一种Ir金属基生物催化剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种Ir金属基生物催化剂及其制备方法和用途，属于生物催化材料领域。

背景技术

卵巢癌（ovarian cancer）被认为是最具侵袭性的妇科肿瘤，以上皮性卵巢（Epithelial ovarian cancer，EOC）癌为主。虽然卵巢癌发病率次于宫颈癌和子宫内膜癌，但死亡率却高居妇科肿瘤首位，因此被称为“沉默的杀手”。我国女性卵巢癌新发病例为52100例/年，死亡病例达22500例/年。全球范围内卵巢癌新发病例和死亡病例人数逐年上升，2020年新发病例超过31万例，新增死亡人数接近21万。由于解剖位置深在，早期多无明显临床症状，超过80%以上的患者发现时已为中晚期。手术治疗联合以铂类药物为基础的化疗目前仍是卵巢癌最主要的治疗手段。但临床数据显示，理想的肿瘤细胞减灭术大约只有10%~20%（CA: A Cancer Journal for Clinicians），而化疗药物杀死癌细胞的同时也会导致不同程度的副作用，如骨髓抑制、消化道反应等。同时，由于肿瘤复发和化疗耐药的影响，晚期卵巢癌患者整体预后不佳，5年生存率不到30%（随着肿瘤疾病研究的不断深入，许多创新和高效的治疗方式也被不断提出和尝试）。

另外一方面，卵巢癌化疗的一线方案主要包括铂类药物（顺铂、卡铂）在内的联合化疗。该方案的缺点：顺铂是主要作用于G2/M期的细胞周期非特异性药物，并存在许多副反应（肾脏毒性、神经毒性、骨髓抑制、恶心呕吐）；对铂类药物过敏及耐药患者比例不断增加；高复发率（卵巢癌细胞大部分仍处于休眠阶段，并逃避抑制这些药物的作用。肿瘤复发是在药物的细胞毒性作用消退后，由非增殖细胞引起。G0细胞对化疗不敏感，往往成为日后癌症复发的根源）。

声动力治疗（Sonodynamic therapy，SDT）作为新兴的无创治疗手段而备受关注。1989年，Yumita等人基于光动力疗法（photodynamic therapy,PDT）提出了SDT。目前，声动力（SDT）已经被作为治疗局部肿瘤的潜在临床方法，即利用超声激发产生更高的活性氧（ROS），如单线态氧、羟基自由基等。通过对时间和空间管理，ROS可以精确地在肿瘤组织中产生，从而最大限度地减少副作用。要实现声动力效果，声敏剂是必不可少的。卟啉及其衍生物是最常见的被广泛应用的有机和生物相容性的声敏剂。另一方面，利用肿瘤微环境(TME)的酸性和过氧化氢(H

发明内容

针对上述缺陷，本发明通过采用卟啉或其衍生物（如5,10,15,20-4吡啶基卟啉（TPyP））和铱盐（如三氯化铱（IrCl

本发明的技术方案：

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种Ir金属基生物催化剂，所述催化剂为Ir金属团簇通过Ir-N键连接卟啉形成的配位聚合物。

进一步，所述配位聚合物为非晶结构，同时所述Ir金属团簇为纳米级晶体结构。

进一步，所述Ir金属基生物催化剂具有POD、OXD和酸性条件下的CAT活性。所述酸性条件下的CAT活性是指可在酸性条件下产氧，从而缓解肿瘤微环境乏氧情况。

进一步，所述Ir金属基生物催化剂为块状材料。

本发明要解决的第二个技术问题是提供上述Ir金属基生物催化剂的制备方法，所述制备方法为：将卟啉或其衍生物与铱盐的共混溶液经水热法制得所述生物催化剂。

进一步，所述卟啉选自：具有吡啶基的卟啉，更进一步的，所述卟啉为5,10,15,20-4吡啶基卟啉、四-(2-吡啶基)卟啉、5,15-二(4-吡啶基)-10,20-二苯基卟啉中的至少一种。

