mM、约1mM与约70mM、约1mM与约60mM、约1mM与约50mM、约1mM与约40mM、约10mM与约200mM、约10mM与约150mM、约10mM与约100mM、约10mM与约90mM、约10mM与约80mM、约10mM与约70mM、约10mM与约60mM、约10mM与约50mM、约10mM与约40mM、约20mM与约200mM、约20mM与约150mM、约20mM与约100mM、约20mM与约90mM、约20mM与约80mM、约20mM与约70mM、约20mM与约60mM、约20mM与约50mM、约20mM与约40mM、约30mM与约200mM、约30mM与约150mM、约30mM与约100mM、约30mM与约90mM、约30mM与约80mM、约30mM与约70mM、约30mM与约60mM、约30mM与约50mM、约30mM与约40mM、约40mM与约200mM、约40mM与约150mM、约40mM与约100mM、约40mM与约90mM、约40mM与约80mM、约40mM与约70mM、约40mM与约60mM或约40mM与约50mM之间的牛磺酸。

在一些方面，icIEF样品基质包含(i)浓度为约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、约100mM、约105mM、约110mM、约115mM或约120mM的甘氨酸，和(ii)浓度为约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、约100mM、约105mM、约110mM、约115mM或约120mM的牛磺酸。

在一些方面，icIEF样品基质包含(i)浓度在约30mM与约50mM之间的甘氨酸，和(ii)浓度在约40mM与约60mM之间的牛磺酸。在一些方面，icIEF样品基质包含(i)浓度在约36mM与约44mM之间的甘氨酸，和(ii)浓度在约45mM与约55mM之间的牛磺酸。在一些方面，icIEF样品基质包含(i)浓度为约40mM的甘氨酸，和(ii)浓度为约50mM的牛磺酸。

在一些方面，icIEF样品基质包含(i)可以实现蛋白质电荷变体(例如，PEG化蛋白质电荷变体)之间的最佳分离的浓度的甘氨酸，和(ii)可以实现样品基质导致的基线干扰(例如，由于样品基质中存在甘氨酸而导致的基线干扰)的最佳消除或降低的浓度的牛磺酸。

在一些方面，icIEF样品基质进一步包含载体两性电解质。术语“载体两性电解质”和“两性电解质”可互换地使用，并且是指含有酸性基团和碱性基团两者并在一定的pH值范围内将主要以两性离子存在的两性分子。使用两性电解质来建立稳定的pH梯度，用于等电聚焦技术，例如icIEF。在施加电场的情况下，载体两性电解质分配成从阳极到阴极线性增加的平滑的pH梯度。将平均电荷为零时的pH称为分子的等电点(pI)。在一些方面，载体两性电解质包含小分子(例如，约300-1,000Da)的混合物，所述小分子含有多个具有紧密间隔的pI值和良好缓冲能力的脂族氨基和羧酸基团。在一些方面，两性电解质包括具有高的每pH单位缓冲容量、线性pH梯度、甚至跨两性电解质的电导率。

许多不同的两性电解质可以用于产生pH梯度，包括许多市售的两性电解质溶液。两性电解质和两性电解质梯度的宽度的选择可能影响icIEF实现的分辨率。例如，窄的两性电解质梯度增加分离中的理论塔板数，并且可以有益于在窄的pI范围内进行更高分辨率的分离。

本领域技术人员已知的各种两性电解质中的任一种都可以用于所公开的组合物和方法，包括但不限于磷酸/氢氧化钠、谷氨酸/赖氨酸、甲酸/二甲胺或商业载体两性电解质混合物。

四类市售载体两性电解质通常用于icIEF：

目前几乎所有的cIEF检测都是使用UV检测在280nm处进行的。对于cIEF，通常使用在线UV检测。对于icIEF，使用CCD摄像机进行实时监测。当希望使用具有低背景UV吸收的载体两性电解质时尤其使用

在一些方面，载体两性电解质包括一种或多种

本领域普通技术人员将理解特定载体两性电解质的选择可以通过分析物的电荷和例如使用例如凝胶IEF获得的初步数据来确定。因此，例如使用任何IEF技术确定的pI为大约6的蛋白质(其随后已经用某种PEG衍生化)可以使用icIEF和载体两性电解质(例如，

在一些具体方面，本文公开的样品基质可以包含覆盖宽pH范围的载体两性电解质，这将适用于大多数分离，那些涉及高酸性或高碱性分析物(例如，高酸性或高碱性蛋白质)的分离除外。因此，在一些方面，本公开文本的样品基质包含覆盖例如pH 2至pH 11(例如，

在一些方面，载体两性电解质(或其组合)的浓度为约1％(v:v)至约10％(v:v)。在一些方面，载体两性电解质(或其组合)的浓度在1％(v:v)与约2％(v:v)之间、在约2％(v:v)与约3％(v:v)之间、在约3％(v:v)与约4％(v:v)之间、在约4％(v:v)与约5％(v:v)之间、在约5％(v:v)与约6％(v:v)之间、在约6％(v:v)与约7％(v:v)之间、在约7％(v:v)与约8％(v:v)之间、在约8％(v:v)与约9％(v:v)之间或在约9％(v:v)与约10％(v:v)之间。在一些方面，载体两性电解质(或其组合)的浓度为约2％(v:v)至约9％(v:v)。在一些方面，载体两性电解质(或其组合)的浓度为约3％(v:v)至约8％(v:v)。在一些方面，载体两性电解质(或其组合)的浓度为约2％(v:v)至约7％(v:v)。在一些方面，载体两性电解质(或其组合)的浓度为约3％(v:v)至约6％(v:v)。在一些方面，载体两性电解质(或其组合)的浓度为约2％(v:v)至约5％(v:v)。在一些方面，载体两性电解质(或其组合)的浓度为约3％(v:v)至约5％(v:v)。在一些方面，载体两性电解质的浓度为约1％(v:v)、约2％(v:v)、约3％(v:v)、约4％(v:v)、约5％(v:v)、约6％(v:v)、约7％(v:v)、约8％(v:v)、约9％(v:v)或约10％(v:v)。在一些方面，载体两性电解质的浓度为约3.6％(v:v)至4.4％(v:v)。在一些方面，载体两性电解质的浓度为约3.6％(v:v)、约3.7％(v:v)、约3.8％(v:v)、约3.9％(v:v)、约4％(v:v)、约4.1％(v:v)、约4.2％(v:v)、约4.3％(v:v)或约4.4％(v:v)。在一些方面，载体两性电解质的浓度为约4％(v:v)。

