具有不同正电荷的AIE光敏剂及其制备方法和抗菌应用

技术领域

本发明涉及具有聚集诱导发光性质(AIE)的光敏剂的简单制备方法，涉及通过增加AIE光敏剂正电荷数目的方法增加对革兰氏阴性菌的抗菌性能，还涉及AIE光敏剂作为革兰氏阳性菌的抗菌剂，在暗场也可高效抑制细胞内的革兰氏阳性菌的增殖。

背景技术

几个世纪以来，人类一直在与细菌作斗争。抗生素在刚被发明出来时其杀菌效果非常高效，但是经过很长时间的滥用，一些细菌产生了耐药性，这对我们的健康产生了极大的威胁。世界卫生组织警告说，在不久的将来，我们可能会进入一个后抗生素时代，到时候普通感染和轻伤可能导致严重的发病率和死亡率。这是一件非常可怕的事情。因此，科研工作者在不断努力开发替代性的抗菌方法。

光动力疗法(PDT)是利用光敏剂、光和氧的光化学过程。在这个过程中，光敏剂吸收光被激活到单线态，然后通过系间窜越(intersystem crossing,ISC)过程转化为激发的三线态。激发的三线态通过能量转移或电子转移引发光化学反应，分别生成单线态氧(

相比之下，具有聚集诱导发光(AIE)性质的发光体在溶解状态时发光很弱，而在聚集态时由于分子内运动受限激活了辐射通道而极大增强了荧光的发射。AIE分子在聚集态时辐射通道增多不仅有利于荧光成像，而且由于系间窜越增加，ROS的生成也增加。因此，AIE光敏剂作为新一代光敏剂，既能有效杀灭细菌，又能有效成像细菌，而具有广阔的应用前景。

由于革兰氏阴性菌(G(-))的外膜富含带负电荷的脂多糖(LPS)，而革兰氏阳性菌(G(+))的细胞壁含有带负电荷的磷壁酸，因此，静电相互作用被广泛认为是许多抗菌药物最初靶向细菌的原因。同时，与真核生物的两性离子细胞膜相比，阳离子光敏剂对带负电荷的细菌具有更强的静电吸引力。因此，阳离子光敏剂被广泛使用。虽然已有一些关于阳离子AIE光敏剂抗菌应用的报道，但这些研究很少考虑到正电荷数目对抗菌效率的影响。而且许多报道的AIE光敏剂仅对G(+)细菌有高效的光毒性，而对G(-)细菌的光毒性较小。由于G(-)细菌具有外膜的保护、大量的外排泵和高选择性的孔蛋白，G(-)细菌对许多抗生素具有内在的抵抗力。因此，与治疗G(+)细菌感染相比，治疗G(-)细菌感染的抗菌材料不足的问题更为严重。有研究表明，适当增加阳离子多肽的正电荷数目可提高抗菌活性。受到抗菌多肽的启发，本申请希望通过调节正电荷数目来调节AIE光敏剂的抗菌性能。

发明内容

在一个实施方案中，本发明提供表现出聚集诱导发光性质的光敏剂，该AIE光敏剂包含以下结构：

其中R是-CH

在一个实施方案中，制备方法包括在乙腈溶剂中将

在一个实施方案中，本发明采用一种简单的方法制备具有聚集诱导发光性质(AIE)的光敏剂。通过增加AIE光敏剂正电荷数目的方法增加了对革兰氏阴性菌的抗菌性能，一个非限制性例子是大肠杆菌E.coli和耐药性大肠杆菌E.coli TOP10(耐氨苄青霉素的大肠杆菌)。还涉及AIE光敏剂对革兰氏阳性菌有很好的抗菌性能，甚至在暗场可以抑制哺乳动物细胞内革兰氏阳性菌的增殖，一个非限制性例子是表皮葡萄球菌S.epidermidis和金黄色葡萄球菌S.aureus。

附图说明

图1示出了TBP-1在氘代DMSO里的

图2示出了TBP-1在氘代DMSO里的

图3示出了TBP-1在氘代DMSO里的高分辨率质谱图；

图4示出了TBP-2在氘代DMSO里的

图5示出了TBP-2在氘代DMSO里的

图6示出了TBP-2在氘代DMSO里的高分辨率质谱图；

图7示出了TBP和TBP-1的系间窜越(ISC)的理论计算。(A)TBP和(B)TBP-1计算的能级图，自旋轨道耦合常数(ξ)和单线态与三线态之间的能量差。并使用Gaussian 09软件中M062X/6-31G(d,p)的方法，基于优化气相基态几何图形来进行理论计算。(C)TBP和(D)TBP-1的前沿分子轨道图；

