一种藻菌互作增效的海水养殖池塘底质改良剂及制备方法

技术领域

本发明属于微生物工程技术和养殖环境治理修复技术领域，尤其涉及一种藻菌互作增效的海水养殖池塘底质改良剂及制备方法。

背景技术

随着海水养殖产业的不断发展，池塘养殖已成为水生动物增养殖的重要方式。池塘底质是各种颗粒性物质的沉积地，同时又是水体各种溶解性物质的重要来源。良好的池塘底质微生态系统不仅可以为池塘水体提供养分，还可以通过自身强大的吸收容纳作用改良水质，使养殖动物处在相对稳定的生长环境中，显著提升养殖效果。然而，池塘生态系统具有结构单一、缓冲能力弱、稳定性差等弱点。传统集约化池塘养殖常人工投入大量的饵料、肥料等，而池塘养殖系统对其利用有限，生物负载量过高，导致有机质在池塘底部沉积。同时，养殖动物产生的粪便、水生植物尸体等物质通过吸附、络合、沉降等过程沉积在池塘底部，使得池塘底质氧化还原电位下降、溶解氧不足，成为亚硝酸盐、氨氮、甲烷和硫化氢等有害物质迁移转化的载体和蓄积库。池塘底质中高浓度的氮磷污染物会降低养殖水体中的溶解氧含量，造成水体富营养化，影响池塘生态系统的能量流动和物质交换；硫化物可与养殖动物血液中的血红蛋白结合产生硫血红蛋白，降低血液携氧能力，抑制机体的代谢活动；氧化还原电位反映了池塘底质的氧化还原能力，数值过低表明池塘底质的氧气运输能力较弱，养殖动物的呼吸过程受到抑制。重金属离子会在池塘底质产生自由基，抑制酶活性位点，干扰细胞代谢，提高氧化压力，破坏机体红细胞和白细胞的合成。抗生素具有诱变性和致癌性，在养殖动物体内积累和残留的抗生素可能会进入食物链循环，对人类健康构成潜在威胁。致病弧菌可通过分泌溶血素、肠毒素、脂多糖等对水生动物产生致病作用，同时可向宿主传导毒力基因，能在短期内感染贝类、虾类及鱼类并造成大量死亡。因此，改良海水养殖池塘底质微生态环境是池塘养殖健康发展的必然要求，也是保障水产品质量安全的有效手段。

目前市面上部分底质改良剂大部分只是简单将几种成分组合，普遍存在有效成分来源模糊、保存效果差、施用剂量不明确、入水散失严重、不易自然沉降等问题。各组分之间没有相辅相成、互为补充的协同效应，甚至出现互相竞争和抑制的拮抗作用，生物利用度较低，无法达到池塘养殖从业者的预期效果。半裸舟形藻（

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种藻菌互作增效的海水养殖池塘底质改良剂及制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种藻菌互作增效的海水养殖池塘底质改良剂，是由包埋材料与半裸舟形藻（

优选的技术方案是每克固定化藻菌微球中含有半裸舟形藻10

优选的技术方案是所述蛤蜊壳粉是将蛤蜊壳置于碱液中浸泡后，再依次经水洗、烘干、煅烧、粉碎及过滤而制得。

优选的技术方案石菖蒲提取物和芦苇提取物提取物是按照如下方法制备而成：

将石菖蒲或芦苇叶用蒸馏水清洗干净，25 ℃通风阴干；用匀浆机将石菖蒲或芦苇叶匀浆粉碎，加入质量浓度为70%的乙醇溶液，料液比为1 g/15 ml，在工作频率为50 KHZ，功率为100 W的超声波作用下浸提1.5 h；过滤去掉杂质，将浸提液减压浓缩、冷冻干燥得到冻干粉。

一种上述藻菌互作增效的海水养殖池塘底质改良剂的制备方法，按照如下步骤进行：

步骤1. 称取定量的蛤蜊壳粉、芦苇提取物、石菖蒲提取物、半裸舟形藻液及粪产碱杆菌液，加入氯化钠、去离子水及质量浓度为3-6%的海藻酸钠溶液，80 ℃水浴加热并搅拌至固体组分溶解，得混合液；

