一种用于快速PCR且具有抑制剂抵抗的DNA聚合酶突变体及其制备与应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种能够用于快速PCR和耐受复杂条件的DNA聚合酶突变体及其制备与应用。

背景技术

Taq DNA聚合酶是一种属于A家族的具有耐热特性的DNA聚合酶，与1976年由Chine等人从水生嗜热菌Thermus aquaticus中分离而来。1988年Saiki等人将Taq DNA聚合酶应用到PCR中实现PCR反应的自动化。全长的Taq DNA聚合酶由832个氨基酸组成，最适反应温度在75～80℃，95℃处理半个小时能够保留一半的活力。在70℃，Taq DNA聚合酶能够以60nt速率延伸DNA链，在55℃时反应速率降为不到原来的一半。Taq DNA聚合酶是镁离子依赖聚合酶，最适镁离子浓度在2～4mM，而钠离子存在会抑制反应活性。

随着PCR技术的推广，研究人员对Taq DNA聚合酶的要求也日益严苛，在一些特定场景中传统的Taq DNA聚合酶已然不能满足研究人员的需求，如减少PCR反应时间，提高对抑制剂的抵抗。

发明内容

针对现有的一些技术问题，本发明提供一种能够用于快速PCR且具有抑制剂抵抗的Taq DNA聚合酶及其制备和应用。本发明的用于快速PCR且具有抑制剂抵抗的Taq DNA聚合酶延伸速度快，对常见的影响Taq DNA聚合酶活性的抑制剂抵抗性高，可用于减少时间的快速PCR以及在血清样本、氯化钠溶液样本中扩增目的基因。具体而言，本申请通过以下技术方案解决了本领域的技术问题。

1.一种Taq DNA聚合酶突变体，其与SEQ ID No:3所示的野生型Taq DNA聚合酶相比，包含选自D655N、E681K、E742Q和M747R组成的组的一个氨基酸取代或多个氨基酸取代的组合。

2.项目1所述的Taq DNA聚合酶突变体，其氨基酸序列如SEQ IDNo:1所示。

3.组合物，其包含项目1至2中任一项所述的Taq DNA聚合酶突变体。

4.多核苷酸，其编码项目1至2中任一项所述的Taq DNA聚合酶突变体，优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。

5.载体，其包含项目4所述的多核苷酸，优选地，所述载体为表达载体，更优选pET-22b。

6.宿主细胞，其包含项目1至2中任一项所述的Taq DNA聚合酶突变体、项目4所述的多核苷酸或项目5所述的载体，所述宿主细胞优选为原核细胞，更优选大肠杆菌感受态细胞E.coil BL21。

7.试剂盒，其包含项目1至2中任一项所述的Taq DNA聚合酶突变体或项目3所述的组合物和使用说明书。

8.一种PCR扩增方法，其包括使用项目1至2中任一项所述的Taq DNA聚合酶突变体或项目3所述的组合物或项目7所述试剂盒进行PCR扩增。

9.一种制备项目1-2任一项所述的Taq DNA聚合酶突变体的方法，其包括培养项目6所述的宿主细胞并诱导表达Taq DNA聚合酶突变体，并分离出所述Taq DNA聚合酶突变体。

