高延展透明的丝胶蛋白水凝胶制法及其所得水凝胶与应用

技术领域

本发明属于生物医用复合材料领域，具体为一种高延展透明的丝胶蛋白水凝胶制法及其所得水凝胶与应用。

背景技术

丝胶蛋白是由家蚕分泌的一种天然蛋白，年产量丰富且具有抗菌、抗冻、抗氧化、抗炎、抗癌、保湿、无免疫原性以及生物相容性等活性。除此之外，丝胶蛋白含有大量便于交联和修饰的氨基、羟基、羧基等活性基团，被认为是理想的天然医用生物材料。

目前，丝胶蛋白已被用于制备成多种生物材料应用于组织工程，如水凝胶、微球、薄膜、海绵、支架等。其中，对丝胶蛋白水凝胶的研究最多，提取丝胶蛋白的方法以及制备丝胶蛋白水凝胶的方法多种多样。例如，公开号为CN112646204A的专利公开了一种高温高压法提取丝胶蛋白的方法，但其制备出的水凝胶透明度较差；公开号为CN103951831A的专利公开了一种利用溴化锂提取丝胶蛋白的方法，并通过使用交联剂制备丝胶蛋白水凝胶的方法，但其制备出的水凝胶机械性能较差；公开号为CN110041536A的专利公开了一种超声处理丝胶蛋白溶液制备丝胶蛋白水凝胶的方法，但其制备出的水凝胶延展性较差。现如今，丝胶蛋白水凝胶因为其不同的特性被广泛应用于组织工程中，以满足不同类型的组织修复和再生需求。

丝胶蛋白水凝胶较差的机械性能以及透明性限制了其在组织工程和生物医学领域的应用。采用超声法制备的丝胶水凝胶在一定程度上解决了其透明性的问题，但是超声法制备的丝胶水凝胶机械性能较差。而以高温高压法制备的丝胶水凝胶虽然在一定程度上优化了水凝胶的机械性能，但其在透明性、延展性等方面不尽如人意。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明目的是提供一种制备工艺简单方便、具有独特微观结构、高延展、透明的丝胶蛋白水凝胶的制备方法，本发明的另一目的是提供一种机械强度高、透明性好、具有独特微观结构的丝胶蛋白水凝胶，本发明的再一目的是提供一种具有独特微观结构的丝胶蛋白水凝胶在可视化创伤敷料及导管中的应用。

技术方案：本发明所述的一种高延展透明丝胶蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)在标准环境下饲养丝素缺失突变型家蚕，直至家蚕生长至5龄成熟；

(2)解剖成熟5龄家蚕，从蚕体内取出完整丝腺，并用超纯水漂洗后剪断，将其悬挂在EP管口，收集从丝腺中流出的丝胶蛋白溶液；

(3)向步骤(2)所得丝胶溶液中，加入酸，室温静置，待水凝胶形成后，将其取出并用超纯水冲洗，能够以去除余量的酸。

进一步地，步骤(1)中，标准环境的温度为20～30℃，湿度为40％～80％。丝素缺失突变型家蚕为140Nd-s或139Nd-s。

进一步地，步骤(2)中，漂洗的次数为3～10次。丝胶蛋白溶液的质量百分数为2～20wt％。

进一步地，步骤(3)中，酸为甲酸、乙酸、丙酸、盐酸、柠檬酸中的任意一种。酸优选为甲酸。静置时间为5～20min。冲洗次数为5～10次。

上述丝胶蛋白水凝胶的制备方法所得丝胶蛋白水凝胶，其表层最为致密，由表层向内，致密程度呈下降趋势，孔径增大，孔壁厚逐渐变薄；所述水凝胶的孔壁呈径向走向，其孔隙率为63％～84％，延展率为700％～852％，断裂强度为300～403kPa。

本发明所述的一种丝胶蛋白水凝胶在可视化创伤敷料及面膜中的应用。

制备原理：白色的高浓度丝胶蛋白溶液在极性溶剂的作用下沉淀形成水凝胶。高延展性既与水凝胶独特的微观结构有关，也与采用的丝胶蛋白为结构未破坏的天然蛋白有关。

有益效果：本发明和现有技术相比，具有如下显著性特点：

1、采用高浓度丝胶蛋白溶液和酸能够制得高延展性能、透明性好的丝胶蛋白水凝胶；

2、采用解剖丝素缺失型家蚕的方法获取高浓度且未被破坏的白色丝胶蛋白溶液，所制备的丝胶蛋白水凝胶最大延展量可达852％，远高于前期已报道的纯丝胶水凝胶的延展长度；

3、该水凝胶呈现独特的多孔结构，水凝胶的表层最为致密，其由表层向内其致密程度呈下降趋势，孔径由表向内也逐渐增大且孔壁厚随之变薄；内部孔大且孔壁较薄。孔隙率由表向内也逐渐增加；此外，水凝胶的孔壁呈径向走向(与水凝胶高延展方向相同)；这种独特的结构不仅使水凝胶具有高延展性，而且层次分明的结构为水凝胶在不同层负载大小不同的细胞、药物或高分子活性分子提供了便利；