在一些方面，icIEF样品基质进一步包含增加其粘度的化合物，例如甲基纤维素或其衍生物(例如，羟丙基甲基纤维素)。任选地，通过使用毛细管涂层(例如，在icIEF毛细管表面上的丙烯酰胺衍生物涂层)可以避免在样品基质中使用增加粘度的化合物(如甲基纤维素)。

在一些方面，本文公开的icIEF样品基质包含浓度在约0.01％(w:v)与约1％(w:v)之间的甲基纤维素。在一些方面，甲基纤维素的浓度为约0.01％(w:v)、约0.05％(w:v)、约0.1％(w:v)、约0.15％(w:v)、约0.2％(w:v)、约0.25％(w:v)、约0.3％(w:v)、约0.35％(w:v)、约0.4％(w:v)、约0.45％(w:v)、约0.5％(w:v)、约0.6％(w:v)、约0.7％(w:v)、约0.8％(w:v)、约0.9％(w:v)或约1％(w:v)。在一些方面，甲基纤维素的浓度在约0.01(w:v)与约0.1％(w:v)之间、在约0.1％(w:v)与约0.2％(w:v)之间、在约0.2％(w:v)与约0.3％(w:v)之间、在约0.3％(w:v)与约0.4％(w:v)之间、在约0.4％(w:v)与约0.5％(w:v)之间、在约0.5％(w:v)与约0.6％(w:v)之间、在约0.6％(w:v)与约0.7％(w:v)之间、在约0.7％(w:v)与约0.8％(w:v)之间、在约0.8％(w:v)与约0.9％(w:v)之间或在约0.9％(w:v)与约1％(w:v)之间。在一些具体方面，甲基纤维素的浓度为约0.35％(w:v)。

在一些方面，icIEF样品基质包含至少一种

在一些方面，icIEF样品基质包含约4％(v:v)

在一些方面，本公开文本的icIEF样品基质可以掺有一种或多种已知的pI标准品以评估分离的表现。因此，本文公开的任何icIEF样品基质都可以包含一系列pI标准品。本领域已知的各种pI标准品中的任一种都可以用于所公开的用于计算分离的分析物峰的等电点的方法和装置，前提是它们可以使用适当的成像技术可视化。通常，在icIEF应用中使用两种类型的pI标志物：蛋白质pI标志物和合成小分子pI标志物。蛋白质pI标志物基于具有公认的pI值的特定蛋白质。它们通常要求采用严格的储存条件，可以表现出较差的稳定性，因此可能在CIEF中产生多个峰。合成小分子(优选非肽分子，以便它们可以用于酶分离)在储存期间通常更稳定，并且将在icIEF中聚焦到单个峰。有各种蛋白质pI标志物或合成小分子pI标志物可用，例如可从Advanced Electrophoresis Solutions,Ltd.(加拿大安大略省剑桥市)获得的小分子pI标志物。

在一些方面，对包含本文公开的icIEF样品基质和分析物(或多于一种分析物)的混合物进行icIEF。在一些方面，分析物包括包含水溶性聚合部分的蛋白质、肽或药物-蛋白质缀合物，所述水溶性聚合部分例如聚乙二醇(PEG)；聚甘油(PG)；聚(丙二醇)(PPG)；C

因此，在一些方面，本公开文本还提供了包含本文公开的icIEF样品基质和本文公开的分析物(例如，PEG化蛋白质或肽)的组合物。PPG的毒性低于PEG，因此目前许多生物制品都是用PPG代替PEG生产的。

在一些方面，PEG由式R

其中n是1至1000。在一些方面，式I的-O-H基团可以被-O-CH

在一些方面，n的值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、189、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200。

在一些方面，n为至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约110、至少120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220、至少约230、至少约240、至少约250、至少约260、至少约270、至少约280、至少约290、至少约300、至少约310、至少约320、至少约330、至少约340、至少约350、至少约360、至少约370、至少约380、至少约390、至少约400、至少约410、至少约420、至少约430、至少约440、至少约450、至少约460、至少约470、至少约480、至少约490、至少约500、至少约510、至少约520、至少约530、至少约540、至少约550、至少约560、至少约670、至少约580、至少约590、至少约600、至少约610、至少约620、至少约630、至少约640、至少约650、至少约660、至少约670、至少约680、至少约690、至少约700、至少约710、至少约720、至少约730、至少约740、至少约750、至少约760、至少约770、至少约780、至少约790、至少约800、至少约810、至少约820、至少约830、至少约840、至少约850、至少约860、至少约870、至少约880、至少约890、至少约900、至少约910、至少约920、至少约930、至少约940、至少约950、至少约960、至少约970、至少约980、至少约990或约1000。

在一些方面，n在约50与约100之间、在约100与约150之间、在约150与约200之间、在约200与约250之间、在约250与约300之间、在约300与约350之间、在约350与约400之间、在约400与约450之间、在约450与约500之间、在约500与约550之间、在约550与约600之间、在约600与约650之间、在约650与约700之间、在约700与约750之间、在约750与约800之间、在约800与约850之间、在约850与约900之间、在约900与约950之间或在约95o与约1000之间。

在一些方面，n为至少约80、至少约81、至少约82、至少约83、至少约84、至少约85、至少约86、至少约87、至少约88、至少约89、至少约90、至少约91、至少约92、至少约93、至少约94、至少约95、至少约96、至少约97、至少约98、至少约99、至少约100、至少约101、至少约102、至少约103、至少约104、至少约105、至少约106、至少约107、至少约108、至少约109、至少110、至少约111、至少约112、至少约113、至少约114、至少约115、至少约116、至少约117、至少约118、至少约119、至少约120、至少约121、至少约122、至少约123、至少约124、至少约125、至少约126、至少约127、至少约128、至少约129、至少约130、至少约131、至少约132、至少约133、至少约134、至少约135、至少约136、至少约137、至少约138、至少约139、至少约140、至少约141、至少约142、至少约143、至少约144、至少约145、至少约146、至少约147、至少约148、至少约149、至少约150、至少约151、至少约152、至少约153、至少约154、至少约155、至少约156、至少约157、至少约158、至少约159或至少约160。

在一些方面，n为约80至约90、约90至约100、约100至约110、约110至约120、约120至约130、约130至约140、约140至约150、约150至约160、约85至约95、约95至约105、约105至约115、约115至约125、约125至约135、约135至约145、约145至约155、约155至约165、约80至约100、约100至约120、约120至约140、约140至约160、约85至约105、约105至约125、约125至约145、约145至约165。

