结合诱导的Notch信号传导的过继T细胞疗法的方法和组合物

技术领域

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年8月28日提交的美国临时申请号62/723936的权益，其全部内容明确地通过引用并入本文。

关于序列表的声明

与本申请相关联的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且通过引用并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称为70118_Seq_final_20190827.txt.。文本文件为152KB；创建于2019年8月27日；并在提交说明书时通过EFS-Web一起提交。

政府许可权利声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予CA136551的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

背景技术

过继T细胞疗法是一种将T细胞施用于受试者以改善受试者针对特定靶标的免疫功能的技术。尽管T细胞可以来自任何一个或多个相关个体，但许多技术包括从受试者中收集初始自体细胞，扩增离体T细胞群体，以及将扩增的群体施用返回到同一受试者。一种新兴的方法是使用同种异体细胞作为起始供体材料，这对于适应症而言至关重要，在这些适应症中，受试者的细胞不适合用作基因工程的起始材料，或者在其他方面在根本上是具有缺陷的。无论来源如何，在离体培养过程中都可以操纵T细胞以进一步增强其功效。因此，除了仅扩增细胞数量外，还可针对某些期望特性(例如，抗原反应性或多功能性)选择或修饰T细胞。例如，可以对T细胞进行基因修饰，以表达编码特异性识别目的抗原的免疫受体的异源基因。在CAR T细胞中，对T细胞进行基因修饰以在表面表达嵌合抗原受体(CAR)。CAR通常包含对目的抗原具有增强的亲和力的细胞外结构域。细胞外结构域与细胞内信号传导结构域相连，该细胞内信号传导结构域在抗原结合时激活T细胞。这样的CAR T细胞可以提供强大的工具来对抗病原体和癌细胞，因为在体内与靶抗原结合时，CAR T细胞进行进一步扩增和激活以提供一种可具有对靶标的直接细胞毒性作用以及通过产生细胞因子来影响内源性免疫功能的“活药物”。

尽管过继T细胞疗法在理论上是通用的，并且可以专门用于解决多种疾病，例如癌症、感染性疾病(infectious diseases)和自身免疫性疾病，但人们日益认识到，对治疗的持久临床反应的实现取决于所转移的T细胞的质量，其导致施用后受试者体内肿瘤微环境的增殖、持久性和对耗竭的抵抗力。在离体增殖的初始T细胞群体中和在被输注给患者的最终产品中，对于决定离体和体内稳健T细胞扩增、体内后续持久性、体内T细胞反应的持久性以及体内T细胞毒性的因素的定义一直是挑战。这种挑战部分是由于从来源分离的T细胞表型组成的变化，特别是对于患有恶性肿瘤或免疫系统过度增殖性疾病(例如淋巴瘤和骨髓瘤)的患者。

因此，尽管过继T细胞疗法领域已取得进步，但仍需要在施用后持续向受试者提供具有增强的疗效、活性和持久性的稳健T细胞的方法和组合物。本公开解决了这个和相关需求。

发明内容

提供本发明内容以简化形式介绍概念的选择，这些概念将在下面的具体实施方式中进一步描述。本发明内容不旨在标识所要求保护的主题的关键特征，也不旨在用于帮助确定所要求保护的主题的范围。

在一方面，本公开提供了一种体外培养T细胞的方法。该方法包括将T细胞暴露于包含Notch受体激动剂的培养基足以诱导细胞中Notch受体信号传导的时间。

在一些实施方案中，不在抗原-呈递细胞(APC)的存在下培养T细胞。在一些实施方案中，Notch受体激动剂不在培养基中的细胞上表达。在一些实施方案中，不在表达Notch受体激动剂的抗原-呈递细胞(APC)的存在下培养T细胞。例如，在一些实施方案中，Notch受体激动剂不在培养基中的APC上表达。在一些实施方案中，不在表达δ样配体4(DLL4)的抗原-呈递细胞(APC)的存在下培养T细胞。

在一些实施方案中，T细胞是幼稚T细胞(T

在另一方面，本公开提供了一种体外培养T细胞的方法，其包括将细胞群体暴露于包含Notch受体激动剂的培养基足以诱导细胞中Notch受体信号传导的时间。

在一些实施方案中，不在抗原-呈递细胞(APC)的存在下培养T细胞群体。在一些实施方案中，Notch受体激动剂不在培养基中的细胞上表达。在一些实施方案中，不在表达Notch受体激动剂的抗原-呈递细胞(APC)的存在下培养T细胞群体。例如，在一些实施方案中，Notch受体激动剂不在培养基中的APC上表达。在一些实施方案中，不在表达δ样配体4(DLL4)的抗原-呈递细胞(APC)的存在下培养T细胞群体。

在一个实施方案中，该方法是体外培养幼稚T(T

在一些实施方案中，群体中的T

在上述方面的一些实施方案中，Notch受体激动剂包含与哺乳动物Notch1、Notch2、Notch3或Notch4受体结合的哺乳动物Notch受体配体的结构域。在一些实施方案中，Notch受体激动剂是或包含与哺乳动物Notch受体结合的δ蛋白、Jagged蛋白、抗Notch抗体或其片段或衍生物，或其任何组合。在一些实施方案中，Notch受体激动剂在与Notch受体结合时，能够在Notch受体的负调控区(NRR)中暴露S2切割位点。在一些实施方案中，Notch受体激动剂在与Notch受体结合时，能够在Notch受体的负调控区(NRR)中暴露S2切割位点。

在一些实施方案中，Notch受体激动剂包含δ蛋白或Jagged蛋白的细胞外结构域。

在一些实施方案中，δ蛋白是或包含δ样配体1(DLL1)或其细胞外Notch结合结构域。在一些实施方案中，δ蛋白是或包含δ样配体3(DLL3)或其细胞外Notch结合结构域。在一些实施方案中，δ蛋白是或包含δ样配体4(DLL4)或其细胞外Notch结合结构域。在一些实施方案中，Jagged蛋白是或包含Jagged1或其细胞外Notch结合结构域。在一些实施方案中，Jagged蛋白是或包含Jagged2或其细胞外Notch结合结构域。

在一些实施方案中，Notch激动剂包含Dlk1、Dlk2、DNER、EGFL 7或F3/接触蛋白或其Notch结合衍生物。在一些实施方案中，Notch受体激动剂是抗Notch抗体或其衍生物，其与不在Notch受体的负调控区(NRR)中的Notch细胞外结构域(NECD)中的表位结合。在一些实施方案中，抗Notch抗体(或其抗原结合片段或衍生物)与不在Notch1、Notch2、Notch3和/或Notch4受体的负调控区(NRR)中的Notch细胞外结构域(NECD)中的表位结合。在一些实施方案中，Notch受体激动剂以约0.01μg/ml至约100μg/ml的浓度固定。在一些实施方案中，多个T细胞以足以接触基本上所有固定的Notch受体激动剂的浓度暴露于培养基。

在一些实施方案中，培养基还包含调节T细胞分化的一种或更多种细胞因子或其生物活性片段。在一些实施方案中，一种或更多种细胞因子包括有效浓度的IL-1、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、IL-27、IFN-γ、TNF-α、TGFβ或其组合。在一些实施方案中，T细胞暴露于培养基的时间为约1至约15天。在一些实施方案中，暴露时间为约2至约10天。

在一些实施方案中，多个T细胞暴露于培养基。在其他实施方案中，多个T细胞是在暴露于培养基之前从一个或更多个来源受试者获得的。

在一些实施方案中，方法进一步包括在暴露后从培养基中分离T细胞或其一个或更多个后代T细胞。在已经暴露T细胞(例如T

在一些实施方案中，方法进一步包括将T细胞(或多个T细胞)或其一个或更多个后代T细胞施用于有此需要的受试者。

在一些实施方案中，方法进一步包括用包含编码免疫受体的序列的异源核酸分子转导细胞(或T细胞，例如T

在另一方面，本公开提供了一种产生表达异源免疫受体的T细胞的体外方法。该方法包括执行本文所述的培养方法；和在暴露步骤期间，用包含编码免疫受体序列的异源核酸分子转导T细胞。

在一些实施方案中，T细胞是幼稚T细胞(T

在一些实施方案中，免疫受体包含特异性结合目的抗原的细胞外结构域，其中细胞外结构域可操作地连接至细胞内结构域，该细胞内结构域在细胞外结构域与目的抗原结合时激活T细胞。在一些实施方案中，免疫受体是与结合至主要组织相容性复合物(MHC)分子的目的肽特异性结合的T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，方法进一步包括将T细胞或其一个或更多个后代T细胞施用于有此需要的受试者。

在另一方面，本公开提供了一种过继细胞疗法的方法。方法包括将治疗有效数量的细胞施用于有此需要的受试者，所述细胞通过本文所述的培养T细胞或T细胞群体的体外方法培养而产生。在一些实施方案中，如本文所述，通过培养幼稚T细胞(T

关于本文所述的任何方法学方面，在一些实施方案中，T细胞或T细胞群体表达嵌合抗原受体。在一些其他实施方案中，T细胞是幼稚T细胞(T

在另一方面，本公开提供了一种细胞，该细胞是通过本文所述的任何一种方法产生的群体细胞。

在另一方面，本公开提供了一种治疗组合物，其包含多个本文所述的细胞和有效载体。

在另一方面，本公开提供了一种减少或防止表达嵌合抗原受体的T

在另一方面，本公开提供了一种产生表达嵌合抗原受体的T

关于本文所述的任何方法，在一些实施方案中，Notch受体激动剂不在与一个或多个T细胞共培养的任何细胞上表达。例如，在某些实施方案中，Notch受体激动剂不被APC细胞或骨髓细胞(例如，OP9-DL1细胞)表达。在本文描述的方法的一些实施方案中，T细胞或T细胞群体不与APC共培养。在本文描述的方法的一些实施方案中，T细胞或T细胞群体不与骨髓细胞共培养。在本文描述的方法的一些实施方案中，T细胞或T细胞群体不与OP9-DL1细胞共培养。在本文描述的方法的一些实施方案中，T细胞是T

在另一方面，本公开提供了一种体外培养一个或多个T细胞的方法，该方法包括将T细胞或T细胞群体暴露于包含Notch受体激动剂的培养基足诱导细胞中Notch受体信号传导的时间，其中Notch受体激动剂是肽配体，并且其中T细胞不与表达δ样1(DLL1)的OP9-DL1细胞或骨髓细胞共培养。在一些实施方案中，与OP9-DL1细胞共培养的T细胞相比，T细胞或T细胞群体表现出减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约250％或至少约300％的耗竭。

附图说明

当结合附图时，通过参考以下详细描述，本发明的前述方面和许多伴随的优点将变得更加容易理解同时更好地理解，其中：

图1图解说明了暴露于固定的DLL1(Notch激动剂)(μg/ml)的幼稚T细胞相对于暴露于固定的IgG1(作为对照配体，具有无关结合)的类似细胞或在空白(无配体)组织培养物中孵育的细胞(“TC”；作为对照)的Notch信号传导(由Hes1表达确定的)的相对增加。将细胞在包被有具有纤维连接蛋白的DLL1

图2A和2B分别说明了在不同条件下在培养前后的不同时间点，人CD4+和CD8+ T细胞中Notch1和Notch2受体的相对表达。下方图例指示培养物(TC＝仅包被有纤维连接蛋白的培养板，DLL1＝是针对实验条件的Notch激动剂，且IgG＝包被有对照IgG配体的培养板；所有板均包被有纤维连接蛋白)。

图3A-3D图解说明了在不同条件下在培养前后的不同时间点，人CD4+和CD8+ T细胞中Notch配体(Notch受体激动剂)DLL1、DLL4、JAG1和JAG2的相对表达。下面方图例指示培养物(TC＝组织培养物，DLL1＝是作为实验条件的Notch激动剂，且IgG是对照)。

图4说明了用于示例性流式细胞术测定以鉴定T细胞的分化亚群的门控策略和细胞标志物。

图5A-5E图解说明了在用不同浓度的Notch配体DLL1、抗Notch1抗体(N1)、抗Notch2抗体(N2)或DLL4孵育后通过流式细胞仪测定的，人CD4+或CD8+ T细胞的分化亚群的相对比例。在分析之前，用抗CD3/CD28

图6A和6B图解说明了在不同浓度的DLL1配体、IgG1对照配体的存在下以及在简单的组织培养物(无配体对照)中，用幼稚T细胞开始并用抗CD3/CD28

图7图解说明了在预先包被有2.5μg抗Notch1抗体(“N1”，抗Notch受体抗体和激动剂)、IgG1对照配体的板中，和在简单的组织培养物(无配体对照)中培养的，并用抗CD3/CD28珠刺激的细胞在第5天和第11天的总T细胞数(CD4+和CD8+)。N1抗体以类似于上述研究中的DLL1配体的方式粘附到塑料表面。