4、该水凝胶具有良好的生物相容性，可作为可视化创伤敷料应用在皮肤组织工程中或作为面膜材料应用于医美领域。

附图说明

图1是本发明的制备流程图；

图2是本发明实施例1所得丝胶蛋白水凝胶低温处理冻干后的微观结构图；

图3是本发明实施例1中丝胶蛋白水凝胶在不同pH条件下的溶胀率曲线图；

图4是本发明实施例1中丝胶蛋白水凝胶在不同pH条件下的降解率动力学曲线图

图5是本发明实施例1中丝胶蛋白溶液和丝胶蛋白水凝胶的傅立叶红外光谱图；

图6是本发明实施例1中丝胶蛋白溶液和丝胶蛋白水凝胶的傅立叶红外光的数据处理图，其中，A为丝胶蛋白溶液的红外光的数据处理图，B为丝胶蛋白水凝胶的傅立叶红外光的数据处理图；

图7是本发明实施例1中丝胶蛋白溶液和丝胶蛋白水凝胶的X衍射谱图；

图8是本发明实施例1中丝胶蛋白水凝胶的延展应力-应变曲线；

图9是本发明实施例1中丝胶蛋白水凝胶的抗氧化性能图；

图10是本发明实施例1中丝胶蛋白水凝胶细胞相容性示意图，其中，A为细胞黏附率示意图，B为细胞毒性检测示意图。

具体实施方式

以下各实施例中，无水甲酸(AR，98％)购自阿拉丁公司，丝素缺失突变型家蚕均由中国农业科学院蚕业研究所保存并向外商业化提供。

实施例1

如图1，一种高延展透明丝胶蛋白水凝胶的制备方法，包含以下步骤：

(1)在温度为25℃、湿度为65％的标准环境下饲养丝素缺失突变型家蚕，直至家蚕生长至5龄成熟；

(2)将步骤(1)的家蚕解剖后，从蚕体内取出完整丝腺，将丝腺放入超纯水中漂洗，漂洗后取出放入干净的超纯水中再次漂洗，如此重复5次，洗去丝腺外层的蚕血，将漂洗后的丝腺从中间剪断，将两截丝腺悬挂在EP管口，收集从丝腺中流出的白色丝胶蛋白溶液，丝胶蛋白溶液的质量百分数为16wt％；

(3)在直径为60mm的培养皿中加入2mL丝胶蛋白溶液，再加入过量甲酸，静置15分钟，在甲酸的作用下形成水凝胶，再从培养皿中取出丝胶水凝胶，用超纯水反复冲洗5次，以去除甲酸。

将实施例1所得丝胶蛋白水凝胶进行性能检测，结果分析如下：

a、丝胶蛋白水凝胶的透明性

该丝胶蛋白水凝胶由丝胶蛋白与甲酸交联获得，如图1所示水凝胶的颜色呈透明状。

b、丝胶蛋白水凝胶的微观结构

将实施例1所得的丝胶蛋白水凝样品冷冻干燥后，在扫描电子显微镜下观察。结果如图2所示，下部为水凝胶的表层，上部为内层，由下至上为水凝胶由表层向内层)丝胶蛋白水凝胶呈现独特的多孔结构，水凝胶的表层最为致密，其由表层向内其致密程度呈下降趋势，孔径由表向内也逐渐增大且孔壁厚随之变薄；内部孔大且孔壁较薄。孔隙率由表向内也逐渐增加。此外，水凝胶的孔壁呈现与高延展方向平行的趋势。这种独特的结构是导致这种水凝胶具有高延展性且硬度高的主要因素。

c、丝胶蛋白水凝胶的孔隙率

将实施例1所得的丝胶蛋白水凝胶分别在-20℃、-80℃预冷，并进行冻干，然后放入体积为V1的超超纯水中，记录此时的总体积V2，随后室温静置1小时，再取出水凝胶，记录此时剩余超超纯水体积为V3，再随机选取两块样品重复上述步骤，经过(V1-V3)/(V2-V3)*100％计算，可知-20℃处理的水凝胶样品孔隙率为69％，-80℃处理的样品孔隙率为78％，-196℃处理的样品孔隙率为80％。

