一种高效的外泌体分离纯化方法及制备装置

技术领域

本发明属于外泌体分离技术领域，具体涉及一种高效的外泌体分离纯化方法及制备装置。

背景技术

外泌体是细胞经过调控过程而形成的直径在30～150nm的具有母细胞膜结构的细胞外小囊泡，外泌体由机体众多类型细胞释放，并广泛分布于体液、腔液、组织间液当中，其可以携带分子蛋白，运送信使RNA，在细胞间起信息转导传递作用；

随着对外泌体的研究和认知的深入，细胞来源的外泌体已被许多临床科研机构广泛地应用于疾病的无创诊断、治疗和监测；临床治疗级外泌体需要良性细胞来源的，但良性细胞在传代过程中由于代次不同，所分泌的外泌体均一性和稳定性较差，同时外泌体的分离技术有超速离心法、PEG沉淀等方法，超速离心一般需要5小时以上，且费时费力、所需设备仪器昂贵，很难获得足够量的外泌体用于后续的大规模实验分析；PEG沉淀法虽然可以大规模分离外泌体，但是在收集到大量外泌体的同时不可避免的混入蛋白，造成囊泡纯度低、含有杂质的问题；目前我国对外泌体的研究还基本依赖于费时费力的超速离心法和昂贵的进口提取试剂盒，造成研发费用高，效率低下，无法实现大批量分离，而且外泌体原液稳定性和均一性较差，因此，需要研发一种新的高效的外泌体分离纯化方法及制备装置来解决这个问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效的外泌体分离纯化方法及制备装置，以解决母液分离得到的外泌体原液稳定性和均一性较差的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种高效的外泌体分离纯化方法，包括：

将母液加载负离子于囊泡的双磷脂膜表面；

加载负离子后排斥处理得到外泌体初分离物；

洗刷外泌体初分离物后脱电荷得到外泌体原液。

优选的，所述将母液加载负离子于囊泡的双磷脂膜表面之前，将母液在0-4℃温度中孵育3 min。

优选的，所述加载负离子后排斥处理包括利用硫酸根SO

所述洗刷外泌体初分离物后脱电荷包括：利用二价阳离子Ca

优选的，所述洗刷后脱电荷得到囊泡浓度为1*10

优选的，所述母液为良性囊泡母液，所述良性囊泡母液包括：围产期干细胞、外周血来源或者脐血来源的单个核细胞；

所述围产期干细胞包括：羊膜干细胞来源的外泌体、脐静脉血管内皮细胞来源的外泌体，华通氏胶干细胞来源的外泌体。

本发明另提供一种高效的外泌体分离纯化方法的分离装置，所述分离装置包括：

釜体；

装配于釜体用于在釜体内搅拌的搅拌组件；

设置于釜体用于加载负离子于囊泡的感应电棒。

优选的，所述釜体包括：

上釜体；

与上釜体匹配构成搅拌空腔的下釜体；

用于使所述上釜体和下釜体密封的固定件；

其中，所述上釜体设置有用于观察釜体内部的观测窗；

用于输入原料的原料进口；

用于输入辅料的辅料进口。

优选的，所述上釜体为半球型，其底部中点位置设置有通孔，远离底部的沿边与下釜体的一端相抵触，所述下釜体为一端开口的空心圆柱体结构，且所述下釜体设置有用于输出成品的出料口，以及备用出口，所述出料口设置于底部的中点位置，并于通孔呈同轴分布。

优选的，所述搅拌组件包括：

装配于釜体的电机底座；

安装在电机底座上用于提供动力源的电机；

一端与电机输出轴相连接的联轴器；

连接在联轴器另一端的搅拌杆；

固定在搅拌杆上用于流体循环的搅拌桨；

所述电机、联轴器、搅拌杆呈同轴分布，所述联轴器安装于电机底座的腔体内，所述电机底座包括上壳体与支撑架，所述上壳体为两端开口空心的圆柱体结构，其一端与所述电机相固定，且在所述上壳体的设有若干圆形的散热孔，并呈同一直线分布，所述上壳体的另一端与支撑架相连接，所述支撑架固定于釜体上，所述上壳体的高度是支撑架高度的3倍，所述电机与电棒控制器相连接，电棒控制器获取电棒温度检测盒中电棒温度，所述电机还与温度检测组件相连接，所述温度检测组件获取釜体的温度，将釜体内的温度与电棒温度检测盒的温度相结合，发送运行指令给电机，控制电机的速度、搅拌方式以及间隔运行时间。

优选的，所述釜体的上方设置有用于测量釜体内温度的温度检测组件；

所述温度检测组件包括：

设置于釜体内的温度传感器；

与温度传感器相连接的温度控制器；

所述温度控制器安装于电机底座上。

优选的，所述感应电棒包括：

装配在釜体上的电棒安装座；

设置于电棒安装座用于获取电棒主体的电棒温度检测盒；

套接于电棒温度检测盒的电棒主体；

与电棒主体相连接的电棒控制器；

所述电棒主体与搅拌杆平行分布，两者之间的间距为釜体内径的2/5,所述电棒主体上设置至少一组电极片。

本发明的技术效果和优点：该高效的外泌体分离纯化方法及制备装置，不需要借助大型设备，采用感应电棒对外泌体进行电荷负载，通过异性吸附纳米管及管壁导流槽和排斥装置得到大量的稳定的均一的外泌体囊泡；有效提升外泌体分离纯度，缩短分离时间、提高外泌体回收效率、提高处理样本通量、降低外泌体分离所需试剂及耗材成本，本发明分离得到的高纯度外泌体可用于药物包裹Westernblot，粒径分析，电镜检测等多种实验；