步骤2. 将混合液慢慢滴入质量浓度为2-4%的CaCl

优选的技术方案是所述半裸舟形藻液依次按照如下步骤制备：

步骤1：将冻存的半裸舟形藻解冻后，接种于置于三角瓶的培养基中，接种量为10

步骤2：将所述三角瓶置于全自动光照培养箱中培养，培养温度为23-28 ℃，光照周期为12 L/12 D，光照强度为3000-4500 lx，每日人工摇晃藻种2-4次；

步骤3：待所述半裸舟形藻培养至对数生长期后，刮取附着在培养基上的半裸舟形藻细胞，于4500 rpm离心15 min，得藻体用无菌海水重悬并采用比浊法调整浓度，得半裸舟形藻液。

优选的技术方案是所述葡萄糖酸锌添加量为0.4 mg/L，所述添加芸苔素内酯2.0mg/L。

优选的技术方案是所述粪产碱杆菌液依次按照如下步骤制备：

步骤1：将粪产碱杆菌冻干粉菌剂充分溶解于1 ml无菌蒸馏水中，将菌种在在ADM固体培养基上划线活化，置于培养箱中37 ℃光照培养1-2天，至平板出现圆形单菌落；

步骤2：挑取ADM固体培养基上的单菌落，接种于pH8.0的ADM液体培养基中，于30-37 ℃，150 r/min振荡培养，至菌种增殖至对数生长期；

步骤3：于6000 rpm离心15 min，收集菌体，用无菌海水重悬并采用麦氏比浊法调整浓度，得粪产碱杆菌液。

本发明是以半裸舟形藻与粪产碱杆菌为功能组分，以蛤蜊壳粉、芦苇提取物及石菖蒲提取物等作为包埋材料制成的固定化藻菌微球，各组分相辅相成、协同互作，具有成本低廉、制备简单、存贮方便等优点，在应用过程中稳定性好、沉降速度快、溃散性和溶失性较低，对于改善海水养殖池塘的底质微生态环境具有协同增效作用，适合大规模生产推广。

作用原理如下：

（1）半裸舟形藻细胞壁为三维多孔的硅质结构，可以为粪产碱杆菌提供生长所需要的栖息地，同时提高菌藻之间的作用面积与扩散速度，并能够作为保护屏障有效抵抗极端环境并缓解有毒物质侵害。同时，半裸舟形藻产生的氧气以及胞外代谢物可被粪产碱杆菌用来矿化有机污染物或转化为利于自身生长的营养源。粪产碱杆菌可以通过分泌促生长因子（维生素B

（2）蛤蜊壳粉含有多孔的碳酸钙等化合物，有利于半裸舟形藻与粪产碱杆菌在其上附着生长，而且这种多孔学腔体结构也有利于溶解氧等物质的交换和输出以及池塘底质中污染物的吸附；芦苇提取物和石菖蒲提取物含有大量的纤维素、蛋白质以及钙、镁、钠等离子，同样是利于半裸舟形藻与粪产碱杆菌定植与生长的良好基质且是潜在的用于微生物降解的碳源，同时可以通过生物吸附、物理过滤和化学沉淀等方式有效去除池塘底质中的有机物、重金属、磷、氮等污染物。蛤蜊壳粉与芦苇提取物、石菖蒲提取物作为包埋材料能够有效克服底质改良剂入水散失严重、不易自然沉降的缺点，有助于实现底质改良剂功能组分在池塘沉积物上的底播定植。