10.项目9所述的方法，其中所述Taq DNA聚合酶突变体的分离包括收集宿主细胞，破碎细胞，离心，收集上清液并用于亲和纯化，优选镍柱亲和纯化后进行肝素亲和纯化。

11.通过项目9-10任一项的方法制备的Taq DNA聚合酶突变体。

本发明的有益技术效果：

本发明的上述Taq DNA聚合酶突变体与野生型Taq DNA聚合酶具有更加快速的延伸速度，可用于减少时间的快速PCR场景。

本发明的Taq DNA聚合酶突变体具有更强的抵抗抑制剂的活性，可在含有氯化钠、血清样本中直接进行目的基因扩增。

本发明提供的所述Taq NDA聚合酶突变体的制备方法，可以制备出不含有内源性核酸，活性高，热稳定性好，抗干扰能力强的Taq DNA聚合酶。

附图说明

图1为实施例2中本发明的Taq DNA聚合酶突变体与野生型Taq DNA聚合酶在不同延伸时间下PCR效果。图1A扩增的序列为SEQ ID No:4，2-5分别表示野生型Taq DNA聚合酶在延伸时间为30s、20s、10s、5s的PCR扩增结果；7-10分别表示本发明Taq DNA聚合酶突变体在延伸时间为30s、20s、10s、5s的PCR扩增结果。图1B扩增序列为SEQ ID No:5，2-5分别表示野生型Taq DNA聚合酶在延伸时间为120s、90s、60s、30s的PCR扩增结果；7-10分别表示本发明Taq DNA聚合酶突变体在延伸时间为120s、90s、60s、30s的PCR扩增结果。

图2为实施例3中本发明的Taq DNA聚合酶突变体与野生型Taq DNA聚合酶在氯化钠中扩增序列为SEQ ID No:4的PCR效果，2-4分别表示野生型Taq DNA聚合酶在氯化钠浓度为10mM、20mM、25mM的条件下PCR扩增结果；6-9分别表示本发明Taq DNA聚合酶突变体在氯化钠浓度为10mM、20mM、25mM、30mM的条件下PCR扩增结果。

图3为实施例4中本发明的Taq DNA聚合酶突变体与野生型Taq DNA聚合酶在血清中扩增序列为SEQ ID No:4的PCR效果，2-4分别表示野生型Taq DNA聚合酶在血清浓度为10％、15％、20％的条件下PCR扩增结果；6-11分别表示本发明Taq DNA聚合酶突变体在血清浓度为10％、15％、20％、25％、30％、35％的条件下PCR扩增结果。

图4为实施例5中本发明的Taq DNA聚合酶突变体与野生型Taq DNA聚合酶在氯化钠中从耻垢分枝杆菌单克隆样本中扩增序列为SEQ ID No:4的PCR效果，2-5分别表示野生型Taq DNA聚合酶在氯化钠浓度为10mM、20mM、25mM、30mM的条件下PCR扩增结果；6-9分别表示本发明Taq DNA聚合酶突变体在氯化钠浓度为10mM、20mM、25mM、30mM的条件下PCR扩增结果。

图5为实施例6中本发明的Taq DNA聚合酶突变体与野生型Taq DNA聚合酶在血清中从耻垢分枝杆菌单克隆样本中扩增序列为SEQ ID No:4的PCR效果，2-7分别表示野生型Taq DNA聚合酶在血清浓度为10％、15％、20％、25％、30％、35％的条件下PCR扩增结果；8-13分别表示本发明Taq DNA聚合酶突变体在血清浓度为10％、15％、20％、25％、30％、35％的条件下PCR扩增结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

为进一步阐述本发明所采取的技术手段以及效果，以下展示具体说明，值得注意的是具体实施方式仅用作解释本发明，而非对本发明限定。对本发明的公开内容，从材料、方法和反应条件进行的改进均应纳入本发明范围内。除非特殊说明，本发明实施例采用试剂均为市售商品。

本发明的能够用于快速PCR且具有抑制剂抵抗的一种Taq DNA聚合酶突变体氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，编码这种突变体的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。

本发明的另一个目的是提供一种编码上述能够用于快速PCR且具有抑制剂抵抗的Taq DNA聚合酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。

本发明的第三个目的是提供一种制备上述能够用于快速PCR且具有抑制剂抵抗的Taq DNA聚合酶突变体的方法，具体步骤如下：

(1)克隆SEQ ID No:2所示的核苷酸序列；

(2)将步骤(1)中的核苷酸片段构建到基因表达载体中，形成重组质粒；

(3)将重组质粒转化到宿主细胞中，得到重组细胞；

(4)对步骤(3)中的重组细胞进行诱导表达，收集菌体；

(5)破碎步骤(4)中菌体，热处理，离心，收集上清；

(6)利用镍柱亲和纯化步骤(5)上清，收集产物；

(7)利用Heparin亲和纯化步骤(6)，得到所述的能够用于快速PCR且具有抑制剂抵抗的Taq DNA聚合酶突变体。

(8)步骤(2)中基因表达载体为pET-22b。

(9)步骤(3)中宿主细胞为原核细胞。

(10)步骤(3)中宿主细胞为大肠杆菌感受态细胞E.coil BL21。

(11)步骤(4)中诱导表达方法为：将步骤(3)中重组细胞于5mL LB液体培养基中于37℃200rpm过夜培养后，转接到800mL LB液体培养基中，37℃200rpm培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为0.4mM，30℃，200rpm诱导12h。