在一些方面，n在2与10之间、在10与20之间、在20与30之间、在30与40之间、在40与50之间、在50与60之间、在60与70之间、在70与80之间、在80与90之间、在90与100之间、在100与110之间、在110与120之间、在120与130之间、在130与140之间、在140与150之间、在150与160之间、在160与170之间、在170与180之间、在180与190之间或在190与200之间。在一些具体方面，n的值为3至200、3至20、10至30或9至45。

在一些方面，PEG是分枝型PEG。分枝型PEG具有三至十条自中心核心基团发出的PEG链。在某些方面，PEG部分是单分散聚乙二醇。在本公开文本的上下文中，单分散聚乙二醇(mdPEG)是具有单一的、确定的链长和分子量的PEG。mdPEG通常通过经由色谱法从聚合混合物中分离而产生。在某些式中，单分散PEG部分被指定为缩写mdPEG。在一些方面，PEG是星形PEG。星形PEG具有10至100条自中心核心基团发出的PEG链。在一些方面，PEG是梳状PEG。梳状PEG具有多条通常接枝到聚合物主链上的PEG链。

在某些方面，PEG的摩尔质量在100g/mol与3000g/mol之间，特别地在100g/mol与2500g/mol之间，更特别地为约100g/mol至2000g/mol。在某些方面，PEG的摩尔质量在200g/mol与3000g/mol之间，特别地在300g/mol与2500g/mol之间，更特别地为约400g/mol至2000g/mol。在某些方面，PEG的摩尔质量在约1000g/mol与约2000g/mol之间、在约2000g/mol与约3000g/mol之间、在约3000g/mol至约4000g/mol之间、在约4000g/mol与约5000g/mol之间、在约5000g/mol与约6000g/mol之间、在约6000g/mol与约7000g/mol之间或在7000g/mol与约8000g/mol之间。

在一些方面，PEG是PEG

在一些方面，PEG是单分散的，例如mPEG

在一些方面，分析物(例如蛋白质，如抗体)包含单一PEG。在一些方面，分析物(例如蛋白质，如抗体)可以包含多于一种PEG，其中所有PEG都相同或者至少一种与其他PEG不同。在一些方面，PEG是线性PEG。在一些方面，PEG是线性甲氧基PEG。在一些方面，PEG的分子量为大约30kDa。在一些方面，PEG(例如，线性甲氧基PEG)通过化学或酶促缀合与蛋白质(例如，抗体)连接。在一些方面，缀合是经由非天然氨基酸进行的。

在一些方面，聚甘油(PG)由式((R

在一些方面，PG是由式(R

在某些方面，PG的摩尔质量在100g/mol与3000g/mol之间，特别地在100g/mol与2500g/mol之间，更特别地为约100g/mol至2000g/mol。在某些方面，PG的摩尔质量在200g/mol与3000g/mol之间，特别地在300g/mol与2500g/mol之间，更特别地为约400g/mol至2000g/mol。在某些方面，PG的摩尔质量在约1000g/mol与约2000g/mol之间、在约2000g/mol与约3000g/mol之间、在约3000g/mol至约4000g/mol之间、在约4000g/mol与约5000g/mol之间、在约5000g/mol与约6000g/mol之间、在约6000g/mol与约7000g/mol之间或在7000g/mol与约8000g/mol之间。

在一些方面，PG是PG

在一些方面，PG是单分散的，例如mPG

在一些方面，水溶性生物聚合物包括聚(丙二醇)(“PPG”)。在一些方面，PPG由下式来表征，其中n的值为1至1000。

在一些方面，PPG的n的值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、189、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200。

在一些方面，PPG的n为至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约110、至少120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220、至少约230、至少约240、至少约250、至少约260、至少约270、至少约280、至少约290、至少约300、至少约310、至少约320、至少约330、至少约340、至少约350、至少约360、至少约370、至少约380、至少约390、至少约400、至少约410、至少约420、至少约430、至少约440、至少约450、至少约460、至少约470、至少约480、至少约490、至少约500、至少约510、至少约520、至少约530、至少约540、至少约550、至少约560、至少约670、至少约580、至少约590、至少约600、至少约610、至少约620、至少约630、至少约640、至少约650、至少约660、至少约670、至少约680、至少约690、至少约700、至少约710、至少约720、至少约730、至少约740、至少约750、至少约760、至少约770、至少约780、至少约790、至少约800、至少约810、至少约820、至少约830、至少约840、至少约850、至少约860、至少约870、至少约880、至少约890、至少约900、至少约910、至少约920、至少约930、至少约940、至少约950、至少约960、至少约970、至少约980、至少约990或约1000。

在一些方面，PPG的n在约50与约100之间、在约100与约150之间、在约150与约200之间、在约200与约250之间、在约250与约300之间、在约300与约350之间、在约350与约400之间、在约400与约450之间、在约450与约500之间、在约500与约550之间、在约550与约600之间、在约600与约650之间、在约650与约700之间、在约700与约750之间、在约750与约800之间、在约800与约850之间、在约850与约900之间、在约900与约950之间或在约950与约1000之间。

在一些方面，PPG的n为至少约80、至少约81、至少约82、至少约83、至少约84、至少约85、至少约86、至少约87、至少约88、至少约89、至少约90、至少约91、至少约92、至少约93、至少约94、至少约95、至少约96、至少约97、至少约98、至少约99、至少约100、至少约101、至少约102、至少约103、至少约104、至少约105、至少约106、至少约107、至少约108、至少约109、至少110、至少约111、至少约112、至少约113、至少约114、至少约115、至少约116、至少约117、至少约118、至少约119、至少约120、至少约121、至少约122、至少约123、至少约124、至少约125、至少约126、至少约127、至少约128、至少约129、至少约130、至少约131、至少约132、至少约133、至少约134、至少约135、至少约136、至少约137、至少约138、至少约139、至少约140、至少约141、至少约142、至少约143、至少约144、至少约145、至少约146、至少约147、至少约148、至少约149、至少约150、至少约151、至少约152、至少约153、至少约154、至少约155、至少约156、至少约157、至少约158、至少约159或至少约160。

在一些方面，PPG的n为约80至约90、约90至约100、约100至约110、约110至约120、约120至约130、约130至约140、约140至约150、约150至约160、约85至约95、约95至约105、约105至约115、约115至约125、约125至约135、约135至约145、约145至约155、约155至约165、约80至约100、约100至约120、约120至约140、约140至约160、约85至约105、约105至约125、约125至约145或约145至约165。