图8图解说明了在给小鼠注射Raji肿瘤后通过生物发光成像(BLI)测量的肿瘤负荷。对于施用对照T细胞、组织培养物对照(TC)CAR T细胞、抗Notch1抗体(“N1”)暴露的CART细胞和IgG1(无关的配体对照)暴露的CAR T细胞的个体，示出肿瘤大小。每条线代表小鼠，且符号表示个体数据点。

图9A-9C图解说明了在小鼠中的Raji肿瘤注射和T细胞输注后的几个时间点在血液中的CAR T细胞的水平。用对照T细胞、组织培养物对照(TC)CAR T细胞、抗Notch1抗体(“N1”)暴露的CAR T细胞和IgG1暴露的CAR T细胞处理小鼠。在指定的时间点获得血液，用氯化铵钾溶液裂解，然后用CD45、CD4、CD8和EGFR的抗体染色。在Canto II流式细胞仪上收集数据。图9A说明了在小鼠总淋巴细胞群体中EGFRt+CD8+和CD4+ T细胞的频率。图9B说明了EGFRt+CD8+ T细胞的频率，且图9C说明了在小鼠总淋巴细胞群体中的EGFRt+CD4+ T细胞的频率。

图10A图解说明了在给小鼠注射Raji肿瘤后通过生物发光成像(BLI)测量的肿瘤负荷。对于施用对照T细胞、组织培养物对照(TC)CAR T细胞、抗Notch1抗体(“N1”)暴露的CAR T细胞和IgG1 CAR T细胞的个体，示出肿瘤大小。每条线代表小鼠，且符号表示个体数据点。

图10B图解说明了在Raji肿瘤注射后图10A中表征的小鼠随时间的存活率。将对照T细胞、组织培养物(TC)CAR T细胞、抗Notch1抗体(“N1”)暴露的CAR T细胞和IgG1暴露的CAR T细胞施用于个体。

图11A-11C图解说明了重复刺激测定的结果以评估CAR T细胞重复杀死和消除肿瘤细胞的能力。CD8+ T细胞在相当条件下的单纯组织培养物(TC)中与抗Notch1抗体(“N1”，Notch受体激动剂)、IgG或培养，并被转导以表达对CD19特异的CAR。然后，将细胞以96孔板格式在1:1的效应子：靶比例下暴露于K562-CD19(图11A)或Raji细胞(图11B)。靶细胞未被照射并且培养基缺乏IL-2。在另外的48小时和72小时之后，添加另外的靶细胞以提供反复且恒定的对肿瘤抗原的暴露。在测定过程中确定归一化的T细胞计数，这表明N1暴露的T细胞即使在多次或恒定暴露于抗原后仍保持活性并继续增殖(即，具有最小耗竭)。培养物等分试样的流式细胞术显示，与IgG1暴露的T细胞相比，N1 CAR T细胞更有效地清除了肿瘤细胞(图11C)。

图12A和12B图解说明了向NSG-Raji小鼠输注与Notch受体激动剂一起培养的不同剂量的CD4+CAR T细胞的效果。具体地，将CD4+CAR T细胞培养在包被有2.5μg的抗Notch抗体(N1)或IgG1对照的板上。在培养11天后输注细胞。图12A图解说明了在不同剂量的CD4+CAR T细胞输注后，通过萤火虫荧光素酶的生物发光成像确定的随时间的肿瘤负荷。图12B图解说明了在输注CD4+CAR T细胞后的几个时间点收集的血液中淋巴细胞单重态的CD4+CAR T细胞的百分比。用氯化铵钾溶液裂解来自每个收集的血液，然后用CD45、CD4和EGFR的抗体染色。在Canto 2-1流式细胞仪上收集数据。

图13A和13B图解说明了向NSG-Raji小鼠输注与Notch受体激动剂一起培养的不同剂量的CD8+CAR T细胞的效果。具体地，将CD8+CAR T细胞培养在包被有2.5μg的抗Notch抗体(N1)或IgG1对照的板上。在培养11天后输注细胞。图13A图解说明了在CAR T细胞输注后，通过萤火虫荧光素酶的生物发光成像确定的随时间的肿瘤负荷。图13B图解说明了在输注CD8+CAR T细胞后的小鼠的存活率。

图14A-14C图解说明了在向NSG-Raji小鼠输注之前，CD8+CAR T细胞与Notch受体激动剂(抗Notch抗体，N1)培养7天或11天的效果。具体地，将CD8+CAR T细胞在N1包被的板或IgG1-包被的板上培养7天或培养7天后在普通TC烧瓶(D11组)中培养4天。图14A图解说明了培养7天或11天的CD8+CAR T细胞输注后通过萤火虫荧光素酶的生物发光成像确定的随时间的肿瘤负荷。图14B图解说明了培养7天或11天的CD8+CAR T细胞在输注后在几个时间点收集的血液中淋巴细胞单重态的CAR T细胞的百分比。用氯化铵钾溶液裂解来自每个收集的血液，然后用CD45、CD8和EGFR的抗体染色。图14C图解说明了在输注CD8+CAR T细胞后的小鼠的存活率。

图15A和15B分别图解说明了在输注单独与抗Notch抗体(N1激动剂)或对照(IgG抗体)一起孵育的CD4+和CD8+CAR T细胞的混合物后CD4+CAR T细胞和CD8+CAR T细胞的体内增殖。单独培养CD4+CAR T细胞和CD8+CAR T细胞并在第11天以指示的组合以1:1比例混合在一起，并输注到NSG-Raji小鼠中。

图16A-16C说明了在Notch受体激动剂(抗Notch1抗体N1)存在下培养的CD4+细胞的表型特征。图16A图解说明了与IgG抗体对照一起孵育的细胞相比，如通过TMRM染色确定的，与Notch激动剂一起孵育的CD4+细胞的线粒体膜电位。图16B图解说明了由Notch激活引起的降低的线粒体膜电位主要发生在CD45RA高/CD45RO低CD4+细胞中。图16C说明了与Notch受体激动剂(抗Notch1抗体N1)或IgG对照一起培养的CD8+细胞的散点图，表明Notch刺激增加了T细胞中独特的分子谱。

图17图解说明了基于发育标志物的表达谱分类为T

图18A和18B图解说明了基于发育标志物的表达谱分类为T

图19A和19B图解说明了基于发育标志物的表达谱分类为T

图20图解说明了基于发育标志物的表达谱分类为T

具体实施方式

如上所述，离体扩增和/或操纵的T淋巴细胞(“T细胞”)在过继细胞疗法中可用于多种病症，包括癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病。认为在受试者中施用的T细胞在一段时间内的持久性和功能与治疗的总体稳健性和持久性相关。然而，对决定离体和体内稳健T细胞扩增、体内持久性、体内T细胞反应的持久性以及体内T细胞毒性的因素的定义一直是一项挑战。

对于过继细胞疗法的稳健性和持久性的基本机制的清楚了解的一个障碍是从原始来源分离的T细胞的异质性。不同的T细胞亚群似乎具有差异性地影响过继细胞疗法的独特属性。例如，在非人类灵长类动物中，已经证明源于中央记忆T细胞(T

鉴于这样的发现，已经提出了T细胞分化的渐进模型，尽管要指出的是，也已经提出了其他T细胞分化的模型并且看似合理。在渐进模型中，在胸腺中经历成熟和选择的循环T细胞通过分化状态发展，其中细胞的增殖能力和自我更新能力与处于不同分化状态的T细胞的效应子功能能力成反比。T细胞开始具有相对较高的增殖和自我更新能力以及相对较低的效应子功能，但在分化过程中逐渐转变至具有降低的增殖和自我更新能力但具有增强的效应子功能的状态。在该示例性模型中，T细胞分化状态(即，可识别的T细胞亚群)被指定为从幼稚T细胞(T

已经探索了获得相对均匀和未分化的T细胞的方法。例如，较低分化的T细胞亚群(例如T

可能的是，相对“年轻”或未分化的T细胞的存在可能改善过继细胞疗法的长期功效。尽管存在获得相对未分化T细胞的各种方法，但它们在过继T细胞疗法中的实际应用受到限制。例如，考虑到许多策略(例如增强Wnt信号传导或抑制Akt)不利地影响T细胞增殖，因此一项挑战是维持早期未分化的表型而不限制T细胞数量。

本文探讨了Notch信号传导在离体T细胞(包括工程化T细胞)增殖和分化中的作用以及对实际和长期体内治疗效果的影响。

Notch信号传导通路是高度保守的通路，其可促进后生动物中细胞间的信号传导。哺乳动物Notch受体(例如，Notch1、Notch2、Notch3和Notch4)是I型跨膜受体，其最初以具有细胞外结构域(NECD)、跨膜结构域和细胞内结构域(NICD)的前体形式表达。前体被弗林蛋白酶转化酶切割以提供具有两个亚基的成熟受体。一个亚基由大部分NECD组成，而NECD与另一亚基保持非共价结合，该另一个亚基包含跨膜结构域和NICD。Notch受体的NECD在N端侧具有一系列表皮生长因子(EGF)样重复序列，其在配体相互作用中起作用。在EGF重复序列(相对于EGF重复序列的亚基的C端侧)之后是三个富含半胱氨酸的LIN12和Notch(LNR)重复序列，它们在防止配体依赖性信号传导中起作用，和异源二聚体结构域(HD)。具有LNR和HD结构域的区域称为负调控区(NRR)。

在典型情况下，当NECD结合到对立细胞(opposing cell)表面上存在的合适配体时，Notch信号传导就会启动。典型配体(canonical ligands)，配体Jagged1(例如，GenBank登录号AAC51731)、Jagged2(例如，GenBank登录号AAD15562)、δ样1(DLL1；例如，GenBank登录号ABC26875或NP005609)、δ样3(DLL3；GenBank登录号NP_982353.1或NP_058637.1)或δ样4(DLL4；例如GenBank登录号NP_061947.1)(每个登录号的序列通过引用并入本文)也是I型跨膜蛋白，并具有带有N端区域、富含半胱氨酸的δ-锯齿状和Lag2(DSL)区域以及不同数量的EGF重复序列的细胞外结构域。参见例如，Falix F.等人，Biochimica et BiophysicaActa(BBA)–Molecular Basis of Disease,1822(6):988-996(2012)，其整体内容通过引用并入本文。合适的配体与邻近细胞中出现的Notch受体的结合导致构象变化，从而暴露Notch受体NRR中的S2切割位点，允许蛋白水解。构象变化被认为是由于配体经内吞作用进入表达配体的细胞而由内化引起的机械“拖拉”所致。在S2位点的Notch受体的最初切割后，额外的蛋白酶解在细胞内发生以将NICD与跨膜结构域分开。然后，活性NICD易位至细胞核，并参与一系列转录激活和抑制通路。关于Notch信号传导及其调节的讨论，参见例如，WO2018/017827，其整体内容并入本文。

已证实Notch在调节细胞增殖、分化、发育和体内平衡中起关键作用。在成年哺乳动物中，Notch信号传导在许多过程中继续发挥关键作用，包括神经和造血干细胞的更新和分化，以及许多免疫细胞亚群的发育。Notch信号传导与T细胞信号传导和刺激的相互作用在Falix F.等人，Biochimica et Biophysica Acta(BBA)–Molecular Basis of Disease,1822(6):988-996(2012)(其整体内容通过引用并入本文)中进行了讨论。典型的T细胞信号传导通过表面T细胞受体(TCR)，通常通过细胞呈现的MHC上显示的适当肽的结合，联合通过共刺激信号的信号传导而被介导。Notch也在T细胞上表达，并可通过多种通路影响T细胞分化。在典型的通路中，Notch信号传导促进Hes1基因的表达，其进而通过抑制PTEN抑制剂促进TCR信号传导。此外，Notch受体的内吞作用和消化作用促进导致NFκB的产生和PI3K/Akt/mTor通路的促进的相互作用，其可刺激增殖、存活和分化。

然而，Notch信号传导的功能结果很难预测，因为不同情况下的不同细胞表现出Notch信号传导的不同表型效应。例如，最近的研究表明，由Notch信号传导在干细胞中介导的特异性相互作用有助于干细胞的静止，这反过来可以允许干细胞的自我更新和多能性的维持，直到它们被适当的刺激激活。参见例如，Dahlberg等人，Blood 117:6083-6090(2011)(其整体内容通过引用并入本文)，其教导Notch2信号传导通过阻断分化为多能祖细胞(MPP)和骨髓/单核细胞(M)细胞谱系而影响造血干细胞自我更新。另一方面，Notch1被描述为促进T细胞分化与来自MPP的B细胞(B)分化。发明人先前已经证明，固定的δ1

然而，Notch信号传导也已显示出刺激MPP向T细胞的分化。如上所述，Notch信号传导已显示促进PI3K/Akt/mTor通路，其可刺激T细胞的增殖、存活和分化。因此，Notch信号传导在T细胞的进一步分化中的作用是有争议的，已观察到多种转录作用。因此，Notch信号传导对增殖、发育和/或静止的影响可能非常依赖于环境。最终，尚不清楚Notch是否会对T细胞的分化产生抑制或激活作用。