(12)最后，本发明提供了上述能够用于快速PCR且具有抑制剂抵抗的Taq DNA聚合酶突变体的应用，所述的Taq DNA聚合酶突变应用于减少时间的快速PCR以及应用于在含有血清以及氯化钠样本中目的基因的扩增。

与野生型Taq DNA聚合酶(氨基酸序列如SEQ ID No:3所示)相比，本发明的一种Taq DNA聚合酶与野生型Taq DNA聚合酶的区别是一些氨基酸位点的突变(前面字母表示野生型Taq DNA聚合酶，后面的字母表示本发明Taq DNA聚合酶)：D655N、E681K、E742Q和M747R。需要指出的是，本文所述的野生型Taq DNA聚合酶与原始天然Taq DNA聚合酶相比1-294氨基酸被删除。这里，D655N、E681K、E742Q和M747R中的氨基酸位置均是基于原始天然Taq DNA聚合酶的氨基酸位置。例如，D655N表示对应于原始天然Taq DNA聚合酶的氨基酸位置655位的天冬氨酸(D)被天冬酰胺(N)取代。

本文所用术语“载体”是指含有编码目标蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，所述编码目标蛋白的多核苷酸与适当的控制序列可操作地连接，以在适当的宿主细胞中表达目标多核苷酸。控制序列可以包括能够启动转录的启动子，用于控制转录的任何操纵子序列，编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列,和用于控制转录和翻译终止的序列。在转化入适当的宿主细胞后，载体可以独立于宿主的基因组复制或起作用，或者可以整合到基因组本身中。

本文所用术语“可操作地连接”是指编码本申请的目标蛋白的多核苷酸序列与启动和介导多核苷酸转录的启动子序列功能性连接。可操作的连接可以通过本领域已知的遗传重组技术制备，位点特异性DNA切割和连接可以使用本领域已知的限制酶、连接酶等制备,但不限于此。

本申请中使用的载体没有特别限制，可以使用本领域已知的任何载体。常用载体的实例可包括天然或重组形式的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如,pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APH、t10、t11、Charon4A、Charon21A等可以用作噬菌体载体或粘粒载体，并且基于pBR、基于pUC、基于pBluescriptII、基于pGEM、基于pTZ、基于pCL、基于pET、基于pUB110的载体可以用作质粒载体。具体而言，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC和pSM704等载体。可用于本申请的载体没有特别限制，而是可以使用任何已知的表达载体。

在一个实施方案中，使用用于细胞中染色体插入的载体，可以用突变的多核苷酸取代编码染色体中的变体目标的多核苷酸。将多核苷酸插入染色体可以通过本领域已知的任何方法进行，例如同源重组，但不限于此。载体可以进一步包括选择标记，以确认染色体插入。选择标记用于选择被载体转化的细胞，即，确认是否插入目标核酸分子。选择标记的实例可以包括提供选择性表型的标记，例如耐药性，营养缺陷型，对细胞毒性剂的抗性，或表面突变多肽的表达。在被选择性试剂处理的环境中，只有表达选择标记的细胞可以存活或显示不同的表型，因此可以选择被转化的细胞。