图8示出了(A)TBP-1和TBP-2在DMSO中的紫外-可见光谱。(B)TBP-1和TBP-2在DMSO/甲苯混合溶剂中的相对发射峰强度(α

图9示出了(A)TBP-1和(B)TBP-2在DMSO/甲苯混合溶剂中随着f

图10示出了(A)TBP-1的纳秒瞬态吸收光谱和(B)在氩气净化的DMSO中TBP-1的三线态寿命。激发波长：355nm的脉冲激光(每脉冲4mJ)。

图11示出了ABDA指示剂测得的单线态氧生成情况。(A)RB、(C)TBP-1、(E)TBP-2的吸收谱图。(B)RB、(D)TBP-1和(F)TBP-2诱导ABDA光降解时，ABDA吸收谱图随光照时间的变化。AIE光敏剂、RB和ABDA的浓度分别为10、10和50μM。光照射的时间间隔为20s。白光LED灯功率密度：0.66mW/cm

图12示出了TBP-1和TBP-2对G(+)细菌(表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌)和G(-)菌(大肠杆菌和大肠杆菌TOP10)的杀菌活性。用不同浓度的(A，C)TBP-1或(B，D)TPB-2孵育细菌10min，置于黑暗或4.2mW/cm

图13示出了不同浓度的TBP-1或TBP-2分别处理细菌10min后，在黑暗或4.2mW/cm

图14示出了不同浓度的TBP-1或TBP-2分别处理细菌10min后，在黑暗或4.2mW/cm

图15示出了不同浓度的(A)TBP-1或(B)TBP-2在10mM PBS溶液(含3％DMSO)中形成的粒子的荧光强度和动态光散射强度。条件：λ

图16示出了TBP-1、TBP-2或者抗生素苯唑西林连续处理金黄色葡萄球菌30天，随着时间变化最低抑菌浓度(MIC)的变化。抗生素苯唑西林作为阳性对照。TBP-1的MIC为0.25μg/mL，TBP-2的MIC为0.5μg/mL。实验采用的抗菌剂浓度为0.25×、0.5×、1×、2×和4×MIC。

图17示出了(A-E)S.epidermidis(G(+))和(F-J)E.coli(G(-))被处理之后的SEM图片。使用10μM(B，C，G，H)TBP-1或(D,E,I,J)TBP-2孵育细菌10min，然后将其放置在(B,G,D,I)黑暗中或(C,H,E,J)4.2mW/cm

图18示出了(A

图19示出了(A，B)S.aureus(G(+))和(C，D)E.coli TOP10(G(-))被处理之后的激光共聚焦显微镜的图片。使用10μM(A，C)TBP-1或(B，D)TBP-2和0.5μg/mL Hoechst 33343孵育细菌10min，然后拍照。AIE光敏剂的荧光用伪红色显示，Hoechst 33343染色细菌细胞质中的DNA，其荧光用伪绿色显示，并把两个荧光通道叠加以进行共定位分析。AIE光敏剂：λ

图20示出了E.coli和S.epidermidis在被10μM TBP-1或TBP-2孵育10min后的Zeta电位。数据为平均值±SD(n＝3)。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。

图21示出了TBP-1或TBP-2的PBS溶液在加入E.coli细菌前后，其PL强度随着Mg

图22示出了(A，B)COS-7细胞或(C，D)HIF细胞在被不同浓度的(A，C)TBP-1或(B，D)TBP-2孵育10min，并且被4.2mW/cm

图23示出了(A，B)COS-7细胞与S.epidermidis(G(+))共混并被4μM(A)TBP-1或(B)TBP-2孵育10min以及被4.2mW/cm

图24示出了(A，B)COS-7细胞与S.aureus(G(+))共混并被4μM(A)TBP-1或(B)TBP-2孵育10min以及被4.2mW/cm

图25示出了大鼠小肠上皮细胞(IEC-6)内部S.aureus细菌的激光共聚焦荧光图片以及每个细胞里面细菌的CFU数目。内含有细菌的细胞被TBP-1和氯喹(CQ，溶酶体自噬抑制剂)处理，并被自噬标志物LC3-II蛋白的商业荧光试剂染色，以及商业细胞核染料DAPI染色。条件：使用1μg/mL TBP-1处理含有细菌的细胞2h。GFP转染的细菌：λ