d、丝胶蛋白水凝胶的溶胀率

首先，将丝胶蛋白水凝胶在-80℃的条件下冷冻干燥，对干燥后的样品进行称重，记录为W1；随后，将样品分别浸泡在pH 3.0、pH 7.4、pH 11.0的PBS溶液中，在特定时间点取出样品，去除表面多余的水分后再次称重，记为W2；通过(W2-W1)/W1计算可知丝胶水凝胶在不同pH条件下的溶胀率。

结果如图3所示，丝胶蛋白水凝胶在前42小时迅速膨胀且溶胀率达到最大，在pH3.0的环境下，水凝胶的最大溶胀率可达到2倍；pH 7.4环境下可达到2.4倍；pH 11.0环境下可达到2.7倍。从图中可以看出该丝胶蛋白水凝胶的膨胀特性具有pH响应性。

e、丝胶蛋白水凝胶的降解率

为了检测丝胶蛋白水凝胶的降解率，首先需要从同一批水凝胶样品中随机取出三块，进行称重、烘干、再称重，以此得出水凝胶的干湿比；随后将同批次水凝胶样品称重后，分别置于不同PBS(pH 3.0、pH 7.4、pH 11.0)溶液中浸泡，在特定的时间点取出，用超超纯水进行漂洗，再将水凝胶样品放入烘箱中烘干，称重；最后根据前文计算的干湿比计算水凝胶的降解率。

结果如图4所示，在不同的pH环境下，水凝胶的降解速率不同，在pH 11.0的条件下，水凝胶样品降解最快，5周累计降解了26％；其次是在pH 7.4的条件下，5周累计降解23％；水凝胶在pH 3.0的条件下降解最慢，5周累计降解18％。

f、丝胶蛋白溶液以及丝胶蛋白水凝胶的红外光谱和X衍射分析

采用傅立叶变换红外光谱仪(Nexus，Thermal Nicolet，USA)测定丝胶蛋白水凝胶在2000–800cm

结果如图5-7所示，图5和图6展示了丝胶蛋白溶液到丝胶蛋白水凝胶的二级结构变化，在丝胶蛋白溶液凝胶化的过程中，β-折叠结构在增多。图7则是丝胶蛋白溶液和丝胶蛋白水凝胶的XRD结果图，由图7中可以看出，在丝胶蛋白溶液凝胶化的过程中，19°处出现了衍射峰，对比已知丝胶蛋白晶体衍射峰可知，19°处的衍射峰代表的是丝胶蛋白水凝胶中的晶体部分。

g、丝胶蛋白水凝胶的机械性能检测

在长和宽分别为15mm和10mm的模具中制备丝胶蛋白水凝胶的延展样品，并用万能试验机对样品进行延展测试延展速度为5mm/min。

本发明采用从蚕体中蚕丝腺里提取的丝胶蛋白溶液用甲酸处理，制备出的水凝胶具有优异的机械性能。结果如图8所示，该丝胶蛋白水凝胶的最大延展量可达852％，延展模量为280kPa，断裂强度为403kPa。本发明的最大延展量远超过已报道的纯丝胶蛋白水凝胶。

h、丝胶蛋白水凝胶的抗氧化性能检测

以丝胶蛋白水凝胶对DPPH自由基的清除能力为标准来评估丝胶蛋白水凝胶的抗氧化性。首先，用无水乙醇配置0.2mmol/L的DPPH·乙醇溶液。其次，将丝胶水凝胶样品与DPPH·乙醇溶液按照1：3混合，避光放入37℃水浴中恒温振荡30分钟，此时溶液为待测样品，用无水乙醇代替丝胶蛋白水凝胶作为空白对照。最后，用无水乙醇校零紫外分光光度计后，检测待测溶液在517nm处的吸光度，记为S

结果如图9所示，丝胶蛋白水凝胶对DPPH自由基的清除率达到20％，说明本发明具有较好的抗氧化能力。

i、丝胶蛋白水凝胶的生物相容性

为了检测本发明的生物相容性，首先，将丝胶溶液直接滴加在24孔板和96孔板中，然后加入甲酸，静置15分钟；待丝胶蛋白水凝胶形成后，吸出甲酸，用超纯水反复漂洗水凝胶。在种细胞之前，需要用75％酒精对水凝胶进行消毒，并且浸泡在含10％胎牛血清的DMEM培养基中过夜。次日将小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)以3.6×10