本申请的宿主细胞可以是真核生物和原核生物宿主细胞，特别是微生物，如大肠杆菌感受态细胞E.coil BL 21。

微生物可以是重组微生物。重组可以通过遗传修饰(如转化)来实现。

本文所用术语“转化”是指将含有编码目标蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞,以允许所述多核苷酸编码的蛋白在宿主细胞中表达的过程。无论被转化的多核苷酸是插入宿主细胞的染色体中的形式还是位于染色体外的形式,两种形式的被转化的多核苷酸都属于本申请的范围内，只要被转化的多核苷酸在宿主细胞中表达。此外，多核苷酸包括编码目标蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式引入宿主细胞，只要多核苷酸被引入宿主细胞中并在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞，表达盒是含有自身复制所需的所有必需元件的基因构建体。表达盒通常可以包括与多核苷酸可操作地连接的启动子，转录终止信号，核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体。另外，多核苷酸可以以其原始形式被引入到宿主细胞中，并且可操作地连接到在宿主细胞中表达所需的序列，而不限于此。用于转化的方法包括用于将多核苷酸引入细胞的任何方法,并且可以通过本领域已知的合适的标准技术进行。例如，转化方法包括电穿孔法、磷酸钙(Ca(H

本文所用术语“培养”是指在适当调节的环境条件下使宿主细胞生长。本申请中的培养方法可以在本领域已知的适当培养条件下使用适当的培养基进行。本领域技术人员可以根据所选择的菌株容易地调节和使用这种培养方法。具体而言,培养可以是分批培养、连续培养和补料分批培养,但不限于此。

本文所用术语“培养基”是指培养宿主细胞所需的营养物作为主要成分混合并供给存活和生长必需的营养素和生长因子(包括水)的物质。具体而言，作为用于培养本申请的宿主细胞的培养基和其它培养条件，可以使用任何培养基而没有特别限制，只要其是用于培养宿主细胞的常规培养基，但是本申请的宿主细胞可以在有氧条件下、在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素等的常规培养基中培养,同时控制温度、pH等。

实施例1：能够用于快速PCR且具有抑制剂抵抗的Taq DNA聚合酶突变体的制备

将SEQ ID No:2所示的核苷酸序列构建到pET-22b，通过组氨酸标签进行纯化；将构建成功的表达载体转入宿主细胞于5mL LB液体培养基中于37℃200rpm过夜培养后，转接到800mL LB液体培养基中，37℃200rpm培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为0.4mM，30℃，200rpm诱导12h。收菌体纯化步骤如下：

(1)高压破碎后于80℃热处理1h，离心后收取上清；

(2)上清上样到Ni-IDA亲和层析柱中；

(3)使用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH8.0)冲洗5倍柱体积；

(4)使用含有咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱；

(5)步骤(4)中的洗脱液以1mL/min流速上样到肝素层析柱中；

(6)使用A缓冲液(20mM Tris-HCl，20mM NaCl，pH8.0)以2mL/min冲洗层析柱；

(7)使用A缓冲液和B缓冲液(20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH8.0)以2mL/min流速进行NaCl梯度洗脱；

(8)使用透析缓冲液(50mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mMβ-ME，pH8.0)对步骤(7)洗脱样进行透析；

(9)使用超滤管进行蛋白浓缩，保存于-80℃。

实施例2：本发明的Taq DNA聚合酶突变体与野生型Taq DNA聚合酶延伸速度比较

使用本发明的Taq DNA聚合酶突变体与野生型Taq DNA聚合酶各0.5μg在PCR过程中使用不同的延伸时间扩增两种目的基因，核苷酸序列如SEQ ID No:4以及SEQ ID No:5所示。

针对SEQ ID No:4的引物如下：

正向引物(SEQ ID No:6)：

5'-GGAATTCCATATGATGATCGAGCCCATGCGTGC C-3'

反向引物(SEQ ID No:7)：

5'-CGGGGTACCGCCCTGAAAATAAAGATTCTCTTGCCCCAGGGTGTT

CTGCATG-3'

针对SEQ ID No:5的引物如下：

正向引物(SEQ ID No:8)：

5'-TATACATATGACTATGTTCCAGTATTACAAACGATCACGG-3'

反向引物(SEQ ID No:9)：5'-

GGTGCTCGAGCCCTACCGCTGGCGTCGGGTCATCGCCTTTGTAG-3'

PCR体系：50μL

PCR条件：

结果如图1A所示，SEQ ID No:4核苷酸序列为654bp大小。在扩增目的基因为SEQID No:4时，本发明Taq DNA聚合酶突变体在延伸时间在30-5s时间范围内均能够扩增出相应大小的片段，且扩增出的产物亮度没有较大的衰减；而野生型Taq DNA聚合酶只在30-20s范围内有同等亮度的扩增产物形成。