具体实施方式

本发明提供的AIE光敏剂，其核心结构TBP包含三苯基胺作为电子给体，苯并噻二唑和吡啶基团作为电子受体。TBP与卤代烃反应之后形成AIE光敏剂。

该AIE光敏剂包含以下结构：

其中R是-CH

在一个实施例中，制备方法包括在乙腈溶剂中将TBP

在根据本申请的AIE光敏剂的实施例中，本发明涉及具有聚集诱导发光性质(AIE)的光敏剂的简单制备方法，涉及通过增加AIE光敏剂正电荷数目的方法增加对革兰氏阴性菌的抗菌性能，还涉及AIE光敏剂作为革兰氏阳性菌的抗菌剂，可在暗场杀死细胞内的革兰氏阳性菌。

以下详述AIE光敏剂合成的一个非限制性实施例：

TBP与1-溴乙烷或(3-溴丙基)三甲基溴化铵反应分别生成TBP-1和TBP-2。TBP-1和TBP-2的化学结构通过核磁共振和高分辨质谱测试证明了结构和高纯度(图1-图6)。TBP-1与TBP-2具有相似的疏水部分，但正电荷数不同。它们细微的结构变化将帮助我们了解正电荷数对AIE光敏剂抗菌性能的影响。其合成路线如下所示：

化合物TBP-1的合成：将TBP(100mg,0.219mmol)溶解于10mL乙腈中，置于装有冷凝器的100mL双颈圆底烧瓶中。加入1-溴乙烷(0.5mL)，加热回流8h，冷却至室温后倒入乙醚中。形成的暗红色沉淀物经抽滤得到所需的产品(117mg,95％)。

化合物TBP-2的合成：将TBP(100mg,0.219mmol)溶解于10mL乙腈中，置于装有冷凝器的100mL双颈圆底烧瓶中。加入(3-溴丙基)三甲基溴化铵(85mg,0.329mmol)，加热回流8h，冷却至室温后倒入乙醚中。形成的暗红色沉淀物经抽滤得到所需的产品(125mg,80％)。

具有高ISC速率的AIE光敏剂的设计：

众所周知，光敏剂在光照作用下，先被激发到单线态，然后通过系间窜越(ISC)跃迁到长寿命的激发三线态。然后，激发的三线态诱导光化学反应产生ROS，从而产生光毒性。为了提高光敏剂的性能，增加光敏剂的ISC过程是必要的前提。根据微扰理论，有两个因素决定ISC速率(k

由于TBP-1和TBP-2具有相似的AIE核心结构，本申请以TBP-1分子作为模型化合物通过高斯软件进行计算，并以TBP分子作为对比。结果如图7所示，对于TBP分子来说，三线态与单线态之间的能级差很大(ΔE

AIE光敏剂的光物理性质和

TBP-1和TBP-2在486nm和493nm处表现出最大的吸收峰(图8A)，吸收范围从400nm到600nm的可见光区域，因此可以被普通白光有效激活。在DMSO/甲苯混合溶剂中测量了TBP-1和TBP-2的AIE性质(图8B，图9A和9B)。它们在DMSO溶液中表现出非常弱的发射，当甲苯含量(f

由于光敏剂的三线态对产生ROS具有重要作用，本申请测试了AIE光敏剂的纳秒瞬态吸收光谱，以证明三线态的存在。如图10A所示，在氩气鼓泡后的DMSO中直接激发TBP-1产生了长寿命的瞬态吸收曲线。在534nm左右的正吸收峰对应于TBP-1的三线态-三线态吸收，此三线态的寿命为110μs(图10B)。在证明了三线态的存在之后，本申请通过两种方法研究了AIE光敏剂的ROS生成。本申请检测了在白光照射下

表格1AIE光敏剂和RB在水中的光敏效率。

AIE光敏剂抗菌性能的研究

在证明了TBP-1和TBP-2产生

针对G(+)细菌的杀菌情况如图12A和图12B所示，TBP-1和TBP-2对G(+)细菌均表现出暗毒性，且在极低光剂量(4.2mW/cm

图12C和图12D显示了TBP-1和TBP-2对G(-)细菌的杀菌情况。令人惊讶的是，TBP-1和TBP-2在抑制大肠杆菌和大肠杆菌TOP10 G(-)细菌上表现不同。两种AIE光敏剂对两种G(-)细菌都没有暗毒性。使用TBP-2孵育30min以及4.2mW/cm