附图说明

图1为本发明实施例半裸舟形藻（A）和粪产碱杆菌（B）的形态特征图。

图2为本发明对比例游离态底质改良剂（A）和本发明实施例（B）的形态特征图。

图3为本发明实施例的半裸舟形藻和粪产碱杆菌的反应机理示意图。

图4为本发明各处理组对海水养殖池塘底质总氮含量的影响示意图。

图5为本发明各处理组对海水养殖池塘底质亚硝酸盐含量的影响示意图。

图6为本发明各处理组对海水养殖池塘底质总磷含量的影响示意图。

图7为本发明各处理组对海水养殖池塘底质磷酸盐含量的影响示意图。

图8为本发明各处理组对海水养殖池塘底质硫化物含量的影响示意图。

图9为本发明各处理组对海水养殖池塘底质氧化还原电位的影响示意图。

图10为本发明各处理组对海水养殖池塘底质重金属含量的影响示意图。

图11为本发明各处理组对海水养殖池塘底质抗生素含量的影响示意图。

图12为本发明各处理组对海水养殖池塘底质致病弧菌含量的影响示意图。

具体实施方式

实施例1

本发明的一种藻菌互作增效的海水养殖池塘底质改良剂，是由包埋材料与半裸舟形藻（

所述蛤蜊壳粉是将蛤蜊壳置于碱液中浸泡后，再依次经水洗、烘干、煅烧、粉碎及过滤而制得。

石菖蒲提取物和芦苇提取物提取物是按照如下方法制备而成：

将石菖蒲或芦苇叶用蒸馏水清洗干净，25℃通风阴干；用匀浆机将石菖蒲或芦苇叶匀浆粉碎，加入质量浓度为70%的乙醇溶液，料液比为1 g/15 ml，在工作频率为50 KHZ，功率为100 W的超声波作用下浸提1.5 h；过滤去掉杂质，将浸提液减压浓缩、冷冻干燥得到冻干粉。

本发明的藻菌互作增效的海水养殖池塘底质改良剂的制备方法，按照如下步骤进行：

步骤1. 称取定量的蛤蜊壳粉、芦苇提取物、石菖蒲提取物、半裸舟形藻液及粪产碱杆菌液，加入氯化钠、去离子水及质量浓度为3%的海藻酸钠溶液，80 ℃水浴加热并搅拌至固体组分溶解，得混合液；

步骤2. 使用无菌注射针头将混合液以20 cm高度慢慢滴入质量浓度为3%的CaCl

所述半裸舟形藻液依次按照如下步骤制备：

步骤1：将冻存的半裸舟形藻解冻后，接种于置于三角瓶的培养基中，初始接种量为10

步骤2：将所述三角瓶置于全自动光照培养箱中培养，培养温度为23℃，光照周期为12 L/12 D，光照强度为3500 lx，每日人工摇晃藻种2-4次；

步骤3：待所述半裸舟形藻培养至对数生长期后，刮取附着在培养基上的半裸舟形藻细胞，于4500 rpm离心15 min，得藻体用无菌海水重悬并采用比浊法调整浓度，得半裸舟形藻液。

半裸舟形藻培养基中添加的葡萄糖酸锌是硅藻光合作用和相关代谢酶的重要组成成分，可有效促进藻细胞对无机碳的吸收和利用，对有毒的重金属离子也具有较强的拮抗作用；芸苔素内酯可以提高硅藻的光合作用效率，加速藻细胞的代谢过程，有效提高半裸舟形藻的生物量积累速度。

所述粪产碱杆菌液依次按照如下步骤制备：

步骤1：将粪产碱杆菌冻干粉菌剂充分溶解于1 ml无菌蒸馏水中，将菌种在在ADM固体培养基（好氧反硝化细菌固体培养基）上划线活化，置于培养箱中37 ℃光照培养1-2天，至平板出现圆形单菌落；

步骤2：挑取ADM固体培养基上的单菌落，接种于pH8.0的ADM液体培养基（好氧反硝化细菌液体培养基）中，于30℃，150 r/min振荡培养，至菌种增殖至对数生长期；

步骤3：于6000 rpm离心15 min，收集菌体，用无菌海水重悬并采用麦氏比浊法调整浓度，得粪产碱杆菌液。

半裸舟形藻购自中国科学院水生生物研究所藻种保藏中心，保藏编号为FACHB-2262；粪产碱杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 23439；蛤蜊壳、芦苇和石菖蒲均为市购原料。

半裸舟形藻和粪产碱杆菌的形态特征如图1所示，半裸舟形藻细胞（A）呈褐色，外覆硅质细胞壁，空壳藻较少，壳面呈茧形，单细胞大小为6.0-9.0 μm。粪产碱杆菌（B）呈短杆状，大小为0.5-2.5 μm，无芽孢，有鞭毛，运动活跃。

实施例1所制备的固定化藻菌微球的形态特征如图2所示，（A）为游离态藻菌细胞，（B）为固定化藻菌微球，其直径1.5-2.5 mm，球体致密、紧实。与游离态藻菌细胞相比，固定化藻菌微球具有良好的沉降能力、传质性能及功能微生物承载能力。