进一步，所述铱盐为IrCl

进一步，所述卟啉和铱盐的摩尔比为1 :0.5~ 4；摩尔比优选为1:2。

进一步，所述卟啉与铱盐的共混溶液采用下述方法制得：将卟啉或其衍生物、高分子表面活性剂和酸充分溶解后形成溶液A；将铱盐溶解于去离子水中，得到溶液B；随后，在剧烈搅拌下，将溶液B加入溶液A中，搅拌得共混溶液。

其中，剧烈搅拌是为了使溶液A和B充分混合。

进一步，所述水热法的条件为：在80 ~ 200℃下反应6 ~ 15h；

更进一步，所述Ir金属基生物催化剂的制备方法为：先将卟啉或其衍生物和稳定调节剂溶解于酸中，超声溶解20 ~ 60min后搅拌混匀得到溶液A；再将金属盐溶解在去离子水中得到溶液B；剧烈搅拌下，将溶液B缓慢加入到溶液A中，搅拌20 ~ 60min后，在80~200℃下反应6~15h；最后经洗涤、离心、烘干、研磨，得到金属卟啉配位聚合物。

进一步，作为优选方案，超声溶解时间为30min，搅拌时间为30min，180℃下反应12h。

进一步，所述高分子表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。

进一步，所述金属盐为：三氯化铱水合物。

进一步，所述酸为盐酸，作为优选方案，所述盐酸的浓度为0.01M。

进一步，所述离心采用去离子水离心洗涤至少三次，离心转速为7000~10000rpm(优选为8000rpm)，每次离心时间为8~15min(优选为10min)。

进一步，所述烘干指在40~60℃(优选为60℃)，干燥至少24h。

本发明要解决的第三个技术问题是提供所述Ir金属基生物催化剂在制备具有抗氧化功能的生物材料中的用途。

进一步的，本发明公开了所述Ir金属基生物催化剂用于制备肿瘤治疗药物或抗氧化药物中的用途。进一步，本发明催化剂与SDT联合作用能够达到良好的协同处理效果，能够实现有效杀伤肿瘤细胞并有效激活体内免疫的治疗目的。

本发明要解决的第四个技术问题是提供了一种增强所述Ir金属基生物催化剂活性的方法。

进一步，所述增强活性的方法在于利用超声照射处理，所述超声照射条件为功率0.5 ~2.5 W/cm

本发明有益效果：

1、本发明Ir金属基生物催化剂具有POD、OXD活性；且本发明Ir金属基生物催化剂具有超高的POD活性，同等条件下，TPyP-Ir的POD活性远远优于其他金属卟啉配位聚合物，如TPyP-Pd、TPyP-Pt、TPyP-Rh和TPyP-Ru。

2、本发明Ir金属基生物催化剂具有在酸性条件下的CAT活性，即可在酸性条件下产氧，缓解肿瘤微环境乏氧情况。

3、本发明Ir金属基生物催化剂具有优异的产氧性能，其在超声作用下产生

4、本发明Ir金属基生物催化剂为声敏剂，在超声照射作用下，可明显促进卟啉基声敏剂催化生成单线态氧，具有协同抗肿瘤作用，可大幅提升对肿瘤的抑制和清除作用。

5、本发明Ir金属基生物催化剂利用卟啉的共轭有机结构将CDT和SDT集成在一个纳米平台的材料上，能够达到良好的协同处理效果，实现有效杀伤肿瘤细胞并有效激活体内免疫的治疗目的。声动力可以诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡，即在细胞死亡的同时，细胞表面能诱导具有免疫原性的蛋白分子在细胞表面表达，随后激发机体抗肿瘤免疫反应并诱导细胞毒性T细胞（CTL），产生强大的抗肿瘤免疫反应并可以引起长期的免疫应答，更有效地杀伤肿瘤细胞，从而达到更理想的抗肿瘤作用。