AIE光敏剂对G(+)细菌不仅具有暗毒性也具有光毒性，是针对G(+)细菌的非常高效的抗菌剂。本发明还研究了AIE光敏剂是否对G(+)细菌产生耐药性。结果如图16显示，使用TBP-1、TBP-2或者抗生素苯唑西林连续处理金黄色葡萄球菌30天，TBP-1和TBP-2对连续传代的金黄色葡萄球菌抑制效果很好而且无明显耐药性产生，而抗生素苯唑西林产生的耐药性明显增加。证明TBP-1和TBP-2在治疗G(+)细菌感染时不容易产生耐药性。

杀菌机理的探讨

通过扫描电镜(SEM)、激光共聚焦显微镜(CLSM)和Zeta电位实验来了解TBP-1和TBP-2杀菌效果不同的机理。首先利用SEM对细菌(表皮葡萄球菌和大肠杆菌)的形态变化进行拍照。未使用光敏剂处理的细菌边缘非常清晰，菌体非常光滑(图17A和图17F)。然而，用TBP-1或TBP-2孵育10min后，没有光照的情况下，表皮葡萄球菌G(+)的结构坍塌并相互融合(图17B和图17D)。在白光照射10min后，表皮葡萄球菌G(+)出现了大量的塌陷和畸形形态(图17C和图17E)。因此，TBP-1和TBP-2对表皮葡萄球菌G(+)均表现出很高的暗毒性和光毒性。另一方面，大肠杆菌G(-)的SEM图像显示被TBP-1或TBP-2处理和无光照的情况下其表现出完整的形态(图17G和图17I)。然而，在白光照射30min后，可以观察到TBP-2处理后的大肠杆菌严重变形(图17J)，但TBP-1处理后的大肠杆菌的形态保持完好(图17H)。因此，TBP-1和TBP-2对大肠杆菌没有暗毒性，而且只有TBP-2对大肠杆菌有光毒性。SEM结果与平板计数法测定的杀菌结果相吻合。

其次，使用CLSM成像技术研究了两种AIE光敏剂对G(+)细菌(表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌)和G(-)细菌(大肠杆菌和大肠杆菌TOP10)的染色情况(图18和图19)。由于Hoechst染色细菌细胞质内的DNA，所以它可以检测TBP-1和TBP-2能否进入细菌的细胞质。CLSM成像结果显示，TBP-1和TBP-2均能成像表皮葡萄球菌(图18A1和18B1)和金黄色葡萄球菌(图19A和19B)。另一方面，大肠杆菌(图18D1)和大肠杆菌TOP10(图19D)经TBP-2染色后，荧光很亮，而TBP-1染色的G(-)细菌荧光较弱(图18C1和图19C)。同时，AIE光敏剂(红色通道)与Hoechst(绿色通道)的荧光重叠结果显示，TBP-1和TBP-2在G(+)细菌的细胞外部结构均有较强的染色，并进入了G(+)细菌的细胞质内(图18A3，18A4，18B3，18B4和图19A，19B)。TBP-2照亮了G(-)细菌的细胞外部结构并且进入其细胞质内(图18D3，18D4和图19D)，但TBP-1只很弱地染色了G(-)细菌的细胞外部结构(图18C3，18C4和图19C。这说明相对于TBP-1而言，TBP-2能更多地进入G(-)细菌内部。

进一步测试了表皮葡萄球菌G(+)和大肠杆菌G(-)的Zeta电位，以反映细菌被光敏剂孵育之后其表面电荷的变化。如图20所示，被TBP-1或TBP-2孵育后，表皮葡萄球菌的Zeta电位变化很小。大肠杆菌经TBP-2孵育后，原本负Zeta电位被阳离子化而导致数值明显减小，而经TBP-1孵育后，Zeta电位变化较小。说明TBP-2与G(-)细菌的相互作用强于TBP-1。