实施例2

本发明的一种藻菌互作增效的海水养殖池塘底质改良剂，是由包埋材料与半裸舟形藻（

所述蛤蜊壳粉、石菖蒲提取物和芦苇提取物提取物同实施例1。

本发明的藻菌互作增效的海水养殖池塘底质改良剂的制备方法，按照如下步骤进行：

步骤1. 称取定量的蛤蜊壳粉、芦苇提取物、石菖蒲提取物、半裸舟形藻液及粪产碱杆菌液，加入氯化钠、去离子水及质量浓度为4%的海藻酸钠溶液，80 ℃水浴加热并搅拌至固体组分溶解，得混合液；

步骤2.使用无菌注射针头将混合液以20 cm高度慢慢滴入质量浓度为2%的CaCl

所述半裸舟形藻液依次按照如下步骤制备：

步骤1：将冻存的半裸舟形藻解冻后，接种于置于三角瓶的培养基中，初始接种量为10

步骤2：将所述三角瓶置于全自动光照培养箱中培养，培养温度为28 ℃，光照周期为12 L/12 D，光照强度为4500 lx，每日人工摇晃藻种2-4次；

步骤3：待所述半裸舟形藻培养至对数生长期后，刮取附着在培养基上的半裸舟形藻细胞，于4500 rpm离心15 min，得藻体用无菌海水重悬并采用比浊法调整浓度，得半裸舟形藻液。

所述粪产碱杆菌液依次按照如下步骤制备：

步骤1：将粪产碱杆菌冻干粉菌剂充分溶解于1 ml无菌蒸馏水中，将菌种在在ADM固体培养基上划线活化，置于培养箱中37 ℃光照培养1-2天，至平板出现圆形单菌落；

步骤2：挑取ADM固体培养基上的单菌落，接种于pH8.0的ADM液体培养基中，于33℃，150 r/min振荡培养，至菌种增殖至对数生长期；

步骤3：于6000 rpm离心15 min，收集菌体，用无菌海水重悬并采用麦氏比浊法调整浓度，得粪产碱杆菌液。

各原料来源同实施例1。

实施例3

本发明的一种藻菌互作增效的海水养殖池塘底质改良剂，是由包埋材料与半裸舟形藻（

所述蛤蜊壳粉、石菖蒲提取物和芦苇提取物提取物同实施例1。

本发明的藻菌互作增效的海水养殖池塘底质改良剂的制备方法，按照如下步骤进行：

步骤1. 称取定量的蛤蜊壳粉、芦苇提取物、石菖蒲提取物、半裸舟形藻液及粪产碱杆菌液，加入氯化钠、去离子水及质量浓度为6%的海藻酸钠溶液，80 ℃水浴加热并搅拌至固体组分溶解，得混合液；

步骤2. 使用无菌注射针头将混合液以20cm高度慢慢滴入质量浓度为4%的CaCl

所述半裸舟形藻液依次按照如下步骤制备：

步骤1：将冻存的半裸舟形藻解冻后，接种于置于三角瓶的培养基中，初始接种量为10

步骤2：将所述三角瓶置于全自动光照培养箱中培养，培养温度为25 ℃，光照周期为12 L/12 D，光照强度为3000 lx，每日人工摇晃藻种2-4次；

步骤3：待所述半裸舟形藻培养至对数生长期后，刮取附着在培养基上的半裸舟形藻细胞，于4500 rpm离心15 min，得藻体用无菌海水重悬并采用比浊法调整浓度，得半裸舟形藻液。

所述粪产碱杆菌液依次按照如下步骤制备：

步骤1：将粪产碱杆菌冻干粉菌剂充分溶解于1 ml无菌蒸馏水中，将菌种在在ADM固体培养基上划线活化，置于培养箱中37 ℃光照培养1-2天，至平板出现圆形单菌落；

步骤2：挑取ADM固体培养基上的单菌落，接种于pH8.0的ADM液体培养基中，于37℃，150 r/min振荡培养，至菌种增殖至对数生长期；

步骤3：于6000 rpm离心15 min，收集菌体，用无菌海水重悬并采用麦氏比浊法调整浓度，得粪产碱杆菌液。

各原料来源同实施例1。

本发明实施例1-3的反应机理如图3所示，半裸舟形藻具有特殊的孔状硅质膜，可以为粪产碱杆菌提供生长所需要的栖息地，并能够有效抵抗极端环境并缓解有毒物质侵害，而其胞外代谢物还可以加强藻菌的黏合并促进共生体的生长。所述粪产碱杆菌可以利用硅藻产生的氧气矿化有机污染物，同时通过释放促生长因子（维生素B