通过可拆卸式的釜体解决了清洗繁杂的问题，通过对温度检测组件以及电棒温度检测盒的温度的分析，控制搅拌组件的工作模式和方式，提高了分离的效率，通过电棒控制器对电棒主体的控制，根据不同的容量和温度调整功率，提高了分离的效率。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为本发明的结构示意图；

图3为本发明未安装釜体的结构示意图；

图4为本发明从底部斜45度仰视图；

图5为本发明正视图；

图6为本发明左视图；

图7为本发明仰视图。

图中：10、釜体；11、上釜体；12、下釜体；13、固定件；20、温度检测组件；30、搅拌组件；31、电机；32、联轴器；33、电机底座；34、搅拌杆；35、搅拌桨；50、感应电棒；51、电棒控制器；52、电棒主体；53、电棒温度检测盒；54、电棒安装座；110、观测窗；111、原料进口；112、辅料进口；121、出料口；122、备用出口；521、电极片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了如图1中所示的一种高效的外泌体分离纯化方法，包括，

将母液在0-4℃温度中孵育3 min；

将母液加载负离子于囊泡的双磷脂膜表面；

将加载负离子的排斥处理得到外泌体初分离物；所述加载负离子后排斥处理方法包括利用硫酸根SO

对外泌体初分离物洗刷后脱电荷得到外泌体原液；所述洗刷外泌体初分离物后脱电荷方法包括：利用二价阳离子Ca

所述母液为良性囊泡母液，所述良性囊泡母液包括：围产期干细胞、外周血来源或者脐血来源的单个核细胞中的任何一种；本实施例中，所述围产期干细胞包括：羊膜干细胞来源的外泌体、脐静脉血管内皮细胞来源的外泌体，华通氏胶干细胞来源的外泌体。

本发明另提供一种制备高效的外泌体分离纯化方法的分离装置，如图2、图5、图6所示，所述分离装置包括：

釜体10；所述釜体10包括：

上釜体11；

与上釜体11匹配构成搅拌空腔的下釜体12；

如图4所示，用于使所述上釜体11和下釜体12密封的固定件13；所述上釜体11为半球型，其底部中点位置设置有通孔，远离底部的沿边与下釜体12的一端相抵触，所述下釜体12为一端开口的空心圆柱体结构，且所述下釜体12设置有用于输出成品的出料口121，以及备用出口122，所述出料口121设置于底部的中点位置，并于通孔呈同轴分布；

其中，如图7所示，所述上釜体11设置有用于观察釜体10内部的观测窗110；

用于输入原料的原料进口111；

用于输入辅料的辅料进口112；

装配于釜体10用于在釜体10内搅拌的搅拌组件30；如图3所示，所述搅拌组件30包括：

装配于釜体10的电机底座33；

安装在电机底座33上用于提供动力源的电机31；

一端与电机31输出轴相连接的联轴器32；

连接在联轴器32另一端的搅拌杆34；

固定在搅拌杆34上用于流体循环的搅拌桨35；本实施例中，设置两个搅拌桨35，对称分布并固定于搅拌杆34的端部；

所述电机31、联轴器32、搅拌杆34呈同轴分布，所述联轴器32安装于电机底座33的腔体内，所述电机底座33包括上壳体与支撑架，所述上壳体为两端开口空心的圆柱体结构，其一端与所述电机31相固定，且在所述上壳体31的设有若干圆形的散热孔，并呈同一直线分布，所述上壳体的另一端与支撑架相连接，所述支撑架固定于釜体10上，所述上壳体的高度是支撑架高度的3倍，所述电机31与电棒控制器51相连接，电棒控制器51获取电棒温度检测盒53中电棒温度，所述电机31还与温度检测组件20相连接，所述温度检测组件20获取釜体10的温度，将釜体10内的温度与电棒温度检测盒53的温度相结合，发送运行指令给电机31，控制电机31的速度、搅拌方式以及间隔运行时间；通过采集的数据，对电棒主体的功率进行实时调整；

设置于釜体10用于加载负离子于囊泡的感应电棒50；所述感应电棒50包括：

装配在釜体10上的电棒安装座54；

设置于电棒安装座54用于获取电棒主体52的电棒温度检测盒53；

套接于电棒温度检测盒53的电棒主体52；

与电棒主体52相连接的电棒控制器51；

所述电棒主体52与搅拌杆34平行分布，两者之间的间距为釜体10内径的2/5,所述电棒主体52上设置至少一组电极片521；本实施例中，设置两组电极片521，分别设置在电棒主体52相对称的侧边，而两组电极片521呈上下错位分布；

所述釜体10的上方设置有用于测量釜体10内温度的温度检测组件20；

所述温度检测组件20包括：

设置于釜体10内的温度传感器；

与温度传感器相连接的温度控制器；

所述温度控制器安装于电机底座33上；

通过可拆卸式的釜体10解决了清洗繁杂的问题，通过对温度检测组件20以及电棒温度检测盒53的温度的分析，控制搅拌组件30的工作模式和方式，提高了分离的效率，通过电棒控制器51对电棒主体52的控制，根据不同的容量和温度调整功率，提高了分离的效率；本装置也可以分离母细胞膜或囊泡；

该高效的外泌体分离纯化方法及制备装置，不需要借助大型设备，采用感应电棒对外泌体进行电荷负载，通过异性吸附纳米管及管壁导流槽和排斥装置得到大量的稳定的均一的外泌体囊泡；有效提升外泌体分离纯度，缩短分离时间、提高外泌体回收效率、提高处理样本通量、降低外泌体分离所需试剂及耗材成本，本发明分离得到的高纯度外泌体可用于药物包裹Westernblot，粒径分析，电镜检测等多种实验；

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。