一种脑钠肽免疫层析定量检测方法

技术领域

本发明涉及免疫层析技术领域，具体为一种脑钠肽免疫层析定量检测方法。

背景技术

脑钠肽是一种具有强力的利钠、利尿、扩血管和降压作用的多肽，最早是由日本学者在1988年从猪脑内分离从而得，并命名为BNP1。在这之后的研究表明，脑钠肽不只是BNP这一种多肽，而是有一组多肽在生物进化的过程中逐渐发展产生(在人类和脊椎动物至少包括ANP、BNP、CNP和DNP等)，统称为利钠肽(NP)家族。目前临床检测用的BNP主要有BNP和NT-proBNP两种，两者看似区别不大但是生物学效应完全不同，BNP主要由心室肌细胞合成和分泌，在心室负荷过重或扩张时增加，因此可用来反映心室功能改变,心肌细胞所分泌的BNP先以108个氨基酸组成的前体形式存在，即proBNP，当心肌细胞受到刺激后，可在活化酶的作用下裂解为由76个氨基酸组成的无活性直线多肽和32个氨基酸组成的活性环状多肽，即NT-proBNP和BNP，并释放入血液循环，BNP半衰期更短(22分钟)，可及时反应患者病情变化；NT-proBNP相对稳定(半衰期为120分钟)更便于临床应用。

在脑钠肽免疫层析定量检测方法中，信号的检测是关键的一步，它使我们能够定量测量脑钠肽的含量。通常会使用各种检测标记物来转换免疫反应生成的复合物信号为可测量的形式。

常用的检测标记物包括酶标记物和荧光标记物。其中，酶标记物常用的有辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)，荧光标记物常用的有荧光素酶(β-galactosidase)和荧光染料(如荧光素、荧光素同种异构体等)。对于酶标记物，一种常见的检测方法是将底物添加到夹心复合物上，通过酶反应产生可测量的信号。例如，辣根过氧化物酶(HRP)可以催化底物的氧化还原反应，产生发色的产物。通过测定产物的吸光度或发色强度，可以间接地反映脑钠肽的含量。另一种常见的信号检测方法是使用荧光标记物。荧光标记物可以与夹心复合物结合，并通过比色法、荧光定量法或荧光显微镜来检测信号。荧光标记物具有高灵敏度和选择性，可进行实时监测和定量分析。故而提出一种

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种脑钠肽免疫层析定量检测方法，具备提高检测脑钠肽灵敏度、提高检测精确度等优点，解决了现有技术检测脑钠肽时检测不够精确以及灵敏度低的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种脑钠肽免疫层析定量检测方法，包括以下步骤：

步骤一、荧光标记物使用量子点，先通过化学交联或生物分子间特异性作用将脑钠肽的特异性抗体连接到量子点的表面，得到抗体修饰后的量子点，所述抗体修饰后的量子点的发射波长范围为500nm到1300nm；

步骤二、将抗体修饰后的量子点放置在标记层上，且标记层上还放置有质控分子修饰后的量子点，所述质控分子修饰后的量子点与抗体修饰后的量子点的发射波长不同，其发射波长范围为550nm到1300nm，在层析层上分别设有定量检测带和质控检测带，其中质控检测带上设置有能与质控分子特异性结合的生物分子，定量检测带上设置有对应脑钠肽的与所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；

步骤三、当荧光免疫层析试纸条免疫层析后，检测定量检测带和质控检测带的荧光强度，并且用质控检测带的荧光强度校正定量检测带的荧光强度，进而实现脑钠肽的定量检测；

步骤四、荧光免疫层析的原理和检测方法为：采用荧光免疫层析技术及双抗体夹心法原理定量检测人样本(全血、血清或血浆)中脑钠肽的含量。检测时，首先向湿润孔中滴加缓冲液，然后将样本滴加到样品层上，样本先与标记层中的量子点标记物相混合，并沿着层析层向吸水层方向毛细运动，分别流经层析层上的定量检测带和质控检测带。当样本中含有脑钠肽时，脑钠肽与量子点表面的脑钠肽抗体结合，当层析至定量检测检测带时，会被预先存在于于该定量检测检测带的抗体捕获，从而与量子点表面的脑钠肽组成双抗体夹心复合物。使用荧光定量仪在光源激发下获取定量控制带和质控控制带的荧光信号强度，根据荧光定量仪获取的测量曲线，从而分析样本中脑钠肽浓度。