鉴于Notch信号传导在细胞类型从HSC分化为成熟T

如下文更详细描述的，发明人研究了在T细胞的离体培养期间Notch信号传导的作用，CAR T细胞的发育以及在施用于鼠肿瘤模型后对此类细胞功效的影响。例如，在扩增和基因修饰过程中，将幼稚T细胞暴露于各种Notch激动剂，引入靶向肿瘤的嵌合抗原受体以确定Notch信号传导是否维持T细胞具有与较早(即，较低)分化状态一致的表型，并增强治疗活性。扩增后分析T细胞的细胞表面表型，这表明暴露于Notch信号传导的T细胞的较大部分保留了以CD45RA和CD62L的更高表达为特征的早期表型。在进一步的示例性测定中，与在相同条件但不存在Notch激活激动剂的条件下培养的CAR T细胞相比，在被过继转移至移植了人B细胞肿瘤的NSG小鼠中后，被转导以表达肿瘤特异性CAR并用Notch激活激动剂培养的T细胞显示出更大的扩增，更优异的长期持久性和更强的抗肿瘤活性。此外，Notch激活的细胞惊人地保持了活性，甚至在多次或持续暴露于抗原后仍继续增殖，从而证明了避免耗竭的能力。尽管这些测定结合使用掺入CD19特异性CAR T细胞和移植的人CD19+B细胞肿瘤的模型，但观察到的结果不是特定抗原和相应CAR的功能，因此，将适用于使用过继细胞疗法(包括使用任何抗原/CAR组合)的任何T细胞。独立地针对CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的进一步测定表明，诱导的Notch信号传导对这些细胞群体具有不同的作用，并且CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的混合提供了与增殖和抗肿瘤作用相关的协同作用。因此，在产生治疗性T细胞的过程中增强Notch信号传导可以提供具有更高的效能和持久性的细胞用于增强疗效。该技术还具有使用双特异性靶向剂将Notch激动剂特异性靶向选定的T细胞亚群的潜力，以抑制分化并开发出用于癌症、感染性疾病和自身免疫性的免疫疗法的高效细胞。参见，例如，WO 2018/017827，其整体内容并入本文。

根据前述内容，本公开大体上尤其涉及促进T细胞的相对未分化状态的方法，其包括刺激T细胞中的Notch信号传导，包含所得T细胞的组合物以及使用所得T细胞的治疗方法。

在一方面，本公开提供了一种体外培养T淋巴细胞(“T细胞”)的方法。该方法包括将T细胞暴露于Notch受体激动剂足以诱导细胞中的Notch受体信号传导的时间。在另一方面，本公开提供了一种体外培养T细胞的方法，其包括将T细胞群体暴露于包含Notch受体激动剂的培养基中足以诱导细胞中的Notch受体信号传导的时间。这些方法的各种要素将在下面更详细地描述。

在一些实施方案中，不在抗原-呈递细胞(APC)的存在下培养T细胞或T细胞群体。在一些实施方案中，Notch受体激动剂不在培养基中存在的细胞上表达。在一些实施方案中，不在表达Notch受体激动剂的抗原-呈递细胞(APC)的存在下共培养T细胞或T细胞群体。例如，在一些实施方案中，Notch受体激动剂不在培养基中的APC上表达。在一些实施方案中，不在表达δ样配体4(DLL4)的抗原-呈递细胞(APC)的存在下培养T细胞或T细胞群体。

现在描述T细胞。尽管说明书通常是在该方法中单个T细胞的背景下进行的，但应理解，除非另有明确说明，否则说明书也可总体上适用于T细胞群体。

在一些实施方案中，T细胞特征在于在其表面上表达CD3和CD28(CD3阳性(+)和CD28阳性(+))。T细胞可以处于任何发育状态(即，T细胞亚群)，例如选自包括幼稚T细胞(T

在一些实施方案中，T细胞特征在于较低的分化，即具有相对高的增殖能力和低的效应子功能能力。在一些实施方案中，公开的方法(包括将T细胞暴露于Notch受体激动剂)的进行促进较低分化的状态的维持。例如，T细胞可以是幼稚T细胞(T

T细胞的特征还在于存在或不存在特定的表面标志物。例如，对于一种或更多种以下表面标志物，T细胞可呈阳性：CCR7、CD62L、CD45RA、CD27、CD28、CD95和CD127。在一个实施方案中，T细胞至少对CD62L呈阳性。在一个实施方案中，T细胞至少对CD62L和CD45RA呈阳性。

在一些实施方案中，T细胞对于一种或更多种以下表面标志物呈阴性：CD45RO、CD95、PD-1、Lag-3和CD25。在一个实施方案中，T细胞至少对CD45RO和CD95呈阴性。

在一个实施方案中，T细胞是CD62L+、CD45RA+和CD45RO-。在一个实施方案中，T细胞是CD62L+、CD45RA+、CD45RO-和CD95-。在另一个实施方案中，T细胞是CD62L+、CD45RA+、CD45RO-和CD95-。

在一些实施方案中，T细胞的特征为“中度分化的”，即与T

在一些实施方案中，方法在多个T细胞上执行，这可以称为“成批细胞(batch)”。成批细胞可以最初从单个供体个体获得，或者可以是最初从多个个体(通常是相同物种)获得的T细胞的组合成批细胞。在下文讨论的过继细胞疗法的背景下，作为来源的一个或多个个体可以与接受T细胞或其后代的施用的受试者相同或不同。细胞通常从获自作为来源的一个或多个个体的生物学样品(例如血液样品)中移出或分离。在某些实施方案中，细胞通过对作为来源的一个或多个个体的单采血液成分法或白细胞单采术获得。可以包括一个或更多个处理步骤以从生物样品的其他组分中分离相关淋巴细胞，包括离心、洗涤和与适当试剂一起孵育。如上所述，可以基于T细胞和/或期望的T细胞分化亚型特有的适当表面标志物的表面表达，通过选择进一步分离细胞。可以使用例如结合流分离、免疫亲和磁珠、免疫亲和层析等的免疫染色技术来完成选择。

T细胞可以是基本上同质的，这意味着约60％、70％、80％、90％或全部(或包括在约60％至100％范围内的任何％)具有相似的标志物表达谱，其定义了T细胞的特定亚群、谱系、特征和/或分化状态。

然而，在一些实施方案中，不是针对任何单一类型的分化亚型预先选择多个T细胞，而是大量选择，即具有T细胞亚群或相关标志物谱的变异(可能实质性变异)。就这一点而言，批次可以包括例如，表征为代表至少两种或更多种上述分化亚型的T细胞。在一些实施方案中，批次主要是(即，超过约50％、60％、70％、80％、90％、95％)“较低分化”(即，T

此外，在一些实施方案中，多个T细胞中的单个T细胞(或基本上所有，例如至少约90％或更多)可以是CD4+、CD8+，或CD4+和CD8+可以任何相对比例组合存在。例如，在一些实施方案中，选择多个T细胞以包含CD4+ T细胞(不包括CD8+细胞)，CD8+细胞(不包括CD4+)或它们同时具有CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。如以下实施例4中更详细描述的，已确定暴露于Notch受体激动剂对CD4+ T细胞和CD8+ T细胞均具有正面作用，这些作用的特征不同。已经证明，尽管通过Notch信号传导诱导CD4+ T细胞具有更大的增殖，但是与以相同方式通过Notch信号传导独立诱导的CD8+ T细胞相比，它们表现出较小的抗肿瘤作用。然而，已确定将Notch诱导的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞组合使用具有协同作用，导致显著提高增殖率、对耗竭的抵抗力和抗肿瘤作用。此外，已确定特别地将CD4+ T细胞暴露于Notch激动剂对增殖、对耗竭的抵抗力和抗肿瘤作用具有最大影响。因此，在一些实施方案中，暴露于Notch受体配体的多个T细胞包含CD4+ T细胞或由CD4+ T细胞组成。随后可以将Notch刺激的CD4+ T细胞与尚未暴露于Notch受体配体的CD8+ T细胞顺序组合施用或协调施用。

暴露于Notch受体激动剂的T细胞起始群体的其他示例性组合包括CD4+:CD8+细胞比率为约20:1至约1:20的T细胞。例如，多个T细胞的CD4+:CD8+细胞比例可为约20:1、约19:1、约18:1、约17:1、约16:1、约15:1、约14:1、约13:1、约12:1、约11:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:13、约1:14、约1:15、约1:16、约1:17、约1:18、约1:19和约1:20。

基于表面标志物的期望细胞的选择可以例如使用如上所述的基于免疫染色的技术来完成。

在一些实施方案中，方法是体外培养幼稚T(T

哺乳动物中的Notch受体包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4，并且对于人类、啮齿动物和其他物种而言其同源物是本领域普通技术人员已知的并且容易确定的。例如，人Notch1的代表性氨基酸序列在Genbank登录号P46531中提供，其整体内容通过引用并入本文，并在本文中示为SEQ ID NO:7。其他Notch受体是众所周知的，并且易于识别。人Notch2的代表性实例在Genbank登录号NP_077719.2中提供，其整体内容通过引用并入本文，并在本文中示为SEQ ID NO:8。人Notch3的代表性实例在Genbank登录号AAB91371.1中提供，其整体内容通过引用并入本文，并在本文中示为SEQ ID NO:9。人Notch4的代表性实例在Genbank登录号AAC63097.1中提供，其整体内容通过引用并入本文，并在本文中示为SEQ IDNO:10。上述每个登录号均通过引用并入本文。

公开的方法包括将一个或更多个T细胞暴露于Notch受体激动剂。如上所述，Notch受体被整合到高度保守的信号传导通路中，其促进细胞间信号传导。如下文更详细地描述的，发明人已经确定T细胞暴露于刺激Notch细胞信号传导的Notch受体激动剂导致在体内施用时T细胞保持较低的分化状态，并提高存活率和持久性。反过来，这表现出增强的抗肿瘤活性和降低的耗竭易感性。

术语“Notch受体激动剂”是当Notch受体在细胞表面表达时，以功能上导致Notch信号传导的方式特异性结合Notch受体的分子。例如，本公开的Notch受体激动剂包括哺乳动物Notch受体的任何典型或非典型配体(例如，结合哺乳动物Notch1、Notch2、Notch3或Notch4受体的配体)，或特异性结合哺乳动物Notch受体并且具有导致在表达Notch受体的细胞中的Notch受体信号传导的激动剂功能的任何亲和试剂。Notch受体激动剂通常也可以称为“Notch配体”、“Notch配体”、“Notch激动剂”、“Notch受体激动剂配体”等。

如本文所用，术语“Notch信号传导”或与Notch受体激动剂接触时对Notch受体的功能的其他提及是指由于细胞膜中表达的成熟Notch受体的蛋白水解切割而发生的细胞信号级联。如上所述，Notch信号传导是通过在NECD的C端附近的S2位点处的蛋白水解切割而引发的。在静止或无信号传导状态下，S2切割位点受到负调控区(NRR)的关闭确认保护，其直接封闭切割位点并阻止接近蛋白酶。参见例如，Gordon等人，“Structure of theNotch1-negative regulatory region:implications for normal activation andpathogenic signaling in T-ALL”Blood,113(18):4381-4390(2009)，其全部内容通过引用并入本文。当配体以导致暴露出细胞外结构域的NRR中的S2切割位点的构象变化的方式结合到细胞外结构域时，就会发生配体介导的信号传导的激活。构象变化不一定是自动的，但是当配体或其他结合分子在Notch受体上施加力或应变时发生，从而改变NRR的关闭确认。因此，Notch受体激动剂不仅结合NECD，而且以施加足够力或“拖拉”的方式结合，以诱导暴露S2切割位点所需的构象变化。S2切割位点的暴露允许蛋白水解切割和随后的细胞内信号传导。如下所述，在任何Notch配体或结合分子中“拖拉”的功能可以通过将Notch受体激动剂适当地呈现给表达Notch受体的细胞来实现，如下文更详细地描述的。

Notch信号传导可通过测量由Notch激活产生的下游基因产物(例如Hes1表达)来监测。或者，可以使用报告系统来指示Notch信号传导，例如CHO-K1 Notch报告系统。参见，例如，Sprinzak,D.等人，“Cis-interactions between Notch and Delta generatemutually exclusive signalling states,”Nature 465(7294):86-90(2010)，其全部内容通过引用并入本文。