结合SEM、CLSM成像和Zeta电位的结果，可以合理解释两种AIE光敏剂抗菌效率不同的原因。由于G(+)和G(-)细菌的细胞壁结构不同，对它们的杀菌效率也不尽相同。G(+)细菌的细胞壁只有一层脂质膜，并由交联肽聚糖和阴离子磷壁酸组成的多孔厚膜覆盖。带负电荷的磷壁酸吸引阳离子AIE光敏剂并使其插入多孔细胞壁，并且大量进入细菌内部，从而产生有效的暗毒性。由于G(+)细菌的细胞壁足够厚，可以将AIE光敏剂埋在其中而不暴露于表面，所以G(+)细菌的Zeta电位保持不变。相反，由于G(-)细菌拥有一个富含脂多糖(LPS)的外膜保护，在无光照的时候，阳离子AIE光敏剂不太可能破坏G(-)细菌的细胞膜。

另外，在白光照射下为什么TBP-2比TBP-1对G(-)细菌产生更强烈的光毒性？TBP-2在G(-)细菌的细胞壁上显示更亮的荧光信号，同时也使G(-)细菌表面Zeta电位的变化大于TBP-1对G(-)细菌的影响，说明TBP-2与G(-)细菌之间的相互作用更强。由于TBP-1和TBP-2具有相同的发光内核，且均以单分散状态与细菌表面相互作用，因此两者与G(-)细菌的不同作用主要取决于分子电荷数的不同。TBP-2具有更多正电荷，它能与G(-)细菌的外膜上带负电的LPS发生强烈作用，并取代原本与LPS上负电荷的磷酸交联而稳定LPS结构的二价阳离子(Ca

细胞毒性分析

实用的抗菌材料应能选择性地清除细菌，而不对哺乳动物细胞造成伤害。本申请采用CCK-8实验检测了TBP-1和TBP-2在黑暗和白光照射下对哺乳动物细胞的细胞毒性。本申请以非洲青猴肾细胞(COS-7)和人肺成纤维细胞(HLF)作为模型哺乳动物细胞。结果图22所示，在被不同浓度的TBP-1(图22A和22C)或TBP-2(图22B和22D)孵育并且在黑暗中培养之后，COS-7和HLF的细胞活性变化可以忽略不计。在4.2mW/cm

选择性杀死细菌而不影响哺乳动物细胞

由于细菌感染哺乳动物宿主时会导致两者共存的情况，光敏剂需要在不影响哺乳动物细胞的情况下实现高效杀菌。为了证明这一点，本申请将细胞和细菌混合在一起研究了AIE光敏剂选择性成像和杀灭细菌的性能。本申请以COS-7作为模型哺乳动物细胞。共混的COS-7细胞与G(+)细菌(表皮葡萄球菌(图23A和23B)和金黄色葡萄球菌(图24A和24B))在被4μM TBP-1或TBP-2孵育10min以及被4.2mW/cm

另外，鉴于AIE光敏剂对G(+)细菌有很强的暗毒性，本发明也研究了AIE光敏剂对细胞内部细菌的杀菌情况。内含有细菌的细胞被TBP-1和氯喹(CQ，溶酶体自噬抑制剂)处理，并被自噬标志物LC3-II的商业荧光试剂染色，以及商业细胞核染料DAPI染色。结果如图25显示，GFP转染的金黄色葡萄球菌在大鼠小肠上皮细胞(IEC-6)内大量增殖，经TBP-1处理后，细胞内的金黄色葡萄球菌数量明显降低。加入氯喹之后，抑制了细胞的自噬，导致TBP-1处理的胞内金黄色葡萄球菌的数量有一点回升。因此，TBP-1可以有效抑制细胞内G(+)细菌的增殖。

实施本发明可以达到以下有益效果：

1.本发明制备AIE光敏剂的方法简单。

2.本发明的探针具有AIE特性，具有高效的单线态氧产生能力，最大吸收峰在可见光区大约490nm左右，具有深红/近红外发射(＞650nm)，普通白光就能激活AIE光敏剂。

3.本发明的AIE光敏剂可以用于无清洗的细菌成像，成像引导的光动力治疗细菌感染，而不影响哺乳动物细胞。

4.本发明的TBP-1是针对革兰氏阳性菌极好的抗菌光敏剂。而且TBP-1在暗场能高效抑制哺乳动物细胞内部的革兰氏阳性菌的增殖，并且多次重复使用而不产生耐药性。

5.本发明的TBP-2在普通白光照射下能高效抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长。另外，在暗场也能高效抑制革兰氏阳性菌的生长，并且多次重复使用而不产生耐药性。

上面结合附图对本发明的实施方式进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多变形，这些均属于本发明的保护范围之内。