因此，在一些方面，PPG是分枝型PPG。分枝型PPG具有三至十条自中心核心基团发出的PPG链。在某些方面，PPG部分是单分散聚乙二醇。在本公开文本的上下文中，单分散聚乙二醇(mdPPG)是具有单一的、确定的链长和分子量的PPG。mdPEG通常通过经由色谱法从聚合混合物中分离而产生。在某些式中，单分散PPG部分被指定为缩写mdPPG。

在一些方面，PPG是星形PPG。星形PPG具有10至100条自中心核心基团发出的PPG链。在一些方面，PPG是梳状PPG。梳状PPG具有多条通常接枝到聚合物主链上的PPG链。

在某些方面，PPG的摩尔质量在约1000g/mol与约2000g/mol之间、在约2000g/mol与约3000g/mol之间、在约3000g/mol至约4000g/mol之间、在约4000g/mol与约5000g/mol之间、在约5000g/mol与约6000g/mol之间、在约6000g/mol与约7000g/mol之间或在7000g/mol与约8000g/mol之间。

在一些方面，PPG是PPG

在一些方面，PPG是单分散的，例如mPPG

icIEF样品内使用的分析物(例如，PEG化蛋白质)的量可以变化，并且部分取决于所使用的毛细管的大小。通常，icIEF毛细管装载有约0.1mg至约5mg的总蛋白质。在一些方面，本文公开的组合物(例如，包含本公开文本的icIEF样品基质和PEG化蛋白质的混合物)中蛋白质分析物的量在约0.1mg至约5mg的总蛋白质之间，例如约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约1.5mg、约2mg、约2.5mg、约3mg、约3.5mg、约4mg、约4.5mg或约5mg。

在一些方面，PEG化蛋白质是包含多种电荷变体的PEG化蛋白质组合物。因此，在一些方面，PEG化蛋白质是包含主要或优势种类和就其各自的电荷而言不同于优势种类的其他种类的种类群体。因此，PEG化蛋白质组合物可以含有比主要或优势种类更具酸性或更具碱性的电荷变体种类。

在一些方面，分析物(例如，PEG化蛋白质)的浓度在约0.1mg/mL与约1mg/mL之间。在一些方面，分析物(例如，PEG化蛋白质)的浓度在约0.25mg/mL至约0.75mg/mL之间。在一些方面，分析物(例如，PEG化蛋白质)的浓度为约0.5mg/mL。在一些方面，分析物(例如，PEG化蛋白质)的浓度为约0.1mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL或约1mg/mL。

在一些方面，本公开文本提供了icIEF样品基质的试剂盒。在一些方面，试剂盒包含本文公开的icIEF样品基质。在一些方面，试剂盒包含两性电解质、甘氨酸和/或牛磺酸，以及任选的根据本文公开的方法的使用说明书。在一些方面，两性电解质、甘氨酸和/或牛磺酸可以在同一小瓶中或在不同小瓶中。在一些方面，试剂盒可以包含一种或多种干燥形式的组分和一个或多个包含用于重构的溶剂的小瓶。

本公开文本还提供了测量包含水溶性聚合物(例如，PEG)的分析物(如PEG化蛋白质)的等电点(pI)的方法，所述方法包括对包含本文公开的icIEF样品基质和PEG化蛋白质的样品进行icIEF。

还提供了测量分析物(如PEG化蛋白质组合物)的电荷变体群体的等电点(pI)的方法，其中分析物含有水溶性聚合物，例如PEG，其中所述方法包括对样品进行icIEF，所述样品包含(i)本文公开的icIEF样品基质；以及(ii)包含电荷变体群体的分析物。

还提供了根据它们各自的等电点(pI)分离含有水溶性聚合物(例如，PEG)的分析物(如PEG化蛋白质组合物)的电荷变体群体的方法，其中所述方法包括对样品进行icIEF，所述样品包含(i)本文公开的icIEF样品基质和(ii)包含电荷变体群体的分析物。

如上文所公开，在一些方面，分析物(例如，在对重组蛋白进行PEG化后获得的PEG化蛋白质组合物)包含多种电荷变体种类，例如作为相对于组合物中的优势种类(主要种类)更具酸性或更具碱性的种类的种类。在本文公开的方法的一些方面，分析物浓度(例如，包含多种电荷变体种类的PEG化蛋白质组合物中的总蛋白质浓度)在约0.1mg/mL与约1mg/mL之间。在一些方面，分析物(例如，PEG化蛋白质或PEG化蛋白质组合物)浓度在约0.25mg/mL与约0.75mg/mL之间。在一些方面，分析物(例如，PEG化蛋白质或PEG化蛋白质组合物)浓度为约0.1mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL或约1mg/mL。在一些方面，分析物是PEG化蛋白质，其浓度为约0.5mg/mL。

在本文公开的方法的一些方面，icIEF包括(i)施加第一电压持续第一预定时间段，使得载体两性电解质在毛细管内形成pH梯度；以及(ii)施加第二电压持续第二预定时间段以在毛细管内聚焦蛋白质的电荷变体的迁移，使得变体的总电荷是中性的。

在本文公开的方法的一些方面，第一电压在约1V与约3000V之间。例如，第一电压可以为约1V、约100V、约250V、约500V、约750V、约1000V、约1250V、约1500V、约1750V、约2000V、约2250V、约2500V、约2750V或约3000V。在一些方面，第一电压在约1V与约100V之间、在约100V与约200V之间、在约200V与约300V之间、在约300V与约400V之间、在约400V与约500V之间、在约500V与约600V之间、在约600V与约700V之间、在约700V与约800V之间、在约800V与约900V之间、在约900V与约1000V之间、在约1000V与约1100V之间、在约1100V与约1200V之间、在约1200V与约1300V之间、在约1300V与约1400V之间、在约1400V与约1500V之间、在约1500V与约1600V之间、在约1600V与约1700V之间、在约1700V与约1800V之间、在约1800V与约1900V之间、在约1900V与约2000V之间、在约2000V与约2100V之间、在约2100V与约2200V之间、在约2200V与约2300V之间、在约2300V与约2400V之间、在约2400V与约2500V之间、在约2500V与约2600V之间、在约2600V与约2700V之间、在约2700V与约2800V之间、在约2800V与约2900V之间或在约2900V与约3000V之间。