6、本发明Ir金属基生物催化剂利用一锅法自组装形成，方法简单便捷。

附图说明

图1为TPyP-Ir的合成示意图。

图2a为TPyP-Ir的SEM图，图2b为TPyP-Ir的HAADF-STEM图，图2c 为TPyP-Ir中Ir纳米团簇的粒径统计图，图2d为对应的EDX元素映射图，图2e为选区电子衍射图，图2f为TPyP-Ir的AC HAADF-STEM图，图2g为f中Ir纳米团簇的Ir原子强度分布图。

图3a为TPyP-Ir的FT-IR谱图，图3b为TPyP-Ir的局部放大FT-IR谱图。

图4为TPyP-Ir的XRD谱图。

图5a为TPyP-Ir的XPS光谱图，图5b为TPyP-Ir的Ir 4f谱图，图5c为TPyP-Ir的N 1s谱图。

图6a为TPyP-Ir与对照样Ir箔和IrO

图7a为Ir箔的Ir L

图8a为TPyP和TPyP-Ir在H

图9a为不同浓度H

图10为 TPyP-Ir催化氧化TMB过程中的自由基猝灭试验图。

图11为 DPA探针检测

图12a为pH 4.5条件下，TPyP-Ir在不同H

图13为POD活性测试图。

图14为体外生物安全性检测图，图14A为荧光显微镜图，其中显示TPyP-Ir与HUVECs共孵育24 h后，不同浓度组别细胞显示为被标记为绿色荧光的活细胞较多，被标记为红色荧光的死细胞较少（标尺：50 μm），图14B细胞存活率定量统计图, 图14C为红细胞血液相容性图，其中：SPSS为阴性对照组，纯水为阳性对照组，图14D为酶标仪545 nm处血溶血率统计分析图，表明各组别溶血率均小于5%。

图15为荧光显微镜图。

图16为活细胞和死细胞进行计数后进行统计分析图。

图17为Annexin V/PI细胞凋亡检测流式分析图。

图18 为DCF荧光强度的半定量分析图。

图19为CRT及HMGB-1免疫荧光结果分析图，图19A为激光共聚焦观察不同组别细胞表面CRT荧光信号表达的强弱图（标尺：20 μm），图19B为用Image J对细胞表面CRT荧光强度进行定量后统计分析图，图19C为激光共聚焦观察不同实验组细胞核内HMGB-1荧光信号强弱图（标尺：20 μm），图19D为用Image J对细胞核内HMGB-1荧光强度进行定量后统计分析图。

图20A为显微镜下观察各组别Tranwell小室中RAW 264.7发生迁移的数量图（标尺：200 μm），图20B为用Image J对迁移的细胞进行计数后统计分析图，图20C为流式细胞术检测各实验组巨噬细胞CD86、iNOS、CD163标记物表达情况图，图20D为CD86

图21为 TPyP-Ir 与SDT联合作用体内抗肿瘤免疫效果图，图21A为治疗结束后各实验组小鼠移植瘤解剖图，图21B为接种及治疗后小鼠体重图，图21C为治疗结束后各实验组小鼠移植瘤质量图。

图22为肿瘤切片H&E染色、Ki67染色、Tunel染色和CRT染色图。

图23为小鼠心、肝、脾、肺、肾等主要正常器官的H&E染色图。

图24为肿瘤凋亡和细胞增殖水平图， 图24A为Ki-67染色图，图24B为Tunel染色图，图24C为CRT荧光强度定量分析图。

图25a为淋巴结DC细胞成熟度流式直观图，图25b为淋巴结DC细胞成熟度统计学分析图。

图26脾脏T淋巴细胞流式分析，图26A为CD3

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实例范围之中。

本发明实施例中所用原料与试剂见表1。

表1原料及其纯度、生产厂家信息表

上述所有原料购买后未做其他处理。除非另行说明，其他未提到的药品均来自于中国阿拉丁试剂公司；本章所使用的溶剂均来自于成都科龙试剂公司。此外，本章所用的去离子水均为成都优普生物科技公司所产的超纯水机自制。