作为本发明的一种优选技术方案，所述荧光免疫层析试纸条由样品层、标记层、层析层、吸水层和底座构建，其中所述层析层为弱荧光层析层，底座具备低荧光的特性。

作为本发明的一种优选技术方案，所述抗体修饰后的量子点放置在标记层上，且标记层上还放置有质控分子修饰后的量子点，所述质控分子修饰后的量子点与抗体修饰后的量子点的发射波长不同，其发射波长范围为550nm到1300nm，在层析层上分别设有定量检测带和质控检测带，其中质控检测带上设置有能与质控分子特异性结合的生物分子，定量检测带上设置有对应脑钠肽的与所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体。

作为本发明的一种优选技术方案，所述荧光免疫层析试纸条免疫层析后，检测定量检测带和质控检测带的荧光强度，并且用质控检测带的荧光强度校正定量检测带的荧光强度，进而实现脑钠肽的定量检测。

作为本发明的一种优选技术方案，所述抗体修饰后的量子点设置有两组，其发射波长分别为650nm和900nm，所述质控分子修饰后的量子点设置有两组，其发射波长为570nm和600nm。

作为本发明的一种优选技术方案，所述量子点为单一化合物形成的量子点或几种化合物组成的复合量子点，所述化合物可选自MgS、ZnS、HgS、CdS、PbS、MgSe、ZnSe、CdTe、PbSe、MgTe、ZnTe、HgTe、InP、InAs其中一种或几种混合，并且可以加入铜、锰和汞。

作为本发明的一种优选技术方案，所述层析层在超过550nm处不含荧光剂或者荧光很弱，所述底板颜色为黑色且表面设置有不干胶，所述底板和不干胶均不含荧光剂，所述荧光免疫层析试纸条还包括能使样本中液体与细胞分离的过滤膜。

作为本发明的一种优选技术方案，所述荧光免疫层析试纸条的免疫层析为预润免疫层析，所述预润免疫层析先用缓冲液预润层析层后再将样本加入进样品层，当样本流入定量检测带和质控检测带时，进行荧光定量检测。

作为本发明的一种优选技术方案，所述预润层析膜将缓冲液直接滴加于层析膜。所述的荧光免疫层析方法为当所述预润层析膜将缓冲液间接滴加于层析膜时，所述荧光免疫层析试纸条还包括湿润层和连接层，其中湿润层分别与层析层和连接块之间以毛细作用接触，所述连接块分别与润湿垫和吸水层之间以毛细作用接触。

作为本发明的一种优选技术方案，所述缓冲液为pH 7.2-11的碱性缓冲液且设置有两组，一组所述缓冲液内部设置有牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂的碱性缓冲液，另一组所述缓冲液内部设置有牛血清白蛋白和吐温20的pH为9.0的磷酸缓冲液。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种脑钠肽免疫层析定量检测方法，具备以下有益效果：

该脑钠肽免疫层析定量检测方法，通过采用量子点作为特异性抗体的标记物来定量检测脑钠肽的荧光免疫层析，量子点与有机荧光染料相比，具有发光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化及稳定性好等优势。同时选择发射波长范围为550nm到1300nm的量子点，从而提高与对照组的区分度。

该脑钠肽免疫层析定量检测方法，通过采用荧光定量仪检测定量检测带和质控检测带的荧光信号强度，同时通过质控检测带校正定量检测带的荧光信号强度，进而依据荧光定量仪获取的标准曲线从而实现脑钠肽的定量检测。

附图说明

图1为本发明系统流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

请参阅图1，一种脑钠肽免疫层析定量检测方法，包括以下步骤：

步骤一、荧光标记物使用量子点，先通过化学交联或生物分子间特异性作用将脑钠肽的特异性抗体连接到量子点的表面，得到抗体修饰后的量子点，抗体修饰后的量子点的发射波长范围为500nm到1300nm；

步骤二、将抗体修饰后的量子点放置在标记层上，且标记层上还放置有质控分子修饰后的量子点，质控分子修饰后的量子点与抗体修饰后的量子点的发射波长不同，其发射波长范围为550nm到1300nm，在层析层上分别设有定量检测带和质控检测带，其中质控检测带上设置有能与质控分子特异性结合的生物分子，定量检测带上设置有对应脑钠肽的与特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；