在本文公开的方法的一些方面，第一电压在约100V与约2900V之间、在约200V与约2800V之间、在约300V与约2700V之间、在约400V与约2600V之间、在约500V与约2500V之间、在约600V与约2400V之间、在约700V与约2300V之间、在约800V与约2200V之间、在约900V与约2100V之间、在约1000V与约2000V之间、在约1100V与约1900V之间、在约1200V与约1800V之间、在约1300V与约1700V之间或在约1400V与约1600V之间。在一些特定方面，第一电压为约1500V。

在本文公开的方法的一些方面，第二电压在约1V与约6000V之间。例如，第二电压可以为约1V、约100V、约250V、约500V、约750V、约1000V、约1250V、约1500V、约1750V、约2000V、约2250V、约2500V、约2750、约3000V、约3250V、约3500V、约3750V、约4000V、约4250V、约4500V、约4750V、约5000V、约5250V、约5500V、约5750V或约6000V。

在本文公开的方法的一些方面，第二电压在约1V与约100V之间、在约100V与约200V之间、在约200V与约300V之间、在约300V与约400V之间、在约400V与约500V之间、在约500V与约600V之间、在约600V与约700V之间、在约700V与约800V之间、在约800V与约900V之间、在约900V与约1000V之间、在约1000V与约1100V之间、在约1100V与约1200V之间、在约1200V与约1300V之间、在约1300V与约1400V之间、在约1400V与约1500V之间、在约1500V与约1600V之间、在约1600V与约1700V之间、在约1700V与约1800V之间、在约1800V与约1900V之间、在约1900V与约2000V之间、在约2000V与约2100V之间、在约2100V与约2200V之间、在约2200V与约2300V之间、在约2300V与约2400V之间、在约2400V与约2500V之间、在约2500V与约2600V之间、在约2600V与约2700V之间、在约2700V与约2800V之间、在约2800V与约2900V之间、在约2900V与约3000V之间、在约3100V与约3200V之间、在约3200V与3300V之间、在约3300V与约3400V之间、在约3400V与约3500V之间、在约3500V与约3600V之间、在约3600V与约3700V之间、在约3700V与约3800V之间、在约3800V与约3900V之间、在约3900V与约4000V之间、在约4000V与约4100V之间、在约4100V与约4200V之间、在约4200V与约4300V之间、在约4300V与约4400V之间、在约4400V与约4500V之间、在约4500V与约4600V之间、在约4600V与约4700V之间、在约4700V与约4800V之间、在约4800V与约4900V之间、在约4900V与约5000V之间、在约5000V与约5100V之间、在约5100V与5200V之间、在约5200V与约5300V之间、在约5300V与约5400V之间、在约5400V与约5500V之间、在约5500V与约5600V之间、在约5600V与约5700V之间、在约5700V与约5800V之间、在约5800V与约5900V之间或在约5900V与约6000V之间。

在本文公开的方法的一些方面，第二电压在约100V与约5900V之间、在约200V与约5800V之间、在约300V与5700V之间、在约400V与约5600V之间、在约500V与约5500V之间、在约600V与约5400V之间、在约700V与约5300V之间、在约800V与约5200V之间、在约900V与约5100V之间、在约1000V与约5000V之间、在约1100V与约4900V之间、在约1200V与约4800V之间、在约1300V与约4700V之间、在约1400V与约4600V之间、在约1500V与约4500V之间、在约1600V与约4400V之间、在约1700V与约4300V之间、在约1800V与约4200V之间、在约1900V与约4100V之间、在约2000V与约4000V之间、在约2100V与约3900V之间、在约2200V与约3800V之间、在约2300V与约3700V之间、在约2400V与约3600V之间、在约2500V与约3500V之间、在约2600V与约3400V之间、在约2700V与约3300V之间、在约2800V与约3200V之间或在约2900V与约3100V之间。在一些特定方面，第二电压为约3000V。

在本文公开的方法的一些方面，第一预定时间段在约1秒与约5分钟之间。例如，第一预定时间段可以为约1秒、约10秒、约20秒、约30秒、约40秒、约50秒、约1分钟(60秒)、约1.5分钟(90秒)、约2分钟(120秒)、约2.5分钟(150秒)、约3分钟(180秒)、约3.5分钟(210秒)、约4分钟(240秒)、约4.5分钟(270秒)或约5分钟(300秒)。在本文公开的方法的一些方面，第一预定时间段在约10秒与约20秒之间、在约20秒与约30秒之间、在约30秒与约40秒之间、在约40秒与约50秒之间、在约50秒与约60秒之间、在约60秒与约70秒之间、在约70秒与约80秒之间、在约80秒与约90秒之间、在约90秒与约100秒之间、在约100秒与约110秒之间或在约110秒与约120秒之间。在本文公开的方法的一些方面，第一预定时间段在10秒与110秒之间、在约20秒与约100秒之间、在约30秒与约90秒之间、在约40秒与约80秒之间或在约50秒与约70秒之间。在一些特定方面，第一预定时间段为约60秒(1分钟)。

在本文公开的方法的一些方面，第二预定时间段在约1分钟与约15分钟之间。例如，第二预定时间段可以为约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟或约15分钟。在一些方面，第二预定时间段在约1分钟与约2分钟之间、在约2分钟与约3分钟之间、在约3分钟与约4分钟之间、在约4分钟与约5分钟之间、在约5分钟与约6分钟之间、在约6分钟与约7分钟之间、在约7分钟与约8分钟之间、在约8分钟与约9分钟之间、在约9分钟与约10分钟之间、在约10分钟与约11分钟之间、在约11分钟与约12分钟之间、在约12分钟与约13分钟之间、在约13分钟与约14分钟之间或在约14分钟与约15分钟之间。

在本文公开的方法的一些方面，第二预定时间段在约2分钟与约14分钟之间、在约3分钟与约13分钟之间、在约4分钟与约12分钟之间、在约5分钟与约11分钟之间、在约6分钟与约10分钟之间、在约6分钟与约9分钟之间或在7分钟与约9分钟之间。在本文公开的方法的一些具体方面，第二预定时间段为约8分钟。

在本文公开的方法的一些方面，第一电压为约1500V，并且第一预定时间段为约1分钟。在一些方面，第二电压为约3000V，并且第二预定时间段为约8分钟。在本文公开的方法的一些方面，(i)第一电压为约1500V且第一预定时间段为约1分钟，并且(ii)第二电压为约3000V且第二预定时间段为约8分钟。

在一些方面，icIEF在大约10℃下进行。在一些方面，icIEF在介于约9℃与约11℃之间、介于约8℃与约12℃之间、介于约7℃与约13℃之间、介于约6℃与约14℃之间或介于约5℃与约15℃之间的温度下进行。在一些方面，icIEF在约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃或约15℃的温度下进行。