本公开涵盖并描述了Notch受体激动剂的非限制性实例。

Notch受体激动剂可以是或可以包含已被证实诱导Notch信号传导的典型哺乳动物Notch受体配体或其Notch结合结构域。哺乳动物中的典型Notch配体包括Jagged蛋白(例如，Jagged1和Jagged2)和δ蛋白(例如，DLL1、DLL3、DLL4；其中DLL是“δ样配体”的缩写)，其各自都是众所周知的并被本公开涵盖和包括。作为非限制性实例，代表性的典型Notch配体序列包含在GenBank登录号AAC51731(Jagged1；在本文中示为SEQ ID NO:11)、GenBank登录号AAD15562(Jagged2；在本文中示为SEQ ID NO:12)、GenBank登录号ABC26875(部分序列)或NP005609(DLL1；在本文中分别示为SEQ ID NOS:13和14)、GenBank登录号NP_982353.1或NP_058637.1(DLL3；在本文中分别示为SEQ ID NOS:15和16)和NP_061947.1(DLL4；在本文中示为SEQ ID NO:17)(每个登录号的序列通过引用并入本文)中公开的序列、其同源物或功能性(Notch结合)变体、片段或衍生物。这些典型的Notch配体(统称为DSL配体)通常包含N端区域、DSL结构域和至少两个EGF样重复序列，其是与Notch受体的EGF重复序列11和12相互作用所必需的。因此，在一些实施方案中，本公开的Notch受体激动剂包含如本文所述的δ蛋白或Jagged蛋白的细胞外结构域，例如脊椎动物(例如，哺乳动物)或无脊椎动物δ蛋白或Jagged蛋白。Notch1-DLL4的相互作用区域的2.3埃分辨率晶体结构表明对结合很重要的配体-受体复合物的结构组分。参见Luca,V.C.等人，“Structural Basis for Notch1Engagement of Delta-Like 4,”Science 347(6224):847-853(2015)。Luca等人,(2015)，其全部内容通过引用并入本文，进一步公开了对野生型DLL4的修饰，其增强了对受体的结合亲和力，从而进一步阐明了与Notch受体结合所需的典型Notch配体中所需的和关键的结构域。因此，本领域普通技术人员可以容易地从已知或推定的Notch配体中鉴定出最小的Notch结合结构域。在一些实施方案中，Notch受体激动剂不是DLL1。在其他实施方案中，T细胞或T细胞群体不与表达DLL1的任何其他细胞共培养。

在一些实施方案中，本公开的Notch受体激动剂可包含在野生型序列中具有一个或更多个导致对Notch受体的修饰的(例如，增强的)亲和力的突变的多肽序列。例如，如在Luca,V.C.等人，“Structural Basis for Notch1 Engagement of Delta-Like 4,”Science 347(6224):847-853(2015)(其全部内容并入本文)中公开的大鼠DLL4的E12变体所证明的，单独地或以任何组合的G28S、F107L、L206P、N118I、I143F、H194Y、K215E的突变可增强结合的亲和力。因此，在说明性的非限制性实施方案中，Notch结合结构域可包含与SEQID NO:2中所示的序列具有至少80％(例如，约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％)序列同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO:2是大鼠DLL4片段的野生型多肽序列，其对应于全长前体的MNNL至EGF2结构域(即，氨基酸位置27至283)。全长大鼠DLL4前体在本文中示为SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，Notch结合结构域包含多肽，该多肽的序列在选自以下的氨基酸位置上包含至少一个取代：28、43、52、96、107、118、143、146、183、194、206、215、223和257(位置相对于SEQ ID NO:1中所示的参比序列中的位置编号并且通过比对可以容易地确定其他DLL蛋白中的相应的同源位置)。在某些实施方案中、至少一个取代增强亲和力。在一些实施方案中、至少一个取代选自：G28S、M/V43I、P52S、S96I、F107L、N118I、I143F/T、Q146K、S183N、H194Y、L206P、K215E、L223R和N257K，或在同源序列中相应氨基酸残基处的类似取代。在一些情况下，高亲和力Notch受体配体包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的上述取代。考虑上述取代的任何组合。取代的特定组合的实例包括但不限于：(i)P52S、F107L、L206P；(ii)F107L、L206P、N257K；(iii)F107L、L223R、N257K；(iv)G28S、M43I、F107L、N118I；(v)G28S、F107L、N118I、Q146K、H194Y、L206P、K215E；(vi)G28S、F107L、N118I、I143F、H194Y、L206P、K215E；(vii)G28S、M43I、S96I、N118I、I143T、S183N、H194Y、L206P、K215E；(viii)G28S、F107L、L206P；和(ix)G28S、F107L、L206P、N257K(或同源序列中相应氨基酸残基处的类似取代)。本公开涵盖的示例性DLL4可从R&D Systems获得(目录号1506-D4/CF)。

在Luca等人，(2015)中还公开了Jagged蛋白的突变可以映射到DLL4的序列，表明该配体上重要的残基用于与Notch受体接触和结合。因此，本公开的Notch受体激动剂可包含与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少80％(例如约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％)序列同一性的氨基酸序列，其示出了与完整野生型大鼠Jagged1多肽的氨基酸32至295相对应的氨基酸序列。完整的野生型大鼠Jagged1多肽序列如SEQ ID NO:3所示。在另外的实施方案中，本公开的Notch受体激动剂可在选自相对于SEQ ID NO:3中的位置的100和182的氨基酸位置处包含至少一个取代(尽管不需要整个序列；通过比对可以很容易地确定其他DLL蛋白中的同源位置)。在某些实施方案中，至少一个取代选自：P100H、Q183P及其组合。或者，在同源序列中，至少一个取代可以在同源序列中相应的一个或多个氨基酸残基位置处。

在其他实施方案中，本公开的Notch受体激动剂可包含与SEQ ID NO:5或6所示的序列具有至少80％(例如约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的氨基酸序列，其分别示出了代表性人Jagged2(Genbank登录号：AAD15562.1)和人δ样1(DLL1；Genbank登录号NP005609.3)的细胞外Notch-结合区的氨基酸序列。鉴于以上结构研究和其他可获得的数据，本领域普通技术人员可以容易地确定参比序列中允许的变异，其仍然导致与Notch受体的功能性结合。

除了典型的Notch受体配体或其Notch受体-结合结构域之外，本公开的Notch受体激动剂还可包含任何非典型的Notch受体配体的Notch结合结构域(或其Notch结合衍生物或片段)，只要其具有或保留激动剂活性。参见，例如，Hu,Q.,等人，“F3/contactin acts asa functional ligand for Notch during oligodendrocyte maturation,”，Cell 115(2):163–175(2003)；Schmidt,M.H.等人，“Epidermal growth factor-like domain 7(EGFL7)modulates Notch signalling and affects neural stem cell renewal,”NatCell Biol 11(7):873–880(2009)；和D’Souza,B.,等人,“Canonical and non-canonicalNotch ligands,”Curr Top Dev Biol 92:73–129(2010)，其各自的全部内容通过引用并入本文。本公开涵盖了保留结合和激活靶Notch受体的能力的任何片段或衍生物，其可以被本领域普通技术人员容易地测定。参见例如，本文其他各处公开的测定法。在一些实施方案中，衍生物可以包含具有至少80％(例如，约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％)的非典型Notch受体配体的来源Notch结合结构域的序列的氨基酸序列。

尽管以上描述包括大鼠或人Notch配体的实例，但应理解，所指出的用作Notch受体激动剂的Notch配体的哺乳动物来源可包括人、非人灵长类动物(包括例如，猿和猴子等)、啮齿动物(包括例如，大鼠、小鼠、豚鼠等)、狗、猫、马、牛、猪、羊等的非限制性实例。非哺乳动物Notch配体，例如果蝇(Drosophila)Serrate和Delta，也是众所周知的，并且被本公开所涵盖。如图所示，Notch信号传导系统是高度保守的，因此，本领域普通技术人员可以容易地确定Notch受体和各自的Notch配体之中的同源序列位置。此外，通过例如进行检测Notch诱导的细胞转录活性的测定(例如，如下所述的Hes基因转录)，可以容易地确定Notch受体配体的激动剂活性。

除了如上所述的典型或非典型Notch配体或其Notch结合结构域之外，本公开涵盖的Notch受体激动剂可以是或包含设计为以激动剂功能与Notch受体结合的亲和试剂。如本文所用，“亲和试剂”是指可以升高的亲和力(即，可在背景上检测的)结合靶抗原(在这种情况下为Notch受体的NECD的相关结构域)并由此诱导Notch信号传导的任何分子。对Notch受体的结合亲和力可以是特异性的或选择性的，但不必如此。如本文所用，术语“特异性结合”或其变化形式是指在本领域已知的标准条件下，亲和试剂组分结合目的抗原(例如Notch受体)而不明显结合其他分子或NRR结构域的能力(如下所述)。抗原-结合分子可以结合其他肽、多肽或蛋白质，但是具有较低的亲和力，如通过例如免疫测定、BIAcore或本领域已知的其他测定所确定的。然而，亲和试剂优选基本上不与其他抗原或NRR结构域交叉反应。

亲和试剂的示例性非限制性类别包括抗体、抗体样分子(包括抗体衍生物及其抗原(即Notch)-结合片段)、与特定抗原(例如肽体)特异性相互作用的肽、抗原结合支架(例如，DARPins、HEAT重复蛋白、ARM重复蛋白、三角形四肽重复蛋白和基于天然重复蛋白的其他支架等，[参见例如，Boersma and Pluckthun,Curr.Opin.Biotechnol.22:849-857,2011，和其中引用的参考文献，各自的整体内容通过引用并入本文]、适体或功能性Notch结合结构域或其片段。这些亲和试剂将在下面的“其他定义”部分中更详细地描述。可以通过应用已知技术结合上述Notch受体的NECD来产生激动剂亲和试剂。

当激动剂亲和试剂与NECD结合而不干扰负调控区(NRR)的功能以发生构象变化时，它们“以激动剂功能”与Notch结合。如上所述，NECD包含含有EGF样重复序列的延伸部分，然后是NRR。激动剂亲和试剂结合Notch受体的NECD内的表位，但NRR中的任何表位除外。这允许NRR在激动剂亲和试剂结合后改变其关闭的确认(closed confirmation)，从而暴露S2蛋白水解位点以允许信号传导。NECD中可用于结合以赋予信号传导功能的结构域通常从N端延伸到正好NRR开始之前。参见例如，Gordon等人，Blood,113(18):4381-4390(2009)的图1，其全部内容通过引用并入本文。NECD中用于结合的该靶结构域包括EGF样重复基序。在一些实施方案中，激动剂亲和试剂结合的包含表位的结构域在对应于例如SEQ ID NO:7(对于Notch1受体)的氨基酸位置1至约氨基酸位置1446；SEQ ID NO:8(对于Notch2受体)的氨基酸位置1至约氨基酸位置1421；SEQ ID NO:9(对于Notch3受体)的氨基酸位置1至约氨基酸位置1383；SEQ ID NO:10(对于Notch4受体)的氨基酸位置1至约氨基酸位置1170的区域中。基于与上述氨基酸位置的比较以及在Gordon等人，Blood,113(18):4381-4390(2009)中公开的比对，可以容易地确定来自不包括NRR的其他Notch同源物的NCD的亚域。

如所指出的，激动剂亲和试剂包括抗体或Notch受体结合片段及其衍生物。结合本公开所包括的Notch的非限制性示例性抗体包括N1抗Notch1抗体(HMN1-519，Biolegend目录号352104)以及在例如Wu等人，Nature 464:1052-57(2010)；美国专利号9,683,039 B2、10,370,643 B2、10,208,286 B2、9,221,902 B2、6,689,744 B2、6,090,922 A或6,149,902A；或美国公开号2011/0286916 A1或2005/0222074 A1中公开的Notch1激动性抗体；其各自的全部内容通过引用并入本文。非限制性示例性Notch2激动性抗体包括但不限于HMN2-25(在本文中也称为“N2”；Biolegend目录号348301)，或在例如Wu等人，Nature 464:1052-57(2010)；美国专利号9,683,039B2、10,370,643 B2、10,208,286 B2、9,221,902 B2、6,090,922 A或6,149,902 A；或美国公开号2005/0222074A1中公开的抗体；其各自的全部内容通过引用并入本文。Notch3激动性抗体的非限制性实例包括但不限于在例如Machuca-Parra等人，J.Exp.Med.214(08):2271-82(2017)；Li等人，J.Biol.Chem.283(12):8046-54(2008)；美国专利号9,518,124 B2、9,089,556 B2、9,221,902 B2、8,513,388 B2、6,090,922 A或6,149,902 A；美国公开号2008/0118520 A1、2008/0131908 A1或2005/0222074A1；或国际申请号WO 2010/141249 A2中公开的抗体；其各自的全部内容通过引用并入本文。Notch4激动性抗体的非限制性实例包括但不限于在例如，美国专利号10,227,567 B2、9,221,902 B2、6,090,922 A或6,149,902 A；或美国公开号2005/0222074 A1中公开的抗体；其各自的全部内容通过引用并入本文。

如上所述，由激动剂诱导的Notch信号传导不仅需要足够的激动剂结合亲和力，而且该结合必须是施加足够的机械力或“拖拉”的方式，以诱导所需的构象变化，从而允许在S2切割位点的蛋白水解切割。因此，必须将Notch受体激动剂适当地提供给Notch表达细胞，使得可以施加所需的力或拖拉。