应用1

将实施例1所得丝胶蛋白水凝胶应用于可视化创伤敷料，具体步骤为：

(1)在温度为25℃、湿度为65％的标准环境下饲养丝素缺失突变型家蚕，直至家蚕生长至5龄成熟；

(2)将步骤(1)的家蚕解剖后，从蚕体内取出完整丝腺，将丝腺放入超纯水中漂洗，漂洗后取出放入干净的超纯水中再次漂洗，如此重复5次，洗去丝腺外层的蚕血，将漂洗后的丝腺从中间剪断，将两截丝腺悬挂在EP管口，收集从丝腺中流出的白色丝胶蛋白溶液，丝胶蛋白溶液的质量百分数为16wt％；

(3)在12孔板中每孔加入1mL丝胶蛋白溶液，静置2分钟，然后再加入1mL无水甲酸，静置15分钟。丝胶液在甲酸的作用下形成水凝胶，然后从12孔板中取出丝胶水凝胶，用超超纯水反复漂洗5次，以去除甲酸，即可获得丝胶蛋白透明创伤敷料。

应用2

将实施例1所得丝胶蛋白水凝胶应用于神经导管，具体步骤为：

(1)在温度为25℃、湿度为65％的标准环境下饲养丝素缺失突变型家蚕，直至家蚕生长至5龄成熟；

(2)将步骤(1)的家蚕解剖后，从蚕体内取出完整丝腺，然后将丝腺采用无菌超超纯水中漂洗5次。接下来将漂洗后的丝腺从中间剪断并悬挂在EP管口，收集从丝腺中流出的白色丝胶蛋白溶液。丝胶蛋白溶液的浓度为16％(w/v)；

(3)将神经导管模具(实心硅胶材质圆柱体，体表有纵向沟槽，槽宽1mm,深mm，槽间距2mm)浸没在丝胶蛋白溶液中1分钟，然后取出吸附有丝胶液的模具并立即浸入到甲酸中，静置15分钟后取出，用超超纯水漂洗5次，以去除甲酸；然后用滤纸吸除表面多余的水分，获得表层覆盖丝胶水凝胶的导管模具；

(4)将步骤(3)获得的导管模具重新浸没于丝胶液中，1分钟后取出并立即浸入到甲酸中，静置15分钟后取出，用超超纯水漂洗5次，然后用滤纸吸除表面多余的水份。

(5)重复步骤4，直至模具表面丝胶水凝胶层达到所需厚度；

(6)将5中获得的样品两端的水凝胶切除，并将其放在平整且浸没在超超纯水的平台上，用手压着附有水凝胶在平台上滚动，待水凝胶与模具脱离后，然后轻轻抽出硅胶模具棒，即可获得具有高机械强度的丝胶蛋白神经导管。

一种透明丝胶蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)在温度为20℃、湿度为40％的标准环境下饲养丝素缺失突变型家蚕，直至家蚕生长至5龄成熟；

(2)将步骤(1)的家蚕解剖后，从蚕体内取出完整丝腺，将丝腺放入超纯水中漂洗，漂洗后取出放入干净的超纯水中再次漂洗，如此重复3次，洗去丝腺外层的蚕血，将漂洗后的丝腺从中间剪断，将两截丝腺悬挂在EP管口，收集从丝腺中流出的白色丝胶蛋白溶液，丝胶蛋白溶液的质量百分数为11wt％；

(3)在直径为60mm的培养皿中加入2mL丝胶蛋白溶液，再加入过量乙酸，静置5分钟，在乙酸的作用下形成水凝胶，再从培养皿中取出丝胶水凝胶，用超纯水反复冲洗10次，以去除甲酸。

本实施例所得丝胶蛋白水凝胶为外小内大的多孔结构。按照与实施例1相同的测试方法，测得其-20℃处理的水凝胶样品孔隙率为65％，-80℃处理的样品孔隙率为72％，-196℃处理的样品孔隙率为79％，延展率为700％，延展模量为271kPa，断裂强度为302kPa。

实施例2

一种高延展透明丝胶蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)在温度为30℃、湿度为80％的标准环境下饲养丝素缺失突变型家蚕，直至家蚕生长至5龄成熟；