本公开文本还提供了增强含有水溶性聚合物(例如，PEG)的分析物(如PEG化蛋白质组合物)的电荷变体的共迁移群体的分离的方法，其中所述方法包括对样品进行icIEF，所述样品包含(i)本文公开的icIEF样品基质和(ii)包含电荷变体群体的分析物。在一些方面，PEG化蛋白质是PEG化抗体。

在一些方面，所述方法包括使用本文公开的icIEF样品基质，其中样品基质包含甘氨酸，但是不包含牛磺酸。在一些方面，所述方法包括使用包含甘氨酸以及牛磺酸的样品基质，其中牛磺酸降低由样品基质中存在甘氨酸引起的基线干扰。分析物的电荷变体(例如，PEG化蛋白质组合物中PEG化蛋白质的不同电荷变体)的共迁移在电泳图中可视化为存在单个宽峰或若干分辨率差的峰，即峰将共迁移。因此，样品基质中存在甘氨酸可以增强峰之间的分离，其中每个峰与离散的带电变体或带电变体亚群相对应。因此，本公开文本提供了增强与分析物的电荷变体(例如，PEG化蛋白质组合物中PEG化蛋白质的不同电荷变体)相对应的共迁移峰的分离的方法，所述方法包括对包含本文公开的icIEF样品基质和分析物的样品进行icIEF，其中样品基质包含甘氨酸。在一个特定方面，甘氨酸以约40mM的浓度或上文公开的任何其他浓度存在于样品基质中。

峰之间分离(即，电荷变体之间分离)的增强是icIEF分辨率的提高，其可以定量或定性地确定。例如，由于样品基质中存在甘氨酸而导致的icIRF分辨率的提高可以定量为电泳图中峰数目的增加(即，所观察到的电荷变体种类数目的增加)、电泳图中峰之间分离的增加、电泳图中峰之间重叠的减少或其任何组合。

可以相对于参考确定由于样品基质中存在甘氨酸而导致的电泳图中峰之间分离的增强或一般地icIEF分辨率的提高。在一些方面，参考是使用相同但不含甘氨酸的样品基质获得的icIEF电泳图。在一些方面，参考是使用常规样品基质(例如，使用尿素代替甘氨酸作为添加剂的样品基质)获得的电泳图。

在一个特定方面，本公开文本提供了增强icIEF中PEG化蛋白质的共迁移峰的分离的方法，所述方法包括对包含本文公开的icIEF样品基质和PEG化蛋白质的样品进行icIEF。在一些方面，用于增强共迁移峰的分离(或一般地用于提高icIEF分辨率)的icIEF样品基质包含至少一种

本公开文本还提供了降低基质导致的基线干扰的方法，所述方法包括在icIEF期间使用本文公开的icIEF样品基质，其中icIEF样品基质包含牛磺酸。在一些方面，干扰是碱性区域干扰，即icIEF电泳图的碱性区域中的干扰(例如，波浪形基线)。在一些方面，干扰可能由样品基质中存在添加剂引起，例如由存在甘氨酸引起。

在一些方面，可以通过将使用包含干扰剂(例如，甘氨酸)和牛磺酸的icIEF样品基质获得的icIEF电泳图中的基线与在包含相同但不含牛磺酸(即，包含干扰剂，例如甘氨酸)的样品基质(即，参考样品基质)的参考icIEF电泳图中观察到的基线进行比较来确定基线干扰的降低。在一些方面，不含牛磺酸的参考样品基质是含有尿素的基质。在一些方面，参考样品基质是不含甘氨酸和/或牛磺酸的样品基质。

基线干扰的降低可以定量或定性地确定。例如，基线干扰的降低可以测量为基线中波或扰动数目的减少或其幅度的减小。通常，基线干扰的降低导致基线线性的提高。

在一些方面，用于降低基质导致的基线干扰的icIEF样品基质包含至少一种

本公开文本还提供了提高通过icIEF分离的分析物(例如，PEG化蛋白质组合物)的电荷变体的定量准确性的方法，所述方法包括使用本文公开的icIEF样品基质，例如包含至少一种

还提供了监测分析物(例如，PEG化蛋白质组合物)的热稳定性的方法，所述方法包括使分析物经受热胁迫，然后通过icIEF分离分析物的电荷变体(例如，对应于PEG化蛋白质上的片段或未折叠形式)，包括使用本文公开的icIEF样品基质，例如包含至少一种

在一些方面，本文公开的方法可以用于监测分析物(例如，PEG化蛋白质组合物)的热稳定性，包括使分析物经受热胁迫，例如在40℃下孵育例如7天，然后通过icIEF分离分析物的电荷变体(例如，对应于PEG化蛋白质上的片段或未折叠形式)，包括使用本文公开的icIEF样品基质，例如包含至少一种

在一些方面，本文公开的icIEF方法的定量限(LOQ)为大约0.028mg/mL，本文公开的icIEF方法即包括使用包含至少一种

实施例

实施例1

经改进的icIEF样品基质的设计和表征

I.材料

0.5％甲基纤维素溶液、1％甲基纤维素溶液、iCE电解质试剂盒、pI标志物4.65、pI标志物6.61、带Alcott 720NV自动进样器和FC(碳氟化合物)柱的iCE3仪器购自ProteinSimple，FC柱具有50mm、100μm(内径)碳氟化合物涂层的毛细管和内置电解质槽。尿素粉和甲酰胺购自J.T.Baker。

II.方法

(a)icIEF样品基质制备：

通过合并试剂至以下最终浓度制备icIEF样品：0.35％(w:v，即重量比体积)甲基纤维素、4％(v:v；即体积比体积)

将离心机设定为10℃的温度。将制备好的样品以10,621rcf离心3分钟。在离心后，将160μL制备好的样品转移到300μL小瓶中。将小瓶放置在仪器样品室中。

(b)iCE3仪器参数：

准备好iCE3仪器，并且根据供应商的仪器使用指南安装FC柱。所使用的iCE3仪器参数如下：预聚焦电压：1500V；聚焦电压：3000V；自动进样器温度：10℃±1℃；检测：UV280nm；进样压力：2000毫巴；预聚焦时间：1分钟；聚焦时间：8分钟。