在一些实施方案中，Notch受体激动剂以对其在与T细胞接触时刺激Notch信号传导的能力没有负面影响的方式固定化。可以将Notch受体激动剂固定在表面上，例如组织培养板的表面，或者固定在适用于培养基中的混合物的颗粒或珠子上。固定化，例如在板或孔的表面上，将防止表达Notch的T细胞移动离开，从而在配体-受体复合物上产生足以改变Notch确认的张力。类似地，颗粒或珠子或其他大体积载体与配体的附着提供了类似地产生对配体-受体复合物的张力的体积或重量。在其他实施方案中，Notch激动剂附着至可溶性支架，例如水凝胶。与其他服务或支架类似，这可为配体提供稳定性并防止细胞移动离开，从而对配体-受体复合物产生张力。支架的溶解能力允许对信号传导施加时间限制；当支架溶解到培养物中时，附着的配体被释放并失去刺激Notch信号传导的能力。在另一个实施方案中，Notch激动剂可以多聚体形式存在。多聚体配体可以同时结合多个Notch表达的细胞。由多个结合的Notch表达的细胞中的每一个所施加的体积和平衡重产生了引发蛋白水解切割和随后的信号传导所必需的构象变化所需的张力或“拖拉”。在一些实施方案中，Notch受体激动剂不在与T细胞或T细胞群体共培养的细胞上表达或被这种细胞以其他方式呈现。在一些实施方案中，不在表达Notch受体激动剂的抗原呈递细胞(APC)的存在下培养T细胞或T细胞群体。例如，在一些实施方案中，Notch受体激动剂不在培养基中的APC上表达。在一些实施方案中，不在表达δ样配体4(DLL4)的抗原呈递细胞(APC)的存在下培养T细胞或T细胞群体。

尽管上述各种Notch受体激动剂对不同的Notch受体(例如Notch1、Notch2、Notch3、Notch4等)具有不同的亲和力，但适当的Notch受体激动剂的选择之间的功能差异只是数量上的，取决于靶细胞中占大多数的特定的一种或多种Notch受体。较低的亲和力通常导致细胞成批暴露时较低的总信号传导。因此，甚至可以使用对于在所期望靶细胞中占大多数的一种或多种Notch受体具有相对低的亲和力的Notch受体。在一些实施方案中，如果期望较低水平的信号传导，则这是优选的。或者，可以通过例如增加所呈递的激动剂的密度，和或增加共刺激分子和/或细胞因子的水平来补偿相对低的亲和力。通过调节诸如Notch受体激动剂(一种或多种)的选择，Notch受体激动剂(一种或多种)的密度、选择和浓度辅因子和/或细胞因子的因素，可以控制Notch信号传导的强度。

在一些实施方案中，Notch受体激动剂以预定密度或浓度在培养基中与成批T细胞接触，以促进成批T细胞中Notch信号传导的受控程度。例如，在一些实施方案中，Notch受体激动剂以约0.01μg/ml至约10μg/ml，例如约0.025μg/ml、约0.05μg/ml，约0.1μg/ml、约0.25μg/ml、约0.5μg/ml、约0.75μg/ml、约1μg/ml、约2μg/ml、约3μg/ml、约4μg/ml、约5μg/ml、约6μg/ml、约7μg/ml、约8μg/ml、约9μg/ml、约10μg/ml的浓度固定化。在其他实施方案中，Notch受体激动剂以高达约100μg/ml，例如约10μg/ml、约15μg/ml、约20μg/ml、约25μg/ml、约30μg/ml、约35μg/ml、约40μg/ml、约45μg/ml、约50μg/ml、约55μg/ml、约60μg/ml、约65μg/ml、约70μg/ml、约75μg/ml、约80μg/ml、约85μg/ml、约90μg/ml、约95μg/ml和约100μg/ml、或其中的任何范围的浓度固定化。通常，Notch受体激动剂对靶T细胞表达的Notch受体的亲和力越高，获得相当的Notch信号传导所需的Notch受体激动剂的密度或浓度越低。在一个示例性的实施方案中，抗Notch1抗体N1可以约0.25μg/ml至约2.5μg/ml的浓度存在，例如0.25μg/ml、约1μg/ml、约2.5μg/ml。在另一个示例性的实施方案中，典型的Notch配体DLL1或其Notch-结合结构域可以约2.5μg/ml至约10μg/ml的浓度存在。

在一些实施方案中，两种或更多种Notch受体激动剂(例如如上所述的)的组合以足以施加机械力或“拖拉”以诱导构象变化并启动信号传导的方式被暴露于靶T细胞。

在一些实施方案中，成批T细胞以不超过诱导显著细胞间Notch信号传导的阈值的细胞浓度被暴露于Notch受体激动剂。通常，在培养条件下能够结合到固定化基质上的最大量的细胞被添加。

该方法通常在支持维持细胞活力和细胞增殖的培养条件下进行，如本领域普通技术人员容易确定和应用的。

如上所述，培养基可以容器中，例如烧瓶或板中，所述容器具有固定于其上的Notch受体激动剂。或者，在容器中含有的液体培养基可包含分布在其中的Notch受体激动剂。在一些实施方案中，将一种或多种Notch受体激动剂固定在颗粒或珠子表面上，其中颗粒或珠子分布在培养基中。

在一些实施方案中，如上所述，培养基包含促进T细胞的维持和/或刺激以导致维持或逆转为具有较高增殖能力的相对未分化状态的T细胞的其他组分或条件。所述组分和条件可以促进细胞的增殖、扩增和激活，而不会促进向更高分化状态的发展。这样的条件也可以被设计以使细胞适于进行遗传操作。

示例性的培养因子可以包括例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子，例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体以及被设计以促进T细胞的激活的任何其他试剂。

可以控制各种附加条件，例如氧气和二氧化碳水平、温度、培养时间、曝光量等，以促进或优化方法的进行。

在一些实施方案中，在T细胞中刺激TCR/CD3信号传导级联的因子可以被包括在培养物中。例如，可以包括对CD3、CD28和/或4-1BB具有特异性的结合(亲和)试剂，例如抗体或抗体片段，以帮助诱导T细胞刺激和增殖。本公开涵盖本领域已知的本公开涵盖的其他示例性T细胞刺激因子。这样的因子可以被包括在固体支持物例如珠子上，使得它们的存在可以被控制。例如，下文所述的测定包括使用展示抗CD3和抗CD28抗体的珠子(即

在部分或全部培养阶段的培养条件中可以包含各种信号传导因子的混合物，例如细胞因子或其生物活性片段，以促进T细胞的激活和增殖。在一些实施方案中，信号传导因子是与选自IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2的细胞因子受体特异性结合的配体。考虑了具有预定浓度的一种或更多种细胞因子的各种细胞因子混合物，并且可以包括一种或更多种示例性细胞因子，例如IL-1、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、IL-27、IFN-γ、TNF-α、TGF-β或其生物活性片段，以任何组合，在本领域普通技术人员容易确定的适当浓度下。在一些实施方案中，培养基包含一种或更多种促进Th1谱的细胞因子，例如IFN-γ和/或IL-12。在其他实施方案中，培养基包含促进Th17谱的细胞因子，例如任意组合的TGF-β、IL-6、IL-21和/或IL-23。例如，在一个实施方案中，IL-2可以至少约10单位/ml的浓度使用。

在一些实施方案中，培养条件还可包括加入饲养细胞，例如非分裂的外周血单核细胞(PBMC)。可以照射PBMC，以防止饲养细胞的细胞分裂。饲养细胞可以在培养物中提供大于2:1(例如2:1、3:1、5:1、10:1、20:1、50:1或更高)的比例的饲养细胞与初始T细胞的量被包括。

一个或更多个T细胞被暴露于Notch受体激动剂足以诱导细胞中Notch信号传导的时间。应当理解，暴露时间可能受Notch受体激动剂和/或多个T细胞的密度或浓度、T细胞亚型的身份或T细胞来源的影响。在一些实施方案中，暴露期可以在约12小时至约20天之间，例如在约1天至约15天之间、在约2天至约12天之间、在约2天至约10天之间、在约2天至约8天之间、在约3天至约7天之间、在约3天至约6天之间以及在约4天至约5天之间。在一些实施方案中，一个或更多个T细胞被暴露于Notch受体激动剂达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多天。

在其他实施方案中，例如在培养T细胞(例如，T

在某些实施方案中，本文公开的一些方法包括将T细胞或T细胞群体暴露于包含Notch受体激动剂的培养基中足以诱导细胞中Notch受体信号传导的时间，其中Notch受体激动剂是肽配体，并且其中T细胞不与表达DLL1的OP9-DL1细胞或骨髓细胞共培养。在一些实施方案中，与OP9-DL1细胞共培养的T细胞相比，T细胞或T细胞群体表现出减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约250％或至少约300％的耗竭。

在一些实施方案中，公开的方法进一步包括从Notch受体激动剂以及在某些情况下从初始培养基中分离一个或多个T细胞和/或其后代。可以评估细胞的表型，例如使用流式细胞术分析细胞表面表达，如下文更详细描述的。也可以适当地配制细胞以施用于受试者，如下文更详细描述的。细胞还可以进一步与其他细胞组合以施用于受试者。例如，暴露于Notch受体激动剂的细胞可以主要或占优势地是CD4+细胞。在与Notch受体激动剂一起孵育后，CD4+ T细胞可以与CD8+ T细胞组合，或者与CD8+ T细胞协同施用，这些CD8+ T细胞可以单独地或不单独地被暴露于Notch受体激动剂。

本公开还涵盖其中T细胞包含改变细胞表型和/或性能的基因修饰的方面和实施方案。例如，在一方面，提供了一种T细胞，其包含根据本公开的异源多核苷酸或表达载体及其制备方法。在一些实施方案中，其中T细胞在其细胞表面表达由异源多核苷酸编码的抗原结合蛋白。此类T细胞可用于专门定制的过继细胞疗法技术。在一些实施方案中，公开的方法包括用异源核酸转导T细胞以产生转基因或基因修饰的T细胞。基因修饰可以在本文所述的培养方法之前、期间或之后进行。T细胞可以是本文所述的任何T细胞。在一些实施方案中，在转导步骤之前，在T细胞最初暴露于Notch受体激动剂之后，将细胞培养一段时间，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。在一些实施方案中，在转导步骤之前将细胞培养约1、2或3天。

这些步骤产生重组T细胞。如本文所用，术语“重组”是指已经通过人为干预被基因工程化的细胞、微生物、核酸分子或载体，即通过引入异源核酸分子被修饰，或者是指已经被改变使得内源性核酸分子或基因的表达被控制、去调控、缺失、减弱或是组成型的细胞或微生物。人产生的基因改变可以包括，例如，引入编码一种或更多种蛋白质或酶的核酸分子(其可以包括表达控制元件，例如启动子)的修饰、或突变，例如核酸分子的添加、缺失、取代、或细胞遗传物质的其他功能破坏或增加。示例性修饰包括来自参考或母体分子的异源或同源多肽的编码区或其功能片段中的那些修饰。

如本文所用，“突变”是指分别与参考或野生型核酸分子或多肽分子相比，核酸分子或多肽分子的序列变化。突变可导致几种不同类型的序列变化，包括一个或多个核苷酸或一个或多个氨基酸的取代、插入或缺失。在某些实施方案中，突变是一个或三个密码子或氨基酸的取代，一个至约5个密码子或氨基酸的缺失或其组合。

如本文所用，术语“转导(transduce)”或“转导(transduction)”是指将异源核酸引入T细胞以导致T细胞中的基因修饰。用于引入基因工程化组分的各种方法，例如编码(新的或修饰的)细胞因子和免疫受体的基因构建体(例如CAR和TCR)，是众所周知的，并且可以与所公开的方法和组合物一起使用。

这样的示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些方法，包括通过病毒，例如逆转录病毒或慢病毒、转导、转座子和电穿孔。在一些实施方案中，转导导致T细胞表达由异源核酸编码的异源蛋白质的能力。在一些实施方案中，异源核酸(例如，DNA、RNA或cDNA)包含在载体例如病毒表达载体中，其促进异源核酸在细胞的细胞核中的表达。在一些实施方案中，载体促进异源核酸在细胞基因组中的整合。

为了进一步说明，术语“构建体”是指含有重组核酸分子的任何多核苷酸。如上所述，构建体可以存在于载体(例如细菌载体、病毒载体)中或可以整合到基因组中。“载体”是能够转运另一个核酸分子的核酸分子。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒、RNA载体或线性或环状DNA或RNA分子，其可以包括染色体、非染色体、半合成或合成核酸分子。示例性载体是能够自主复制的载体(附加型载体)或表达与其连接的核酸分子的载体(表达载体)。

病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒(例如正粘病毒(例如流感病毒)、弹状病毒(例如狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒)、正链RNA病毒(例如小核糖核酸病毒和甲病毒)，以及双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如1型和2型单纯疱疹病毒，爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如牛痘、鸡痘和金丝雀痘)。例如，其他病毒包括诺沃克(Norwalk)病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病-肉瘤，哺乳动物C型病毒、B型病毒、D型病毒，HTLV-BLV组，慢病毒，泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,InFundamental Virology,Third Edition,B.N.Fields et al.,Eds.,Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia,1996)。