步骤三、当荧光免疫层析试纸条免疫层析后，检测定量检测带和质控检测带的荧光强度，并且用质控检测带的荧光强度校正定量检测带的荧光强度，进而实现脑钠肽的定量检测；

步骤四、荧光免疫层析的原理和检测方法为：采用荧光免疫层析技术及双抗体夹心法原理定量检测人样本(全血、血清或血浆)中脑钠肽的含量。检测时，首先向湿润孔中滴加缓冲液，然后将样本滴加到样品层上，样本先与标记层中的量子点标记物相混合，并沿着层析层向吸水层方向毛细运动，分别流经层析层上的定量检测带和质控检测带。当样本中含有脑钠肽时，脑钠肽与量子点表面的脑钠肽抗体结合，当层析至定量检测检测带时，会被预先存在于于该定量检测检测带的抗体捕获，从而与量子点表面的脑钠肽组成双抗体夹心复合物。使用荧光定量仪在光源激发下获取定量控制带和质控控制带的荧光信号强度，根据荧光定量仪获取的测量曲线，从而分析样本中脑钠肽浓度。

本实施例中，荧光免疫层析试纸条由样品层、标记层、层析层、吸水层和底座构建，其中层析层为弱荧光层析层，底座具备低荧光的特性。

本实施例中，抗体修饰后的量子点放置在标记层上，且标记层上还放置有质控分子修饰后的量子点，质控分子修饰后的量子点与抗体修饰后的量子点的发射波长不同，其发射波长范围为550nm到1300nm，在层析层上分别设有定量检测带和质控检测带，其中质控检测带上设置有能与质控分子特异性结合的生物分子，定量检测带上设置有对应脑钠肽的与特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体。

本实施例中，荧光免疫层析试纸条免疫层析后，检测定量检测带和质控检测带的荧光强度，并且用质控检测带的荧光强度校正定量检测带的荧光强度，进而实现脑钠肽的定量检测。

本实施例中，抗体修饰后的量子点设置有两组，其发射波长分别为650nm和900nm，质控分子修饰后的量子点设置有两组，其发射波长为570nm和600nm。

本实施例中，量子点为单一化合物形成的量子点或几种化合物组成的复合量子点，化合物可选自MgS、ZnS、HgS、CdS、PbS、MgSe、ZnSe、CdTe、PbSe、MgTe、ZnTe、HgTe、InP、InAs其中一种或几种混合，并且可以加入铜、锰和汞。

本实施例中，层析层在超过550nm处不含荧光剂或者荧光很弱，底板颜色为黑色且表面设置有不干胶，底板和不干胶均不含荧光剂，荧光免疫层析试纸条还包括能使样本中液体与细胞分离的过滤膜。

本实施例中，荧光免疫层析试纸条的免疫层析为预润免疫层析，预润免疫层析先用缓冲液预润层析层后再将样本加入进样品层，当样本流入定量检测带和质控检测带时，进行荧光定量检测。

本实施例中，预润层析膜将缓冲液直接滴加于层析膜。的荧光免疫层析方法为当预润层析膜将缓冲液间接滴加于层析膜时，荧光免疫层析试纸条还包括湿润层和连接层，其中湿润层分别与层析层和连接块之间以毛细作用接触，连接块分别与润湿垫和吸水层之间以毛细作用接触。

本实施例中，缓冲液为pH 7.2-11的碱性缓冲液且设置有两组，一组缓冲液内部设置有牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂的碱性缓冲液，另一组缓冲液内部设置有牛血清白蛋白和吐温20的pH为9.0的磷酸缓冲液。

有益效果：

该脑钠肽免疫层析定量检测方法，通过采用量子点作为特异性抗体的标记物来定量检测脑钠肽的荧光免疫层析，量子点与有机荧光染料相比，具有发光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化及稳定性好等优势。同时选择发射波长范围为550nm到1300nm的量子点，从而提高与对照组的区分度。

该脑钠肽免疫层析定量检测方法，通过采用荧光定量仪检测定量检测带和质控检测带的荧光信号强度，同时通过质控检测带校正定量检测带的荧光信号强度，进而依据荧光定量仪获取的标准曲线从而实现脑钠肽的定量检测。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。