(c)软件：使用iCE CFR软件进行数据采集，并且将电泳图导入Empower软件柱进行数据分析。

III.结果与讨论：

常用的icIEF基质无法将PEG化蛋白质A的酸性变体和碱性变体与主峰分离，这导致等电聚焦中出现一个合并峰(图1)。在icIEF测定中，峰通常基于其pI值相对于显示出最大峰高的主峰来分组；主峰之前的峰代表酸性组，并且主峰之后的峰代表碱性组。即使在常用添加剂尿素的存在下，在PEG化蛋白质A的等电聚焦期间主峰和碱性峰也发生了共迁移。酸性峰也几乎没有与主峰分离(图1)。

使用另一种与icIEF相容的变性剂甲酰胺(Zhang等人(2017)AnalyticalBiochemistry 521:1-7)来重复实验，它所产生的电荷分布与在使用尿素时类似。使用更高浓度的尿素和甲酰胺重复实验使电荷分布的可重复性变差(数据未示出)。

较窄的两性电解质(即，覆盖较窄pH范围的载体两性电解质)通常可以提高峰分辨率(Righetti等人(2007)Electrophoresis 28:3799-3810)并更好地分离电荷变体。当使用较窄的两性电解质来尝试分离存在于PEG化蛋白质A样品中的不同种类时，观察到稍微更好的分离。因此，添加较窄的两性电解质

甘氨酸已经被报道为十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)中的缓冲组分，其可以增强PEG化蛋白质的基于大小的分离(Molek和Zydney(2008)Capillary electrophoresisof PEGylated proteins.AIChE100-2008AIChE Annual Meeting,ConferenceProceedings(AIChE Annual Meeting,Conference Proceedings))。在基于分析物大小的分离中，甘氨酸可以提高与大小变体相对应的两个已经很好地分离的峰的分辨率：PEG化部分与非PEG化部分。然而，尚无关于在任何等电聚焦方法中可能分离PEG化蛋白质的电荷变体的共迁移峰的先前报道。

因此，在PEG化蛋白质A的成像毛细管等电聚焦中采用甘氨酸。实验结果表明，甘氨酸增强了PEG化蛋白质A的电荷变体的分离(图3)，并且不再观察到主峰和碱性峰的共迁移。使得分辨率显著提高的机制可能是由于蛋白质吸附减少和过度焦耳加热减少，类似于使用两性离子对蛋白质进行基于分离大小的毛细管电泳期间观察到的情况(Bushey和Jorgenson(1989)Journal of Chromatography A 480:301-310；Bushey和Jorgenson(1989)Journal of Chromatography A 480:301-310)。

尽管由于样品基质中存在甘氨酸而观察到分辨率提高，但icIEF基质中包含甘氨酸导致碱性区域中显著的基线波，这显著干扰求积和定量(图3)。因此，必须鉴定出一种解决方案来补偿由甘氨酸引起的负面影响。

引入牛磺酸以进一步优化测定。作为一种未被掺入蛋白质中的含硫氨基酸，牛磺酸可以安全地用作蛋白质制剂的赋形剂(Arakawa等人(2007)Amino Acids 33:587-605)。将牛磺酸添加到样品基质中成功消除了由甘氨酸引起的碱性区域中的基线干扰(图3)，从而使得能够对碱性电荷变体进行准确求积和定量。

与先前报道的一些两性离子一样，甘氨酸可以在毛细管表面形成动态涂层(Gong和Ho(1997)Electrophoresis 18:732-735)，这是基线干扰的最可能原因，尽管事实是在实验中使用FC涂层的毛细管代替未涂层的二氧化硅毛细管。在使用未涂层的二氧化硅毛细管和预涂层的毛细管的情况下，动态涂层都是可能的(Nowak等人(2017)AnalBioanal.Chem.409:1493-1501)。有迹象表明，可能甘氨酸动态地包覆FC涂层的毛细管，导致基线干扰，并且作为两性离子的牛磺酸与甘氨酸竞争，防止甘氨酸附着至毛细管壁，从而降低由样品基质中存在甘氨酸而导致的基质导致的基线干扰。

发现在有和没有牛磺酸情况下的电泳图具有高度可重复性。约pI 5.86的碱性次峰很可能在添加牛磺酸后合并到相邻的碱性峰中(图3)，但是碱性组的总百分比仍然非常类似。通常使用icIEF测定来监测酸性组、主峰组和碱性组的总百分比，作为产品质量控制的一部分，因此碱性次峰的合并对碱性组总百分比的定量几乎没有影响。另一方面，在不存在牛磺酸的情况下，显著的基线波增加至少10％的变化至碱性组和主峰，降低测定定量和检测限。因此，基线波的消除确保了对酸性组、主峰组和碱性组的准确定量。

在方法开发期间对甘氨酸和牛磺酸进行滴定以找到最佳条件。对0mM至200mM的一系列甘氨酸浓度进行测试，并且40mM甘氨酸提供了足以将酸性种类和碱性种类与主峰分离的分辨率。此外，所得电荷分布与蛋白质表征结果一致。从0mM至200mM对牛磺酸进行滴定，并且50mM牛磺酸足以去除基线波且对总电荷分布影响最小。

通过使用新的甘氨酸-牛磺酸(GLY-T)样品基质对PEG化蛋白质A进行多次注射和多次样品制备证实方法的精确度，并且如通过图4中的电泳图(e-gram/electropherogram)叠加所证明，电荷分布始终具有可重复性。

还通过三个峰组的峰面积百分比的标准差评价多次样品制备的精确度，其中酸性组、主峰组和碱性组的标准差分别为0.3％、0.5％和0.3％(表1)。

表1：精确度研究中PEG化蛋白质A的峰面积％汇总。

在仪器自动进样器中进行线性和准确性研究以及样品稳定性测试，以确保使用GLY-T样品基质的测定质量。通过一式三份地制备标称浓度的50％、75％、100％、125％和150％的PEG化蛋白质A证实线性。然后将峰面积作为蛋白质浓度的线性函数进行分析。所有线性曲线的R

通过在空白基质(配制缓冲液)中掺入PEG化蛋白质A分析准确性。在目标浓度的50％至150％的线性范围内，以五个水平一式三份地制备加掺样品。然后计算回收百分比以评价方法的准确性。酸性组、主峰和碱性组的回收百分比分别在93.2％至109.9％、98.0％至101.9％和94.6％至107.3％内(表2)。

表2：准确性研究中PEG化蛋白质A的峰面积和回收％汇总。

线性和准确性研究结果符合ICH指南(ICH Guideline Q2(R1)Validation ofAnalytical Procedures:Text and Methodology,2005年11月)。将样品在仪器自动进样器中稳定24小时，并且在0小时与24小时的PEG化蛋白质A的电泳图叠加中未观察到明显的变化(图5)。