本发明的底质改良剂适宜在养殖周期内长期使用，适宜水温12-30 ℃。在池塘带水的情况下将所述底质改良剂定点施放到海水养殖池塘底部，每次用量3-6 g/m

实验：

一. 改良的f/2培养基中葡萄糖酸锌及芸苔素内酯添加量

对f/2培养基中葡萄糖酸锌及芸苔素内酯两个因素设置不同梯度进行优化筛选。结果表明，葡萄糖酸锌和芸苔素内酯能够有效提高半裸舟形藻的生物量积累速度。当葡萄糖酸锌添加浓度为0.4 mg/L，芸苔素内酯添加浓度为2.0 mg/L时，半裸舟形藻的比生长速率最大，细胞密度相对最高（如表1所示）。

表1 葡萄糖酸锌及芸苔素内酯对半裸舟形藻生物量的影响

二. 在辽宁省锦州市凌海刺参养殖区选择海水养殖池塘用于底质改良剂的应用

养殖池塘面积5000-6000 m

池塘A用作对照例，不施用底质改良剂。

池塘B用作游离藻菌例，游离混合液中藻菌浓度为半裸舟形藻10

池塘C用作藻对比例，只在微球中加入半裸舟形藻及包埋材料，制备方法同实施例2。所制备的微球中半裸舟形藻10

池塘D用作菌对比例，只在微球中加入粪产碱杆菌及包埋材料。添加浓度为粪产碱杆菌10

池塘E、F、G分别为实施例1、2、3组。

各处理组每10 d施用一次底质改良剂，除池塘B外，C-G组的施用剂量5 g/m

池塘试验结束后，从每个处理组取50 kg底泥样品置于圆柱型水族箱（直径100cm，高90 cm）进行污染物侵染试验。每个水族箱加入重金属、抗生素、致病弧菌混合液。其中重金属混合溶液包括铬（Cr）、铅（Pb）、镉（Cd）、汞（Hg），每种组分在底泥中的添加浓度为100μg/g。抗生素混合溶液包括甲氧苄氨嘧啶（TMP）、磺胺甲恶唑（SMX）、四环素（TCS）、林可霉素（LIN），每种组分在底泥中的添加浓度为50 μg/g。致病弧菌包括灿烂弧菌和哈维氏弧菌，每种弧菌在底泥中的添加浓度为10

各处理组底质改良剂对海水养殖池塘底质理化指标的影响如图4-9所示，图4是对海水养殖池塘底质总氮含量的影响示意图；图5是对海水养殖池塘底质亚硝酸盐含量的影响示意图；图6是对海水养殖池塘底质总磷含量的影响示意图；图7是对海水养殖池塘底质磷酸盐含量的影响示意图；图8是对海水养殖池塘底质硫化物含量的影响示意图；图9是对海水养殖池塘底质氧化还原电位的影响。

结果表明，施用底质改良剂之前，各处理组池塘底质理化指标没有明显区别。随着实验的进行，除对照例外，各处理组均能改善养殖池塘各项理化指标，而相比于藻对比例、菌对比例以及游离藻菌例，本发明实施例1、2、3能够更显著地改善养殖池塘各项理化指标。

各处理组对海水养殖池塘底质复合污染物的去除效率如图10-12所示，图10是对海水养殖池塘底质重金属含量的影响，图11是对海水养殖池塘底质抗生素含量的影响，图12是对海水养殖池塘底质致病弧菌含量的影响。结果表明，除对照例外，各处理组均能降低复合污染物含量，而相比于藻对比例、菌对比例以及游离藻菌例，实施例1、2、3能够更显著地降低复合污染物含量。

综合以上实验结果可以看出，本发明各功能组分协同响应、互作增效，可以有效去除海水养殖池塘底质中的氮、磷、硫污染物，有效提高氧化还原电位。同时可以有效去除池塘底质中的重金属、抗生素及致病弧菌，能够显著改善海水养殖池塘底质的微生态环境。