(2)将步骤(1)的家蚕解剖后，从蚕体内取出完整丝腺，将丝腺放入超纯水中漂洗，漂洗后取出放入干净的超纯水中再次漂洗，如此重复10次，洗去丝腺外层的蚕血，将漂洗后的丝腺从中间剪断，将两截丝腺悬挂在EP管口，收集从丝腺中流出的白色丝胶蛋白溶液，丝胶蛋白溶液的质量百分数为20wt％；

(3)在直径为60mm的培养皿中加入2mL丝胶蛋白溶液，再加入过量丙酸，静置20min，在丙酸的作用下形成水凝胶，再从培养皿中取出丝胶水凝胶，用超纯水反复冲洗9次，以去除甲酸。

本实施例所得丝胶蛋白水凝胶为外小内大的多孔结构。按照与实施例1相同的测试方法，测得其-20℃处理的水凝胶样品孔隙率为67％，-80℃处理的样品孔隙率为74％，-196℃处理的样品孔隙率为78％，延展率为769％，延展模量为278kPa，断裂强度为401kPa。

实施例3

一种高延展透明丝胶蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)在温度为22℃、湿度为50％的标准环境下饲养丝素缺失突变型家蚕，直至家蚕生长至5龄成熟；

(2)将步骤(1)的家蚕解剖后，从蚕体内取出完整丝腺，将丝腺放入超纯水中漂洗，漂洗后取出放入干净的超纯水中再次漂洗，如此重复6次，洗去丝腺外层的蚕血，将漂洗后的丝腺从中间剪断，将两截丝腺悬挂在EP管口，收集从丝腺中流出的白色丝胶蛋白溶液，丝胶蛋白溶液的质量百分数为5wt％；

(3)在直径为60mm的培养皿中加入2mL丝胶蛋白溶液，再加入过量盐酸，静置8分钟，在盐酸的作用下形成水凝胶，再从培养皿中取出丝胶水凝胶，用超纯水反复冲洗7次，以去除盐酸。

本实施例所得丝胶蛋白水凝胶为外小内大的多孔结构。按照与实施例1相同的测试方法，测得其-20℃处理的水凝胶样品孔隙率为66％，-80℃处理的样品孔隙率为77％，-196℃处理的样品孔隙率为77％，延展率为766％，延展模量为270kPa，断裂强度为397kPa。

实施例4

一种高延展透明丝胶蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)在温度为28℃、湿度为70％的标准环境下饲养丝素缺失突变型家蚕，直至家蚕生长至5龄成熟；

(2)将步骤(1)的家蚕解剖后，从蚕体内取出完整丝腺，将丝腺放入超纯水中漂洗，漂洗后取出放入干净的超纯水中再次漂洗，如此重复8次，洗去丝腺外层的蚕血，将漂洗后的丝腺从中间剪断，将两截丝腺悬挂在EP管口，收集从丝腺中流出的白色丝胶蛋白溶液，丝胶蛋白溶液的质量百分数为15wt％；

(3)在直径为60mm的培养皿中加入2mL丝胶蛋白溶液，再加入过量柠檬酸，静置10分钟，在柠檬酸的作用下形成水凝胶，再从培养皿中取出丝胶水凝胶，用超纯水反复冲洗8次，以去除甲酸。

本实施例所得丝胶蛋白水凝胶为外小内大的多孔结构。按照与实施例1相同的测试方法，测得其-20℃处理的水凝胶样品孔隙率为68％，-80℃处理的样品孔隙率为75％，-196℃处理的样品孔隙率为79％，延展率为816％，延展模量为273kPa，断裂强度为395kPa。

实施例5

本实施例其余步骤与实施例1均相同，区别仅仅在于：步骤(2)的超纯水漂洗次数分别为1次、3次、5次、8次、10次、12次、15次。进行丝胶蛋白溶液浓度和水凝胶性能测试，结果显示超纯水漂洗次数为3～10次时，丝胶蛋白溶液浓度合适且水凝胶成胶性能最佳。

实施例6

本实施例其余步骤与实施例1均相同，区别仅仅在于：步骤(3)的静置时间分别为3min、5min、7min、9min、12min、15min、18min、20min、23min。进行丝胶蛋白水凝胶力学性能检测，结果显示静置时间为5～20min时，丝胶蛋白水凝胶力学性能最佳。

实施例7

本实施例其余步骤与实施例1均相同，区别仅仅在于：步骤(3)的超纯水冲洗次数分别为1次、3次、5次、8次、10次、12次、15次。收集冲洗后的超纯水进行pH检测，结果显示冲洗次数为5～10次时，超纯水前后的pH无变化。

以上各实施例中，实施例1为最佳实施例，所得丝胶蛋白水凝胶综合性能最好。