如本文所用，“慢病毒载体”是指用于基因递送的基于HIV的慢病毒载体，其可以是整合的或非整合的，具有相对大的包装能力，并且可以转导多种不同的细胞类型。慢病毒载体通常是在三个(包装、包膜和转移)或更多质粒瞬时转染到生产细胞后产生的。像HIV一样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面上的受体的相互作用进入靶细胞。进入时，病毒RNA经历逆转录，该逆转录由病毒逆转录酶复合物介导。逆转录产物是双链线性病毒DNA，其是病毒整合到感染细胞DNA中的底物。

基因修饰可以与赋予功能的核酸序列可操作地连接，例如配置为促进在靶T细胞中的新的或修饰的转基因序列的表达的启动子。因此，术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上两个或更多个核酸分子的缔合，使得一个的功能受到另一个影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(即，编码序列在启动子的转录控制下)，启动子与编码序列可操作地连接。“未连接的”是指相关的遗传要素彼此之间不紧密缔合，并且其中一个的功能不影响另一个。

如本文所用，“表达载体”是指含有核酸分子的DNA构建体，该核酸分子可操作地连接至能够影响核酸分子在合适宿主中的表达的合适对照序列。此类对照序列包括实现转录的启动子，控制此类转录的任选操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、病毒或仅是潜在的基因组插入物。一旦转化至合适的宿主细胞中，载体就可以独立于宿主基因组复制和发挥功能，或者在某些情况下可以整合到基因组本身中。在本说明书中，“质粒”、“表达质粒”、“病毒”和“载体”经常互换使用。

如本文所用，术语“表达”是指基于核酸分子例如基因的编码序列生产多肽的过程。该过程可以包括转录、转录后控制、转录后修饰、翻译、翻译后控制、翻译后修饰或其任何组合。

在将核酸分子插入细胞中的语境中，术语“引入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括将核酸分子掺入到真核或原核细胞中，其中核酸分子可以被掺入细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，被转化成自主复制子，或被瞬时表达(例如，转染的mRNA)。

如本文所用，“异源”核酸分子、构建体或序列是指不是宿主细胞固有的但可以与来自宿主细胞的核酸分子或核酸分子的一部分同源的核酸分子或核酸分子的一部分。异源核酸分子、构建体或序列的来源可以来自不同的属或种。在某些实施方案中，通过例如缀合、转化、转染，电穿孔等将异源核酸分子(即，不是内源的或固有的)加入至宿主细胞或宿主基因组，其中加入的分子可以整合到宿主基因组或以染色体外遗传物质的形式存在(例如，作为质粒或其他形式的自我复制载体)，并且可能以多拷贝形式存在。另外，“异源”是指由导入宿主细胞的异源多核苷酸编码的非天然酶、蛋白质或其他活性，即使宿主细胞编码同源蛋白质或活性也是如此。

如本文所述，可以将多于一个的异源核酸分子作为单独的核酸分子、作为多个单独控制的基因、作为多顺反子核酸分子、作为编码融合蛋白的单个核酸分子或其任何组合引入宿主细胞中。例如，如本文所公开的，可以修饰宿主细胞以表达两个或更多个异源核酸分子，所述异源核酸分子编码对靶抗原肽特异性的期望的结合蛋白(例如，TCR分子和/或抗体)。当将两个或更多个异源核酸分子被引入宿主细胞时，应理解，两个或更多个异源核酸分子可作为单个核酸分子(例如，在单个载体上)被引入，在分开的载体上被引入，被整合到宿主染色体的单个位点或多个位点上，或其任何组合。所提及的异源核酸分子或蛋白质活性的数目是指编码核酸分子的数目或蛋白质活性的数目，而不是被引入宿主细胞中的单独的核酸分子的数目。

在其他实施方案中，可以通过基因编辑技术修饰宿主T细胞的基因组，以为修饰的或工程化的宿主细胞提供增强的活性或改变的抗原特异性分子的表达。

为了举例说明，在某些实施方案中，可以通过宿主T细胞的染色体编辑来进行染色体基因敲除或基因敲入。可以使用例如内切核酸酶进行染色体编辑。如本文所用，“内切核酸酶”是指能够催化多核苷酸链内的磷酸二酯键切割的酶。在某些实施方案中，内切核酸酶能够切割靶基因，从而使靶基因失活或“敲除”。内切核酸酶可以是天然存在的、重组的、基因修饰的或融合的内切核酸酶。由内切核酸酶引起的核酸链断裂通常通过同源重组或非同源末端连接(NHEJ)的独特机制修复。在同源重组期间，供体核酸分子可用于供体基因“敲入”，用于靶基因“敲除”，并且任选地通过供体基因敲入或靶基因敲除事件使靶基因失活。NHEJ是易于出错的修复过程，通常会导致切割位点的DNA序列发生变化，例如，至少一个核苷酸的取代、缺失或添加。NHEJ可用于“敲除”靶基因。内切核酸酶的实例包括锌指核酸酶、TALE-核酸酶、CRISPR-Cas核酸酶、大范围核酸酶和megaTAL。

如本文所用，“锌指核酸酶”(ZFN)是指包含与非特异性DNA切割结构域融合的锌指DNA结合结构域的融合蛋白，例如Fok1内切核酸酶。约30个氨基酸的每个锌指基序与约3个DNA碱基对结合，某些残基上的氨基酸可以改变以改变三重态序列特异性(参见，例如，Desjarlais等人，Proc.Natl.Acad.Sci.90:2256-2260,1993；Wolfe等人,J.Mol.Biol.285:1917-1934,1999)。多个锌指基序可以串联连接以产生对期望DNA序列的结合特异性，例如长度范围为约9至约18个碱基对的区域。通过背景，ZFN通过催化基因组中位点特异性DNA双链断裂(DSB)的形成来介导基因组编辑，并且通过同源指导的修复促进转基因的靶向整合，所述转基因包含与DSB位点的基因组同源的侧翼序列。或者，由ZFN产生的DSB可以通过非同源末端连接(NHEJ)的修复导致靶基因的敲除，这是一个容易出错的细胞修复途径，会导致核苷酸在切割位点处的插入或缺失。在某些实施方案中，基因敲除包括使用ZFN分子进行的插入、缺失、突变或其组合。

如本文所用，“转录激活因子样效应物(TALE)核酸酶”(TALEN)是指包含TALE DNA结合结构域和DNA切割结构域的融合蛋白，例如FokI内切核酸酶。“TALE DNA结合结构域”或“TALE”由一个或更多个TALE重复结构域/单元组成，每个通常具有高度保守的33-35个氨基酸序列以及不同的第12和第13个氨基酸。TALE重复结构域参与TALE与靶DNA序列的结合。不同的氨基酸残基被称为重复可变残基(RVD)，与特异性核苷酸识别相关。确定这些TALE的DNA识别的天然(典型)代码，使得TALE的12和13位上的HD(组氨酸-天冬氨酸)序列导致TALE与胞嘧啶(C)结合，NG(天冬酰胺-甘氨酸)结合至T核苷酸，NI(天冬酰胺-异亮氨酸)结合至A，NN(天冬酰胺-天冬酰胺)结合至G或A核苷酸，且NG(天冬酰胺-甘氨酸)结合至T核苷酸。非典型的(不典型的)RVD也是已知的(参见，例如，美国专利公开号US 2011/0301073，该非典型的RVD的全部内容通过引用并入本文)。TALEN可用于指导T细胞基因组中的位点特异性双链断裂(DSB)。非同源末端连接(NHEJ)从双链断裂的两侧连接DNA，其中几乎没有或根本没有用于退火的序列重叠，从而引入敲除基因表达的错误。或者，同源指导的修复可以在DSB的位点引入转基因，条件是转基因中存在同源侧翼序列。在某些实施方案中，基因敲除包括插入、缺失、突变或其组合，并且使用TALEN分子进行。

如本文所用，“规律间隔成簇短回文重复序列/Cas”(CRISPR/Cas)核酸酶系统是指采用CRISPR RNA(crRNA)-指导的Cas核酸酶通过碱基配对的互补性识别基因组内的靶位点(称为前间隔序列)，随后在互补靶序列的3'后面紧跟着短的、保守的前间隔序列相关基序(PAM)的情况下切割DNA的系统。基于Cas核酸酶的序列和结构，CRISPR/Cas系统被分为三种类型(即I型、II型和III型)。I型和III型的crRNA指导的监视复合物需要多个Cas亚基。研究最多的II型系统包含至少三个组分：RNA引导的Cas9核酸酶、crRNA和反式作用crRNA(tracrRNA)。tracrRNA包含双链体形成区。crRNA和tracrRNA形成双链体，其能够与Cas9核酸酶相互作用，并通过crRNA上间隔子与在PAM上游的靶DNA上的前间隔序列之间的Watson-Crick碱基配对将Cas9/crRNA:tracrRNA复合体引导至靶DNA上的特定位点。Cas9核酸酶在crRNA间隔区定义的区域内切割双链断裂。NHEJ修复导致插入和/或缺失，其破坏了靶基因座的表达。或者，可以通过同源性指导的修复将具有同源侧翼序列的转基因引入在DSB的位点。可以将crRNA和tracrRNA工程化成单个指导RNA(sgRNA或gRNA)(参见，例如，Jinek等人,Science337:816-21,2012)。此外，与靶位点互补的指导RNA的区域可以被改变或被编程以靶向期望的序列(Xie等人，PLOS One9:e100448,2014；美国专利申请公开号US 2014/0068797，美国专利申请公开号US 2014/0186843；美国专利号8,697,359和PCT公开号WO2015/071474；其各自通过引用并入)。在某些实施方案中，基因敲除包括插入、缺失、突变或其组合，并且使用CRISPR/Cas核酸酶系统进行。

在一些实施方案中，减少自体基因和蛋白质的表达或活性可能是有利的，否则它们可能对工程化T细胞的功能具有抑制或有害作用。因此，可以实施染色体基因敲除。术语“染色体基因敲除”是指宿主细胞中的遗传改变，其阻止宿主细胞产生功能活性的内源多肽产物。导致染色体基因敲除的改变可包括，例如，引入的无义突变(包括提前终止密码子的形成)、错义突变、基因缺失和链断裂，以及抑制宿主细胞中的内源性基因表达的抑制性核酸分子的异源表达。示例性的gRNA序列和使用该gRNA序列敲除编码免疫细胞蛋白的内源基因的方法包括Ren等人，Clin.Cancer Res.23(9):2255-2266(2017)中描述的那些，其gRNA、CAS9 DNA、载体和基因敲除技术的全部内容通过引用并入本文。

如本文所用，“大范围核酸酶”，也称为“归巢内切核酸酶”，是指特征在于大识别位点(约12至约40个碱基对的双链DNA序列)的内切脱氧核糖核酸酶。基于序列和结构基序，大范围核酸酶可分为五个家族：LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cys盒和PD-(D/E)XK。示例性的大范围核酸酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII，其识别序列是已知的(参见，例如，美国专利号5,420,032和6,833,252；Belfort等人，Nucleic Acids Res.25:3379-3388,1997；Dujon等人,Gene 82:115-118,1989；Perler等人,Nucleic Acids Res.22:1125-1127,1994；Jasin,Trends Genet.12:224-228,1996；Gimble等人,J.Mol.Biol.263:163-180,1996；Argast等人,J.Mol.Biol.280:345-353,1998)。

在某些实施方案中，天然存在的大范围核酸酶可用于促进靶标的位点特异性基因组修饰，所述靶标选自PD-1、LAG3、TIM3、CTLA4、TIGIT、HLA编码基因或TCR组分编码基因。在其他实施方案中，将对靶基因具有新型结合特异性的工程化大范围核酸酶用于位点特异性基因组修饰(参见例如Porteus等人，Nat.Biotechnol.23:967-73,2005；Sussman等人,J.Mol.Biol.342:31-41,2004；Epinat等人,Nucleic Acids Res.31:2952-62,2003；Chevalier等人,Molec.Cell 10:895-905,2002；Ashworth等人,Nature 441:656-659,2006；Paques等人,Curr.Gene Ther.7:49-66,2007；美国专利公开号US 2007/0117128；US2006/0206949；US 2006/0153826；US 2006/0078552；和US 2004/0002092)。在其他实施方案中，使用归巢内切核酸酶产生染色体基因敲除，所述归巢内切核酸酶已经用TALEN的模块化DNA结合结构域修饰以制备被称为megaTAL的融合蛋白。当与编码目的多肽(例如TCRα链、TCRβ链或二者、嵌合抗原受体、抗体或抗体组分、修饰的细胞因子等)的外源供体模板结合使用时，megaTAL不仅可用于敲除一个或更多个靶基因，而且可用于引入(敲入)异源或外源多核苷酸。