结果如图1B所示，SEQ ID No:5核苷酸序列为3357bp大小。在扩增目的基因为SEQID No:5时，本发明Taq DNA聚合酶突变体在120-60s时间范围内均能够扩增出数量可观的相应大小的片段，而野生型Taq DNA聚合酶均无法成功扩增出相应的条带。

实施例3：

本实施例以SEQ ID No:4为扩增模板，以氯化钠作为抑制剂加入到扩增体系中，加入量分别为10mM、20mM、25mM、30mM，引物如SEQ IDNo:6-7所示，扩增体系如实施例1所示，PCR体系如下：

结果如图2所示，本发明Taq DNA聚合酶突变体在10-30mM的氯化钠中均能够有效扩增出相应的片段，而野生型Taq DNA聚合酶仅在10mM的氯化钠中能够扩增出相应的片段。

实施例4：

本实施例以SEQ ID No:4为扩增模板，以血清作为抑制剂加入到扩增体系中，加入量分别为10％、15％、20％、25％、30％、35％，引物如SEQ ID No:6-7所示，扩增体系如实施例1所示，PCR体系如实施例3所示。

结果如图3所示，本发明Taq DNA聚合酶突变体能够耐受30％的血清，而野生型TaqDNA聚合酶则无法成功扩增出目的条带。

实施例5：

本实施例以耻垢分枝杆菌单克隆菌落为扩增模板，扩增出SEQ IDNo:4序列，以氯化钠作为抑制剂加入到扩增体系中，加入量分别为10mM、20mM、25mM、30mM，引物如SEQ IDNo:6-7所示，扩增体系以及PCR体系如实施例3所示。

结果如图4所示，本发明Taq DNA聚合酶突变体能够在25mM氯化钠中从耻垢分枝杆菌单克隆样本中扩增出相应的条带，而野生型Taq

DNA聚合酶则无法成功扩增出目的条带。

实施例6：

本实施例以耻垢分枝杆菌单克隆菌落为扩增模板，扩增出SEQ IDNo:4序列，以血清作为抑制剂加入到扩增体系中，加入量分别为10％、15％、20％、25％、30％、35％，引物如SEQ ID No:6-7所示，扩增体系以及PCR体系如实施例3所示。

结果如图5所示，本发明Taq DNA聚合酶能够在25％血清中从耻垢分枝杆菌单克隆样本中扩增相应的目的条带，而野生型Taq DNA聚合酶则无法成功扩增出相应的条带。

综上所述，本发明的Taq DNA聚合酶突变体具有更快的延伸速度的能力，能够减少PCR过程中的时间，对抑制剂具有较强的抵抗性。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明涉及的序列如下：

SEQ ID No:1(Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列)

MEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVNPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQKLAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVRQAAERRAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE

SEQ ID No:2(Taq DNA聚合酶突变体的编码核酸序列)