实验主要仪器见表2。

表2 实验仪器及其型号、厂家信息表

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实施例1 TPyP-Ir的合成

首先，将5,10,15,20-4吡啶基卟啉（TPyP）（0.06 g, 0.096 mmol）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（M.W. 10000, 30 mg）一起搅拌溶解在30 ml 0.01 M的稀盐酸中，超声溶解30 min后搅拌过夜形成溶液A。将IrCl

对比例1~4

采用上述实施例中的方法，改变金属盐及其用量，制备得到TPyP-Pd（对比例1）、TPyP-Pt（对比例2）、 TPyP-Rh（对比例3）、TPyP-Ru（对比例4），以及设置空白对照TPyP（control组）。

试验例1 材料形貌和结构表征

在水热条件下，TPyP与Ir前驱体（IrCl

利用红外光谱研究了TPyP-Ir的化学结构，如图3a的TPyP-Ir的FT-IR谱图，图3b的TPyP-Ir的局部放大FT-IR谱图所示，根据TPyP 的傅里叶变换红外光谱，3315 cm

为了阐明TPyP-Ir的电子结构，我们对其进行了x射线吸收光谱（XAS）和x射线光电子能谱（XPS）测量。XPS证明TPyP-Ir样品中存在C、N和Ir元素，其中Ir原子含量为2.76%（图5a）。根据窄扫XPS光谱进一步分析了Ir的价态，谱图证明Ir主要以0价Ir（60.88 eV）和4价Ir（61.87 eV）的形式存在，这与Ir团簇和Ir的配位状态相符合（图5b）。在高分辨的N 1s光谱中，TPyP-Ir的N峰均向高结合能方向移动，说明Ir与卟啉N的成功配位（图5c）。

XAS进一步分析了材料的精细结构。如图6a所示，Ir的L

试验例2 体外性能表征

2.1 试验方法

过氧化物酶（POD）活性检测

为了检测TPyP-Ir配位聚合物的过氧化物酶活性，以TMB为底物检测H

过氧化物酶稳态动力学计算

室温下测试TPyP-Ir的稳态动力学。先将25 μL TPyP-Ir（4 mg/mL）加入到1000 μLNaOAc/HOAc缓冲液（0.1 M，pH 4.5）中，随后加入24 μL TMB（10 mg/mL，DMF做溶剂）和不同浓度的H

（1）

式中，V

（2）

其中，K

氧化物酶（OXD）活性检测

检测TPyP-Ir配位聚合物的氧化物酶活性时，在不加入H

氢乙啶(HE)检测•O

HE是一种特异性的探针，可以与•O

9,10-蒽醌（DPA）检测

将50 μg mL

酸性条件下O

将100 mM H

2.2 试验结果：

在成功表征了TPyP-Ir的形貌和化学结构后，我们进一步用典型的TMB比色法研究其仿过氧化物酶（POD）和氧化物酶（OXD）性能。具有POD活性的催化剂可以通过催化H

随后，基于TPyP-Ir超高的POD活性，我们进一步探究了TPyP-Ir的POD动力学。图9a展示了在不同浓度H

随后，用自由基猝灭试验鉴别TPyP-Ir催化底物H

超声增强材料体外产活性氧性能

受TPyP-Ir强催化活性启发，首先使用9,10-二苯蒽醌(DPA)法评估TPyP-Ir介导的SDT效应产生

另一方面，通过测量TPyP-Ir对H

随后，我们探究了不同贵金属（Pd、Pt、Rh和Ru）配位聚合物是否有同样优异的性能，采用TPyP-Ir的合成方法，得到了TPyP-Pd、TPyP-Pt、TPyP-Rh和TPyP-Ru。测试它们的POD活性（图13），结果表明，只有TPyP-Ir具有高效的POD活性，其他贵金属没有此活性。

试验例3 细胞实验

3.1 试验方法

细胞毒性

人脐静脉内皮细胞(HUVECs)按照1×10

溶血实验

收集新西兰大白兔血细胞，与浓度分别为25、50、100的TPyP-Ir在37℃下培养60min，然后离心吸取上清液检测溶血情况。分别以PBS培养液中的血细胞和不添加TPyP-Ir的蒸馏水中的血细胞作为阴性对照和阳性对照。