在某些实施方案中，染色体基因敲除包含被引入宿主细胞(例如，T细胞)的抑制性核酸分子，所述宿主细胞包含编码与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原特异性受体的异源多核苷酸，其中抑制性核酸分子编码靶特异性抑制剂，并且其中编码的靶特异性抑制剂抑制在宿主细胞中的的内源基因表达(即，PD-1、TIM3、LAG3、CTLA4、TIGIT、HLA组分或TCR组分或其任何组合)。

使用敲除程序或试剂后，可以通过宿主免疫细胞的DNA测序直接确认染色体基因敲除。染色体基因敲除也可以从敲除后不存在基因表达(例如，不存在由该基因编码的mRNA或多肽产物)中推断出来。

如上所述，在一些实施方案中，异源核酸包含至少一个编码例如信号传导因子或免疫受体的序列。异源核酸还可包含编码选择标志物，确保安全性的蛋白质(例如对负选择敏感)的序列。

在一些实施方案中，异源核酸包含至少一种编码信号传导因子，例如促炎细胞因子的序列。示例性的非限制性列表包括IL-2、IL-12、IL-7、IL-15和IL-21。

在一些实施方案中，异源核酸包含至少一种编码免疫受体的序列。免疫受体可以包含细胞外结构域，当在细胞表面表达时，可以与目的抗原结合。例如，本公开的方面涵盖嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，CAR的细胞外结构域包含对目的抗原具有特异性结合亲和力的抗体片段(例如，scFv)。目的抗原通常是在细胞表面或细胞外环境表达的标志物。在癌症应用中，与健康组织相比，理想地，标志物对于靶癌细胞是唯一的，或者至少主要在癌细胞上表达。在这方面，癌症或感染原的标志物是已知的，可以被CAR结构域靶向。细胞外结构域通过跨膜和任选的一个或多个间隔域连接至至少一个细胞内信号传导结构域，其在与合适的配体结合后激活表达CAR的T细胞。跨膜结构域可衍生自天然存在的跨膜蛋白(例如T细胞受体的α、β或ζ链、CD2S、CD3ε、CD45、CD4、CDS、CDS、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CDSO、CDS6、CD 134、CD137、CD 154等)，或可以使用主要的疏水残基合成。细胞内信号传导结构域可包括CD3ξ链和/或其他分子，例如Fc受体λ。由抗原结合引发的激活信号最终导致细胞的增殖和效应子(即，细胞毒性)功能的启动。

T细胞中CAR的设计和引入可以包括例如，W0200014257；美国专利号6,451,995；US2002131960；美国专利号7,446,190；美国专利号8,252,592；EP2537416；US2013287748；和W02013126726中描述的方法；和/或Sadelain等人，Cancer Discov.3(4):388-398(2013)；Davila等人，PLoS ONE 8(4):e61338(2013)；Turtle等人，Curr.Opin.Immunol.,24(5):633-39(2012)；和Wu等人，Cancer,18(2):160-75(2012)描述的那些；其各自的全部内容通过引用并入本文。

或者，免疫受体是T细胞受体(TCR)，当感兴趣的肽抗原与主要组织相容性复合物(MHC)蛋白质正确复合时，T细胞受体(TCR)对于该肽具有特异性结合特性和信号传导活性。与更受表面抗原限制的CAR不同，TCR能够检测并响应MHC上存在的任何肽抗原。此外，TCR可以被限制到1类MHC或2类MHC，这可以促进更精确和相关的响应，以及降低水平的假性或无关活动。相应地，与刺激非自身抗原或异常癌抗原的细胞反应有关的可用于该方法的潜在靶抗原具有更广泛的应用。

TCR可以是与可能接受修饰的T细胞的施用的特定受试者匹配的MHC(或HLA)。可以从天然存在的T细胞，或者通过合成设计克隆TCR。可以利用诸如噬菌体展示的技术来开发识别目的肽抗原的TCR。转基因TCR的实施可以例如用病毒(例如逆转录病毒或慢病毒)载体完成，如在例如Baum等人，Molecular Therapy:The Journal of the American Societyof Gene Therapy.13:1050-1063(2006)；Frecha等人,Molecular Therapy:The Journalof the American Society of Gene Therapy.18:1748-1757(2010)；和在Hackett等人,Molecular Therapy:The Journal of the American Society of Gene Therapy.18:674-683(2010)；中所述的；其各自的全部内容通过引用并入本文。

在另一方面，本公开还提供了通过本文描述的方法产生的细胞或细胞组合物。如本文所述，组合物富含CD4+和/或CD8+细胞或其限定的分化亚群。可以将细胞掺入适于在过继细胞疗法中施用的治疗组合物中。该组合物包含细胞或细胞群体以及药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物另外包含其他药物活性剂或药物，例如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春花碱、长春新碱等。在一些实施方案中，试剂以盐的形式存在。

可以基于细胞和/或可由细胞表达的特定CAR或TCR以及预期的施用途径来确定合适的载体。该组合物可以进一步包含一种或更多种防腐剂，例如选自对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵等。治疗组合物还可包含缓冲剂。示例性的非限制性缓冲剂包括柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。

治疗组合物包含对于预期的施用方式适当和有效的足量的细胞，并且可以由本领域普通技术人员确定。

在另一方面，本公开提供了治疗方法，其包括施用通过上述方法产生的细胞或包含通过上述方法产生的细胞的治疗组合物。将细胞或治疗组合物施用于有此需要的受试者，例如患有可通过过继细胞疗法治疗的疾病或病症的受试者。示例性的疾病或病症包括癌症、感染原(例如，寄生虫、病毒或细菌)的感染，或过敏或免疫缺陷性疾病。

术语“受试者”和“治疗”在下面的“其他定义”部分中更详细地定义。

用于过继细胞疗法的细胞的施用的一般和示例性方法和技术可以在本公开的本方面中应用，并且在例如美国公开号2003/0170238；U.S.4,690,915；Rosenberg,Nat RevClin Oneal.8(10):577-85(2011)中更详细地公开。参见例如，Themeli等人，NatBiotechnol.31(10):928-933(2013)；Tsukahara等人，Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9(2013)；Davila等人，PLoS ONE 8(4):e61338(2013)；其各自的全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，过继细胞疗法是自体的，这意味着接受通过本发明公开的方法产生的细胞的施用的受试者就是作为进行该培养方法的初始细胞的来源的相同的个体。在其他实施方案中，过继细胞疗法是同种异体的，这意味着接受通过本发明公开的方法产生的细胞的施用的受试者是与在进行该培养方法的初始细胞的来源不同的个体。

本方法可以应用于患有癌症或赘生性疾病的个体。近年来，尽管用于增强受试者对癌症和感染原的反应的过继细胞疗法(包括CAR T细胞的施用)已取得很大进步，但仍存在重大技术障碍。在许多当前方法中，工程化细胞在初次暴露于疾病标志物或抗原后表现出非常有效的激活，但随后表现出耗竭。耗竭的特征在于高度减少的增殖和效应子功能。因此，该疗法通常是短暂的，允许转化的细胞群体(例如肿瘤)反弹。由公开的诱导Notch信号传导的方法产生的细胞导致长时间处于较低分化亚型。这被证明会导致在人体中延长的寿命和持久性，并具有更强的增殖能力，并最终对肿瘤负荷产生更大的影响。

此外，过继细胞疗法(例如典型的CAR T细胞的施用)在有效治疗实体瘤方面面临特殊的挑战。肿瘤通常呈现出对免疫细胞的不利环境，包括产生免疫抑制信号，其尤其抑制免疫细胞的效应子和增殖能力。此外，抗原在单个区域的浓度可能迅速导致T细胞耗竭，其加剧效应子和增殖功能的丧失。尽管目前有许多研究用于进一步操纵施用的细胞，例如抑制检查点抑制剂，但实体瘤仍然很难用传统的过继细胞疗法进行治疗。

如下所述，通过公开的方法产生的细胞，即具有如上所述的诱导的Notch信号传导的细胞，被证明可以长时间保持较低的分化状态，但是不抑制增殖能力。这导致延长的体内持久性，同时保持高增殖能力。此外，在反复或长时间暴露于抗原的情况下，Notch诱导的T细胞对耗竭的敏感性显著降低。最后，证明了与没有Notch诱导的CAR T细胞相比，当用Notch诱导产生的CAR T细胞治疗时，肿瘤负荷显著降低并且患病个体的生存期显著延长。

因此，本发明的施用和治疗方法包括所有类型的癌症的治疗，包括液体肿瘤(例如，血液学癌症，例如淋巴瘤(例如B细胞恶性肿瘤)、白血病和骨髓瘤)和实体瘤。实体瘤可以来自任何起源的组织。这些方法涵盖的实体瘤的说明性非限制性实例包括胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、头颈癌、乳腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌)、肝癌、胰腺癌、间皮瘤、黑色素瘤、前列腺癌、睾丸癌、骨癌、结直肠癌、肾细胞癌和卵巢癌。在例如D’Aloia,M.M.等人，Cell Death and Disease,9:282(2018)；Yeku,O.,等人，Am SocClin Oncol Educ Book,37:193-204(2017)；和Garber K,Nature Biotechnology,36(3):215-219(2018)中更详细地描述了其他癌症靶标，包括本申请涵盖的实体瘤靶标，包括适合于靶向的代表性抗原；其各自的全部内容通过引用并入本文。

如本领域普通技术人员将认识到的，可以通过将免疫受体工程化为合适的癌症抗原来适当地设计和优化细胞，以解决所选择的特定癌症。该方法涵盖的用于过继T细胞疗法的细胞(例如CAR T细胞和TCR表达细胞)可以被工程化以结合区分这些癌症中任何一种的细胞表面标志物。理想地，标志物对于靶向癌症是独特的，但不一定如此。可以将本发明方法涵盖的TCR设计成针对癌症特征性的特定肽的更大阵列，包括CAR T方法可能无法识别的细胞内抗原。

细胞的施用通常以治疗性组合物的形式发生，所述治疗性组合物还包含载体、赋形剂、任选的缓冲剂等，其被适当地配制用于施用的剂量和模式。过继细胞疗法中的细胞可以全身施用，例如通过静脉内(I.V.)注射或局部施用到感染或肿瘤部位。

如上所述，待施用的细胞可以任何比例包含CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、或CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。在一些实施方案中，已经将CD4+ T细胞暴露于Notch受体激动剂，然后随后与可能已经暴露或可能未单独暴露于Notch受体激动剂的CD8+ T细胞混合或与其协同施用。

如本文所用，术语“核酸”是指包含多个核苷酸亚基(即，多核苷酸)的任何聚合物分子。本公开涵盖的核酸可以包括脱氧核糖核苷酸聚合物(DNA)、核糖核苷酸聚合物(RNA)、cDNA或本领域已知的合成核酸。

在一些实施方案中，Notch受体激动剂是对Notch具有特异性结合亲和力的亲和试剂，并且在结合后诱导与细胞的Notch信号传导。在一些实施方案中，所示的亲和试剂是抗体。如本文所用，术语“抗体”涵盖抗体和其抗原结合抗体片段，其衍生自任何产生抗体的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔和灵长类动物(包括人))，其特异性结合目的抗原(例如，Notch)。示例性抗体包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)；人源化抗体；鼠抗体；嵌合的、小鼠-人、小鼠-灵长类、灵长类-人单克隆抗体；和抗独特型抗体。抗原-结合分子可以是任何完整的抗体分子或其片段(例如，具有功能性抗原结合结构域)。

抗体片段是衍生自或与全长抗体有关的部分，优选包括互补决定区(CDR)、抗原结合区或其可变区。可用于本公开的抗体片段和衍生物的说明性实例包括Fab、Fab’、F(ab)

上述亲和试剂不必是天然存在的或天然衍生的，但是可以根据需要进一步被修饰以例如减小结构域的大小或改变对Notch受体的亲和力。例如，互补决定区(CDR)可衍生自一种来源生物，并与另一种(例如人)的其他组分结合，以产生避免刺激受试者的免疫应答的嵌合分子。

抗体或抗体样分子的产生可以使用本领域通常已知的任何技术来完成。可以使用本领域已知的多种技术制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术，或其组合。例如，可以使用杂交瘤技术来产生单克隆抗体，所述杂交瘤技术包括本领域已知的并且例如在Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2nd ed.1988)；Hammerling等人，在Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas 563–681(Elsevier,N.Y.,1981)中教导的那些，其全部内容通过引用并入本文。术语“单克隆抗体”是指衍生自单个克隆的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是生产它的方法。使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是常规的并且是本领域众所周知的。一旦鉴定出包含在双特异性分子内的单克隆抗体，就可以将相关结合结构域的编码基因克隆到表达载体中，该表达载体还包含编码双特异性分子的其余一种或多种结构的核酸。

可以通过本领域技术人员已知的任何技术来产生识别特定表位的抗体片段。例如，本发明的Fab和F(ab’)