ATGGAAGAAGCCCCGTGGCCCCCGCCGGAAGGTGCCTTCGTCGGTTTTGTGCTGAGCCGCAAAGAACCGATGTGGGCGGATCTGCTGGCACTGGCGGCGGCGCGTGGTGGTCGTGTGCACCGCGCGCCGGAACCGTATAAAGCGCTTCGTGATCTGAAAGAAGCACGCGGTCTGCTGGCGAAAGATCTGAGCGTTCTGGCGCTGCGCGAAGGCCTGGGCCTGCCGCCGGGCGATGATCCGATGCTGCTGGCGTATCTGCTGGATCCGAGCAACACCACCCCGGAAGGCGTAGCCCGCCGTTATGGCGGCGAATGGACCGAAGAAGCCGGCGAACGCGCAGCGCTGAGCGAACGCCTGTTTGCGAACCTGTGGGGCCGTCTGGAAGGCGAAGAACGCCTGCTGTGGCTGTATCGCGAAGTGGAACGTCCGCTGAGCGCGGTTCTGGCGCACATGGAAGCGACCGGCGTTCGCCTGGATGTTGCATATCTGCGTGCGCTGTCGCTGGAAGTTGCCGAAGAGATTGCCCGCCTGGAAGCGGAAGTATTTCGCCTGGCGGGCCATCCGTTTAACCTGAATAGCCGCGATCAACTGGAACGCGTGCTGTTTGATGAACTGGGCCTGCCGGCGATTGGCAAGACCGAAAAAACCGGCAAACGTAGCACCTCCGCGGCGGTGCTGGAAGCACTGCGCGAAGCCCATCCGATTGTGGAAAAAATTTTGCAGTATCGCGAACTGACCAAACTGAAATCAACCTACATTGATCCGTTACCGGATCTGATTCACCCGCGTACCGGTCGCCTGCATACACGTTTTAACCAGACCGCGACCGCCACCGGCCGTCTGAGCAGCAGCGATCCGAATCTGCAGAATATTCCGGTTCGTACGCCGCTGGGCCAGCGCATTCGCCGCGCCTTTATTGCGGAGGAAGGTTGGCTGCTGGTTGCGCTGGATTACAGCCAGATTGAACTGCGCGTGCTGGCCCACCTGTCGGGTGATGAAAACCTGATTCGCGTGTTTCAGGAAGGCCGCGATATTCATACCGAAACCGCGAGCTGGATGTTCGGGGTGCCGCGCGAAGCAGTTAACCCGCTGATGCGCCGCGCCGCAAAAACCATTAATTTCGGCGTGCTGTATGGCATGTCAGCGCACCGTCTGAGTCAGAAACTGGCGATTCCGTATGAAGAAGCGCAGGCGTTCATTGAACGTTATTTTCAGAGCTTCCCGAAGGTGCGTGCCTGGATTGAAAAAACCCTGGAGGAAGGCCGCCGCCGCGGCTACGTGGAAACCCTGTTTGGCCGCCGTCGTTACGTTCCGGATCTGGAAGCGCGCGTGAAAAGCGTGCGTCAGGCGGCAGAACGCCGTGCCTTTAACATGCCGGTGCAGGGCACCGCCGCCGATCTGATGAAACTGGCGATGGTGAAACTGTTTCCGCGCCTGGAAGAAATGGGTGCCCGCATGCTGCTGCAGGTGCATGATGAACTGGTGCTGGAAGCGCCGAAAGAACGTGCGGAAGCCGTGGCGCGTCTGGCGAAAGAAGTGATGGAAGGCGTGTATCCGCTGGCGGTGCCGTTAGAAGTGGAAGTGGGCATTGGTGAAGATTGGCTGAGCGCCAAAGAA

SEQ ID No:3(野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列)

MEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE

SEQ ID No:4

ATGATCGAGCCCATGCGTGCCGTGACTGTGGGTCTCGGGGTGGCTGGACTTGTCCTGGCGTCAGTGGCACCTGCGGCGGCCCGGCCGTCGGATCCCGGTGTGGTGTCCTACGCCGTCATGCCGAAGGGTTCGGTGAGCAACATCGTCGGCGCCCCCATCCGCTGGGAGTCCGAGTTCACCGCGCCGTTCCAGGCGTTCTCCGTCGACAACCCCGTGTGCAACAACTGGGCCGACATCGGCCTGCCCGAGGTATTCAACGACCCCGACCTGGCGTCCTTCGGCGGTGCAACCGCCCAGACCGCGGCGGGCGACGCCACACACCTGGTGAAGCAGGCCGTCGGGGTGTTCGCCACCGTCGACGCGGCCGACCGCGCCTACCATCGCGTCGTCGACCGCACCGTCGGATGCGCGGGGCAGACCACGGCGATGCATCTGGACAACTTCCACACCGAGGTGTGGACGTTCACCGGCGGGCCGGCGGGCCCGGCCGACGCCGACTGGGTCAAGCAGGAGGCGGGCACCGACCGGCGGTGTTTCAACACCACCCGGAAGCGCGAAAACGTTCTGCTGCAGGCAAAAGTGTGCCAATCCGGCAACGGAGGCCCCGCGGTCAACGTGCTGGCCGGGGCCATGCAGAACACCCTGGGGCAATAA