摄取实验

将含TPyP-Ir的水相与含有Cy5荧光染料的有机相混合后挥发有机相，制备Cy5荧光标记的TPyP-Ir（Cy5/TPyP-Ir）。将ID8细胞按照5×10

活/死荧光检测

将ID8细胞按照5×105个/孔的密度接种于24孔板后培养24小时，加入含TPyP-Ir(100µg mL-1)的完全培养基(pH 6.5)与ID8细胞共孵育24小时，然后进行US照射(0.8 MHz,1 W/cm

流式检测细胞凋亡

将ID8细胞按照5×10

细胞内ROS生成的检测

将ID8细胞按照5×10

免疫原性死亡诱导

将ID8细胞按照5×10

巨噬细胞激活

将ID8细胞按照5×10

肿瘤模型

雌性C57BL/6小鼠购自北京华富康生物科技有限公司。用细针将处于对数生长期的ID8细胞100 μL(约1×10

体内抗肿瘤效果验证

当肿瘤体积达到150~ 200mm

统计学分析

采用SPSS 22.0进行统计分析。连续变量表示为平均值±标准差。当数据符合正态分布且满足方差齐性时，两组均值比较采用t检验;多组间均值比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)检验，两两比较采用LSD检验。如果不满足上述条件, Wilcoxon秩和检验将用于两组之间的比较, Kruskal Wallis秩和检验可用于多个组之间的比较，和Nemenyi测试将用于两组之间的比较。所有检验均为双侧检验，p＜0.05为有统计学意义。

3.2 细胞试验结果：

受TPyP-Ir优异的体外生物催化性能的启发，我们在细胞水平评估了TPyP-Ir与声动力联合抗肿瘤免疫治疗的效果。首先，在 HUVECs中利用钙黄素乙酰氧甲基(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)检测TPyP-Ir的细胞毒性。当TPyP-Ir浓度小于200 µg/mL时，24小时内对正常细胞无明显的毒性作用 (图14A和图14B)。此外，溶血实验表明，当TPyP-Ir浓度小于200µg/mL时，溶血率低于5%(图14C和图14D)。这些结果表明了它们在体外治疗中的良好的生物安全性。

为了检测TPyP-Ir与声动力协同作用后对ID8细胞杀伤能力，利用Calcein-AM和PI染料将不同措施干预后的细胞进行荧光标记；如图15所示，空白对照组（Control组）及单纯US组细胞几乎无损伤，TPyP-Ir组死亡细胞逐渐增多，而TPyP-Ir + US组死亡细胞最多。同时，对死亡细胞的定量分析如图16所示，表明TPyP-Ir和SDT协同能够实验有效的抗肿瘤治疗。

然后，利用荧光素-annexin V和碘化丙啶(PI)染色分析流式细胞术分析抗肿瘤机制。根据荧光标记情况将细胞群划分为4个象限：活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。定量分析各组凋亡细胞比例(图17)。结果表明TPyP-Ir+US细胞凋亡率显著(高达70%左右)，而Control组及单纯US组细胞几乎没有凋亡，TPyP-Ir处理组细胞凋亡率较低（约23%）。

以2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光显微镜观察细胞内活性氧(ROS)的产生。DCFH-DA能与活性氧(ROS)反应生成具有绿色荧光的2,7-二氯荧光素(DCF)。如图18所示，Control组及单纯US组仅有极少数细胞发出绿色荧光。TPyP-Ir处理组细胞荧光强度高于Control组及单纯US；而TPyP-Ir + US组的荧光明显高于Control组、US组以及TPyP-Ir。图18中对DCF荧光强度的半定量分析也显示Pd-Pta/Por+US+L基团的平均荧光强度最高。