使用温度胁迫的PEG化蛋白质A进行稳定性研究。在温和的热胁迫条件下(40℃持续1周)对PEG化蛋白质A进行处理。使用新的GLY-T样品基质，热胁迫的样品显示出主峰面积减小以及酸性种类和碱性种类增加。

使用0.002mg/mL至0.032mg/mL的低蛋白质浓度值通过线性回归确定定量限(LOQ)。将实验重复三次，并且每个浓度注射三次。然后将LOQ计算为线性曲线斜率上y截距的标准差的10倍(Shrivastava和Gupta(2011)Chron.Young Sci.2:21-25)。

使用方程LOD＝3x LOQ/10(Shrivastava和Gupta(2011)Chron.Young Sci.2:21-25)由LOQ估计检测限(LOD)。然后确定并确认新的icIEF测定的LOQ和LOD为约0.028mg/mL和0.008mg/mL。

使用icIEF和GLY-T样品基质进行稳健性研究。首先，评价了自动进样器温度和聚焦时间如何影响新测定的稳健性；电荷分布在自动进样器中在±1℃内和在聚焦期间在±0.5min内大致恒定(表3)。

表3：当将变化应用于关键参数时PEG化蛋白质A的峰面积％汇总，一次改变一个变量。将±1℃的变化应用于标称自动进样器温度(10℃)；将±0.5分钟的变化应用于标称聚焦时间(8分钟)；将±10％的变化应用于

进行了另一项稳健性研究以评价所有的关键试剂，如甲基纤维素、

最后，评估了关键试剂的组合效果，以找出最坏的情况。该研究包括三个独立变量(

表4：当将变化应用于关键参数时PEG化蛋白质A的峰面积％汇总，在研究中同时改变多个变量。将±10％的变化应用于GLY-T样品基质中

a)符号“-”表示将“-10％”应用于变量的标称浓度；符号“+”表示将“+10％”应用于变量的标称浓度。

b)使用如表中所示的以下顺序指定组合：

还使用JMP软件中的合意度剖析功能对表4中的结果进行了统计学评价。

可以使用常用的icIEF测定条件分离非PEG化蛋白质A的电荷变体。然而，使用icIEF和常用的样品基质(甚至包括添加剂，如尿素或甲酰胺)无法捕获由于PEG化和后续纯化过程而导致的变化。在PEG化蛋白质A与非PEG化蛋白质A之间观察到主峰面积增加了大约5.0％。因此，新开发的GLY-T样品基质使得能够分析PEG化蛋白质A及其不同电荷变体并捕获PEG化和随后的纯化过程期间发生的变化。

使用GLY-T样品基质进一步测试了若干其他PEG化蛋白质和抗体。当用GLY-T样品基质代替常用的含尿素样品基质时，它们全部显示出更好的分辨率。例如，使用GLY-T基质，PEG化抗体B显示出好得多的电荷变体分离(图7)。

总之，新开发的GLY-T样品基质使得能够对PEG化蛋白质进行icIEF分离，同时实现了可重复性、线性、准确性、样品稳定性和方法稳健性。因此，不再需要实施间接方法来分析PEG化蛋白质的电荷变体，如在PEG化之前分析蛋白质，其无法捕获PEG化和纯化过程期间发生的变化。观察结果已经表明，GLY-T icIEF样品基质为分析处于其实际缀合状态下的PEG化蛋白质的电荷变体提供了出色的解决方案，并且提供了相比于目前使用的常规方法更准确的关于PEG化蛋白质的电荷变体的定量和定性信息。

实施例2

对PEG化蛋白质A热降解的定量

经由在40℃下孵育7天，对PEG化蛋白质A进行强制降解。使用上述实验条件分离PEG化蛋白质A及其热降解产物。样品基质含有4％(v:v)

PEG化蛋白质A的强制降解(图8)导致主峰减少以及比主峰更具酸性(约pH5.26)和更具碱性(约pH 5.54)的峰面积增加。这表明实验中使用的经改进的icIEF样品基质提供了酸性峰和碱性峰中的降解产物与主峰中的完整PEG化蛋白质A的良好分离。

如上所述，通过阴离子交换HPLC(AEX HPLC)纯化酸性峰中的降解蛋白质。通过LC-MS肽成像分析收集的酸性峰蛋白质，并且天冬酰胺脱酰胺的PEG化蛋白质A被鉴定为样品中的主要降解产物。使用纯化的酸性形式掺入PEG化蛋白质A样品中，并且对加掺样品进行ciIEF(图9)。ciIEF检测到加掺样品中天冬酰胺脱酰胺的形式增加。

天冬酰胺脱酰胺是icIEF中酸性峰的常见原因。因此，本公开文本的icIEF样品基质成功地捕获了当天冬酰胺脱酰胺组分掺入PEG化蛋白质A中时酸性峰的增加。

因此，本公开文本的icIEF基质不仅可用于纯化PEG化蛋白质。此外，使用icIEF基质来检测降解(例如，热降解)和降解产物(例如，天冬酰胺脱酰胺产物)的出现。此外，与天冬酰胺脱酰胺产物相对应的峰面积增加而其他峰未发生变化表明所公开的方法可以用于对PEG化蛋白质的降解进行定量。

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应理解，具体实施方式部分而不是发明内容和摘要部分旨在用于解释权利要求。发明内容和摘要部分可以阐述如诸位发明人所设想的本发明的一个或多个但并非所有示例性实施方案，因此，并不旨在以任何方式限制本发明和所附权利要求。

上文已经借助于说明指定功能及其关系的实施的功能构建块描述了本发明。为了描述方便，在本文中已经任意定义了这些功能构建块的边界。只要适当执行指定功能及其关系，就可以定义替代边界。

具体实施方案的前述描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，使得其他人可以通过应用本领域技术范围内的知识，在无需过度实验并且不脱离本发明一般概念的情况下容易地修改和/或调整此类具体实施方案用于各种应用。因此，基于本文给出的传授内容和指导，此类调整和修改旨在包含在所公开的实施方案的等效物的含义和范围内。应理解，本文的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，因此本说明书的术语或措辞将由熟练技术人员根据传授内容和指导来解释。

本发明的广度和范围不应当由任何上述示例性实施方案来限制，而应当仅根据以下权利要求及其等效物来定义。

将可以贯穿本申请引用的所有引用的参考文献(包括文献参考文献、专利、专利申请和网站)的内容都出于任何目的明确地通过引用以其整体特此并入，其中引用的参考文献亦是如此。