SEQ ID No:5

ATGACTATGTTCCAGTATTACAAACGATCACGGCATTTTGTTTTTTCAGCATTTATTGCTTTTGTTTTTGTCTTGTTATGCCAGAACACGGCGTTTGCGCGGGCGTCATCGAATGGTGATCTGCCGACAAAAGCGGACCTGCAGGCGCAACTTGACTCACTAAATAAACAAAAAGATCTTTCTGCTCAGGACAAACTGGTGCAGCAGGATCTGACAGATACATTAGCCACCCTCGATAAAATCGATCGCATAAAAGAAGAGACAGTTCAGCTACGGCAAAAAGTCGCTGAAGCGCCGGAAAAAATGCGCCAGGCGACCGCGGCGTTAACAGCACTTAGCGATGTCGATAACGACGAAGAAACGCGCAAAATTCTGAGCACGCTGTCGTTGCGCCAGCTGGAAACTCGCGTTGCCCAGGCGCTGGACGATTTGCAAAACGCACAAAACGATCTGGCGTCTTATAACAGCCAGCTGGTTTCGTTACAGACGCAGCCCGAACGCGTGCAAAATGCGATGTATAACGCTTCGCAGCAGCTGCAACAAATTCGCAGTCGTCTGGATGGGACTGATGTCGGCGAGACAGCCTTACGTCCCAGCCAGAAAGTGTTAATGCAGGCCCAGCAGGCGTTGCTGAATGCGGAGATTGACCAGCAGCGTAAAAGCCTGGAAGGGAACACCGTCTTGCAGGATACCTTGCAAAAGCAACGTGATTACGTGACGGCGAACAGCGCTCGTCTGGAGCACCAGTTACAACTGTTGCAAGAAGCGGTAAACAGCAAGCGCCTGACTTTAACCGAAAAAACGGCGCAGGAAGCCGTCTCCCCGGATGAAGCCGCGCGTATTCAGGCTAATCCGCTGGTGAAGCAGGAACTGGAAATTAACCAGCAGTTAAGTCAGCGTCTGATTACCGCGACTGAAAACGGTAATCAGTTGATGCAGCAAAACATTAAAGTCAAAAACTGGCTGGAGCGGGCGCTGCAATCGGAACGCAATATTAAAGAGCAGATTGCCGTCCTGAAGGGCAGCCTGCTGTTGTCTCGTATCCTTTACCAGCAACAACAAACGCTGCCCTCGGCGGATGAACTGGAAAACATGACCAACCGCATCGCGGATTTGCGTCTCGAACAGTTTGAAGTTAACCAGCAGCGTGATGCACTCTTCCAGAGCGATGCGTTCGTCAACAAACTGGAAGAAGGTCACACCAACGAAGTCAACAGCGAAGTTCACGATGCGTTATTGCAAGTGGTTGATATGCGTCGCGAATTGCTGGATCAACTCAACAAACAGTTGGGTAACCAGCTGATGATGGCCATTAACCTGCAAATCAACCAGCAGCAGTTAATGAGTGTGTCGAAAAACCTGAAATCCATCCTGACTCAGCAAATCTTTTGGGTGAACAGTAACCGTCCAATGGACTGGGACTGGATCAAAGCGTTCCCGCAAAGCCTGAAAGATGAATTTAAGTCGATGAAAATCACGGTGAACTGGCAAAAAGCCTGGCCCGCCGTTTTTATCGCTTTCCTCGCTGGTTTGCCGCTGCTGTTGATTGCCGGGCTGATCCACTGGCGTCTGGGGTGGCTGAAAGCGTATCAACAAAAACTGGCTTCCGCTGTGGGTTCCCTGCGTAACGACAGCCAGCTCAACACACCAAAAGCGATCCTTATCGACCTGATCCGTGCGCTGCCGGTGTGCCTGATTATTCTCGCGGTTGGCCTGATTCTGTTGACCATGCAGCTCAACATCAGCGAACTGCTATGGTCGTTCAGCAAAAAACTGGCGATATTCTGGCTGGTGTTTGGCCTGTGCTGGAAGGTACTGGAGAAAAACGGCGTTGCCGTACGTCACTTCGGCATGCCGGAACAGCAGACCAGCCACTGGCGTCGGCAAATTGTCCGCATCAGTCTCGCATTGCTGCCTATCCATTTCTGGTCTGTGGTGGCAGAACTTTCCCCGCTGCATCTGATGGATGATGTGCTGGGGCAAGCGATGATTTTCTTCAACCTGCTGCTGATTGCTTTCCTGGTATGGCCGATGTGCCGCGAAAGCTGGCGTGATAAAGAGTCGCACACCATGCGACTGGTCACCATTACCGTGCTGTCGATAATCCCGATTGCGCTGATGGTGCTGACTGCTACAGGCTACTTCTACACTACGCTGCGTCTGGCAGGACGCTGGATTGAAACCGTTTATCTGGTGATCATCTGGAACCTGCTGTACCAGACGGTACTGCGTGGCTTAAGCGTAGCGGCGCGGCGTATCGCCTGGCGTCGTGCGCTGGCGCGTCGGCAGAATCTGGTGAAAGAGGGCGCAGAAGGTGCTGAACCGCCGGAAGAACCCACCATTGCACTGGAGCAAGTTAACCAGCAGACGCTGCGTATTACCATGTTGCTGATGTTTGCGCTGTTCGGTGTCATGTTCTGGGCAATTTGGTCCGATTTGATCACCGTGTTCAGCTATCTCGACAGCATCACGCTCTGGCATTACAACGGCACTGAAGCTGGCGCTGCGGTGGTGAAAAACGTCACCATGGGCAGTCTGTTGTTTGCGATTATCGCCTCAATGGTGGCCTGGGCGTTGATTCGCAACCTGCCTGGTTTACTGGAAGTGCTGGTGCTCTCGCGACTGAATATGCGCCAGGGCGCGTCGTATGCCATTACTACCATCCTTAACTACATCATTATTGCTGTTGGTGCGATGACGGTGTTCGGATCGCTGGGCGTCTCTTGGGATAAACTCCAGTGGCTGGCCGCAGCATTATCCGTAGGTCTTGGTTTTGGTTTACAAGAAATTTTCGGTAACTTCGTCTCCGGTTTGATCATTCTATTCGAACGTCCGGTGCGTATTGGCGATACGGTAACCATTGGTAGCTTCTCGGGGACGGTAAGTAAGATCCGTATTCGTGCGACAACGATTACCGATTTCGATCGCAAAGAAGTGATCATCCCGAACAAAGCGTTTGTTACCGAGCGTCTGATCAACTGGTCGTTGACTGACACTACTACGCGTCTGGTGATCCGTCTCGGCGTGGCCTATGGCTCCGATCTGGAAAAAGTGCGTAAAGTGTTACTGAAGGCGGCGACTGAGCACCCAAGGGTGATGCACGAACCAATGCCGGAAGTCTTCTTTACGGCATTTGGTGCCAGCACGTTGGATCATGAGCTGCGTCTGTATGTGCGTGAACTGCGTGACCGTAGTCGTACTGTCGATGAGCTGAACCGTACTATCGATCAGCTGTGCCGTGAAAACGACATCAACATTGCCTTTAACCAGCTTGAAGTGCATCTGCACAACGAGAAGGGCGATGAGGTGACGGAAGTAAAACGCGACTACAAAGGCGATGACCCGACGCCAGCGGTAGGG

SEQ ID No:6：

5'-GGAATTCCATATGATGATCGAGCCCATGCGTGC C-3'

SEQ ID No:7：

5'-GGGGTACCGCCCTGAAAATAAAGATTCTCTTGCCCCAGGGTGTTCTGCATG-3'

SEQ ID No:8：

5'-TATACATATGACTATGTTCCAGTATTACAAACGATCACGG-3'

SEQ ID No:9：

5'-GGTGCTCGAGCCCTACCGCTGGCGTCGGGTCATCGCCTTTGTAG-3'

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。