此外，为了评估TPyP-Ir 与SDT联合作用后诱发免疫原性死亡（ICD）的能力，首先利用钙网蛋白CRT外翻情况检测不同干预后ID8细胞释放损伤相关分子模式（DAPMs）的情况。免疫荧光染色及半定量分析结果如图19，图19A为激光共聚焦观察不同组别细胞表面CRT荧光信号表达的强弱图（标尺：20 μm），图19B为用Image J对细胞表面CRT荧光强度进行定量后统计分析图，图19C为激光共聚焦观察不同实验组细胞核内HMGB-1荧光信号强弱图（标尺：20μm），图19D为用Image J对细胞核内HMGB-1荧光强度进行定量后统计分析图。其中显示，Control组细胞表面几乎不表达CRT，单纯US组细胞表面CRT极少量表达，但表达量与Control组相比无统计学差异，TPyP-Ir组细胞表面CRT表达相较于Control组明显增多，TPyP-Ir + US组表面CRT表达量为四组中最多，且均有统计学差异。

其次，我们坚持了不同措施干预后巨噬细胞极化能力的差异，利用流式分析检测巨噬细胞向M1型及M2型表型极化的比例，结果如图20，图20A为显微镜下观察各组别Tranwell小室中RAW 264.7发生迁移的数量图（标尺：200 μm），图20B为用Image J对迁移的细胞进行计数后统计分析图，图20C为流式细胞术检测各实验组巨噬细胞CD86、iNOS、CD163标记物表达情况图，图20D为CD86

受体外协同治疗效果的启发，我们进一步评估了TPyP-Ir 与SDT联合作用体内抗肿瘤免疫效果，如图21所示，我们在雌性C57BL/6小鼠体内对同源肿瘤移植进行TPyP-Ir联合SDT抗肿瘤效果评价。治疗期间每两天记录每只小鼠的体重和肿瘤体积，图21A为治疗结束后各实验组小鼠移植瘤解剖图，图21B为接种及治疗后小鼠体重图，各组间体重无显著差异。与Control组及单纯US组，TPyP-Ir组肿瘤生长受到一定抑制，而TPyP-Ir + US组肿瘤抑制效果最强，可达50%(图21C)。通过分析不同组别肿瘤的平均体积也证实了这种联合治疗方法的有效性。

如图22显示，对各组肿瘤切片进行苏木精和伊红(H&E)染色，显示其良好的抑瘤效果。Control组和单纯US组肿瘤细胞维持正常形态，未见明显组织损伤; TPyP-Ir肿瘤轻度破坏，而TPyP-Ir + US组肿瘤细胞核明显凝聚，具有典型的组织病理学损伤。此外，如图23所示，治疗后小鼠心、肝、脾、肺、肾等主要正常器官的H&E染色图像未见明显组织损伤，提示TPyP-Ir和SDT联合治疗的方法具有较高的安全性。

采用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP末端标记(TUNEL)和Ki-67染色分别研究肿瘤凋亡和细胞增殖水平。Ki67染色结果见图24A，显示TPyP-Ir + US 组阳性细胞比例最低，且明显低于其余三组。而Tunel染色结果显示TPyP-Ir + US组阳性细胞比例最高，且明显低于其余三组(图24B)。钙网蛋白(CRT)暴露在细胞表面是免疫原性细胞死亡的一个明显的生物标志物。一旦到达肿瘤细胞表面，CRT就充当了“eat me”的信号，刺激巨噬细胞和树突状细胞吞噬死亡的细胞及其凋亡碎片。TPyP-Ir + US所引起的CRT信号强度远高于其他组（图24C）。同时，从肿瘤区域巨噬细胞浸润情况分析可知，TPyP-Ir + US处理后巨噬细胞向M1型转换的比例明显增加，并高于其他三组，能够有效发挥抗肿瘤性能。同时，利用流式细胞术分析了小鼠脾脏中CD4

这些检测结果明确证实了TPyP-Ir 与SDT联合作用能够达到良好的协同处理效果，能够实现有效杀伤肿瘤细胞并有效激活体内免疫的治疗目的。