如本文所用，术语“适体”是指可以结合特定目的抗原的寡核酸或肽分子。核酸适体通常是表现出特异性结合特性的寡核苷酸的短链。它们通常通过几轮体外选择或通过指数富集方案进行系统进化以选择最佳结合特性(包括亲和力和选择性)产生。一种类型的有用核酸适体是硫代适体，其中磷酸二酯键的一些或全部非桥连氧原子已被硫原子取代，这增加了与蛋白质的结合能并减慢了由核酸酶引起的降解。在一些实施方案中，核酸适体包含具有改变的侧链的修饰的碱基，所述改变的侧链可以促进适体/Notch结合。

肽适体是蛋白质分子，其通常包含在两个末端都附着于protamersein支架的肽环。环通常具有10至20个氨基酸长，并且支架通常是可溶且紧密的任何蛋白质。蛋白质支架的一个实例是硫氧还蛋白-A，其中环结构可以插入还原活性位点内。可以从各种类型的文库中产生/选择肽适体，例如噬菌体展示、mRNA展示、核糖体展示、细菌展示和酵母展示文库。

除非本文具体定义，否则本文所用的所有术语具有与本发明领域的技术人员理解的相同的含义。对于本领域的定义和术语，从业者特别可关注Sambrook J.等人，(eds.),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Press,Plainsview,New York(2001)；Ausubel,F.M.,et al.(eds.),Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,New York(2010)；and Coligan,J.E.,et al.(eds.),Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York(2010)。

除非明确指出仅指替代方案或替代方案是互斥的，否则权利要求中的术语“或”的使用是指“和/或”，尽管本公开支持仅指替代方案和“和/或”的定义。

遵循长期的专利法，除非特别指出，否则词语“a”和“an”在权利要求书或说明书中与词语“包括”结合使用时表示一个或更多个。

除非上下文清楚地另外要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括(comprise)”、“包括(comprising)”等应被理解为包括性含义，而不是排他性或穷举性含义；这是指在“包括但不限于”的意义上。使用单数或复数的词语也分别包括复数和单数。另外，当在本申请中使用时，词语“本文”、“上文”和“下文”以及类似含义的词语应整体上指本申请，而不是本申请的任何特定部分。单词“约”表示在所述参考数字之上或之下的微小变化范围内的数字。例如，“约”可以指在所指示的参考数字之上或之下的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或1％范围内的数字。

术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换使用，是指被评估治疗和/或被治疗的哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物是人。术语“受试者”、“个体”和“患者”涵盖但不限于患有癌症的个体。尽管受试者可以是人，但该术语还涵盖其他哺乳动物，特别是可用作人疾病实验室模型的那些哺乳动物，例如小鼠、大鼠、狗、非人类灵长类动物等。

术语“治疗”及其在语法上的变形形式可以指成功治疗或改善或预防疾病或病症(例如癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病)的任何标志，包括任何客观或主观参数，例如减轻；缓解；减少症状或使患者更能忍受该疾病病况；退化或下降的速度减慢；或使退化的终点衰弱更少。

症状的治疗或缓解可以基于客观或主观参数；包括医师检查的结果。因此，术语“治疗”包括施用本公开的化合物或药剂以预防或延迟、减轻或阻止或抑制与疾病或病症(例如，癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病)相关的症状或病症的发展。术语“治疗作用”是指在受试者中减轻、消除或预防疾病或病症、疾病或病症的症状、或疾病或病症的副作用。

如本文所用，特征为特定标志物为“阳性”(或“+”)的细胞或细胞群体是指具有可检测到的标志物的存在的细胞或细胞群体。通常，标志物在细胞表面上存在或表达。可以使用任何常规技术来检测标志物。为了检测表面表达，例如，可以使用基于免疫染色的技术来检测标志物。例如，可以将对标志物特异的抗体暴露于细胞或细胞群体，并且可以通过流式细胞术对抗体的结合进行成像或检测。相反，术语“阴性”(或“-”)的使用是指在细胞中或在其表面上没有实质性存在。

公开了可用于所公开的方法和组合物、可与之结合使用、可用于其制备或者是起产物的材料、组合物和组分。应当理解，当公开了这些材料的组合、子集、相互作用、基团等时，即使可能未明确公开对这些化合物的各个和每一个单独组合和排列的具体提及，但是具体地考虑了各种单独的和集体组合中的每一个。该概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于所描述的方法中的步骤。因此，任何前述实施方案的特定要素可以被组合或替代其他实施方案中的要素。例如，如果可以执行多种附加步骤，则应理解，这些附加步骤中的每一个都可以用公开的方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来执行，并且每个这样的组合或组合的子集被特别考虑并且应该被认为是公开的。另外，应理解，本文描述的实施方案可以使用任何合适的材料例如本文其他地方描述的或本领域已知的材料实施。

本文所引用的出版物及其所引用的主题的全部内容特别通过引用并入本文。

实施例

下述实施例的提出是为了向本领域普通技术人员提供有关如何制作和使用本发明的完整公开和描述，不旨在限制发明人视为是其发明的范围，也不旨在表明以下实验是所进行的全部的或仅有的实验。

实施例1

进行改编自Delaney等人，Blood,106(8):2693–2699(2005)(其全部内容通过引入并入本文)的初始测定来确定细胞的离体Notch信号传导的作用。简言之，将幼稚T细胞在涂有Retronectin和不同浓度的固定化的DLL1-Ext IgG(Notch激动剂)或IgG1(作为对照)的板上培养4小时，或在无任何固定化的激动剂或其他部分的简单组织培养物(TC)中培养。分离RNA，然后转录成cDNA。通过SYBR绿色q-PCR测量Hes1表达。此培养方法导致Hes1上调，证实Notch信号传导。测定设计认为，Notch受体和配体相互作用中施加的细胞间相互作用以及物理“拉动”或张力对信号传导很重要。因此，配体用Recectectin包被在板上，这将配体有效地固定在板表面上。如图1所示，在暴露于固定的DLL1后，T细胞中发生剂量-依赖性Hes1上调，显示Notch信号传导。在IgG或TC对照中未观察到相同的效果。注意到观察到低细胞密度对于测定准确性是重要的，因为它限制了可能影响反应的细胞间信号传导，这与包被的配体的存在或密度无关。

为了确定Notch信号传导对T细胞表型和分化状态的影响，包括Notch受体和配体的表达，对上述测定方法进行了扩展。具体地，在D-1，将组织培养板用Rectronectin和所选配体(即，固定化的DLL1或IgG1对照)包被过夜。在D0，将2×10

评估了根据该测定设计培养的幼稚T细胞的Notch受体、Notch配体和其他细胞表面标志物的相对表达。图2A和2B分别说明了在不同条件下在培养前后的不同时间点，人CD4+和CD8+ T细胞中Notch1和Notch2受体的相对表达。下方图例指示培养物(TC＝仅组织培养物；DLL1＝固定的DLL1Notch激动剂(实验条件)；IgG＝固定的IgG(对照配体))。如图所示，Notch 1和2受体在不同的离体培养条件之间没有差异表达。尽管在CD8+细胞中在第11天有所增加，但在CD4+和CD8+ T细胞二者的培养过程中，Notch1的表达通常会下降。Notch 2在CD4+ T细胞中保持不变，但在第11天在CD8+ T细胞中增加。图3A-3D分别图解说明了在不同条件下在离体培养的CD4+和CD8+ T细胞中Notch配体DLL1、DLL4、JAG1和JAG2的相对表达。下方图例指示培养物，(TC＝组织培养物对照，DLL1＝用于实验条件的Notch激动剂，且IgG是对照配体)。如图所示，JAG1和JAG2激动剂在各个条件之间具有一些可变的表达。在所有培养条件下，JAG1通常在CD4+和CD8+细胞中均表现出最初的表达增加，然后在第5天后减少。JAG2在培养后表现出最初的表达降低，随后直至第11天普遍升高。DLL1和DLL4配体只能在暴露于实验培养条件后的大多数时间点以低水平检测到。

为了评估Notch对遗传修饰的免疫细胞(例如，CAR T细胞)的发育和功效的影响，在存在如上所述的Notch1激动剂、或对照配体、或TC对照的条件下培养的人幼稚T细胞通过在第1天用CD19特异性CAR转导而被进一步工程化，以建立离体人CD19-CAR T细胞。细胞分裂，并且每2-3天更换培养基。在第5天去除工程化CART细胞以进行计数并评估表型。最终将所有细胞转移至仅组织培养物的板，并在第11天评估其表型和功能性。用抗CD62L、抗CD45RO和抗CDRA抗体和图4所示的门控策略进行流式细胞术对表型进行评估，以区分T

图5A-5E说明了基于流式测定的结果，以确定暴露于如上所述的不同Notch激动剂相对于对照配体和TC对照的T细胞的分化表型。在分析之前，用抗CD3/CD28

图5A和5B图解说明了用不同剂量的DLL1激动剂(和对照条件)培养后T细胞亚型的比例。如图所示，与对照相比，在DLL1板上培养T

还对总细胞数进行定量以确定Notch信号传导是否影响CD4+ T细胞和CD8+ T细胞增殖。图6A和6B图解说明了在用不同浓度的固定的DLL1、IgG1对照或TC对照培养的第7天和第11天测量的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的总数。培养物还分别包含抗CD3/CD28

实施例2

使用免疫缺陷的Nod/Scid/γ链-/-(NSG)小鼠中的Raji淋巴瘤模型，通常在Sommermeyer等人，Leukemia volume 30,pages 492–500(2016)中进行描述的，其全部内容通过引用并入本文，在受试小鼠给药前，如上所述，测定在存在或不存在Notch受体激动剂的情况下培养的人CAR T细胞的持久性和抗肿瘤作用。

简言之，类似于上述一般性规程产生人CAR T细胞。在第-1天，通过包被2.5μg的N1抗体(抗Notch受体激动剂；LEAF Biolegend抗体)或IgG1对照配体来制备培养板。在第0天，将幼稚T细胞以3:1比例用抗

为确保所有组接受相等有效剂量的CAR T细胞，在输注前检查转导效率。在用EGFR-生物素，然后用链霉亲和素-PE染色后进行输注前T细胞的流式细胞术分析，以鉴定表达CAR的T细胞的频率。通过分析输注前流式测定数据检查淋巴细胞(未显示)上的CD4、CD8和EGFR表达来优化剂量，并确定为3×10

如所指出的，在第5天和第11天使用流式细胞术评估培养的表达人CAR的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的表型，以表征一组表面标志物在细胞上的表达。在第5天，暴露于N1的CD4+ T细胞表达较高水平的CCR7、CD28、CD27和CD62L，和较低水平的CD95、PD-1、Lag-3、CD25和CD69，表明较低分化/激活的表型。类似地，暴露于N1的CD8+ T细胞表达较高水平的CCR7、CD28、CD27和CD62L，和较低水平的CD95、PD-1、Lag-3、CD25、CD69和Tim-3，这也表明较低分化/激活的表型。

在输注前培养的第11天，测定在2.5μg N1抗体(“暴露于N1”)上培养的CD8+ T细胞、IgG或TC对照细胞、未转导的细胞(空白对照)的CD45RO、CD45RA和CD62L的表达，并与PBMC样品的染色比较。暴露于N1的T细胞显示出更高百分比的CD62L+细胞，更高的CD45RA表达和更低的CD45RO表达，表明较低分化的表型。此外，测定在2.5μg N1抗体、IgG或TC对照细胞和未转导的细胞(空白对照)上培养的CD8+和CD4+ T细胞的CD95、CCR7、CD28、CD27和CD62L的表达，并与PBMC样品的染色比较。在第11天，大多数标志物在所有条件下都是相似的，除了在CD8+和CD4+的IgG条件下CCR7较低之外。在输注前第11天，测定在2.5μg的N1抗体、IgG或TC对照细胞和未转导的细胞(空白对照)上培养的CD8+和CD4+ T细胞的其他细胞表面标志物PD-1、LAG-3、CD25、CD69和Tim-3的表达，并与PBMC样品的染色比较。在所有条件下，大多数标志物都是相似的，除了在暴露于N1的T细胞中CD25较低之外。对于CD8+ T细胞，这种差异很小，但对于CD4+ T细胞，则更为明显。

为了评估使用2.5μg的N1抗Notch受体激动剂抗体培养条件的Notch信号传导是否影响T细胞增殖，在输注前时间对来自培养物的总细胞数进行定量。图7图解说明了与仅作为阴性对照或组织培养物(TC)的IgG1相比，用N1抗体孵育的细胞在第5天和第11天的总T细胞数(CD4+和CD8+)。这表明较低分化的表型不是该系统中限制增殖的结果。还进行了羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)增殖测定，以评估在输注到具有相关CAR靶标的小鼠中后暴露于N1的CAR T细胞的增殖。CFSE测定法测量CD19+肿瘤细胞(K562/CD19或Raji)或仅在培养基中培养的CAR T细胞的繁殖。通过CFSE的稀释来测量细胞增殖。该测定法表明，对于CD4+和CD8+ T细胞二者(未显示)，暴露于N1的T细胞针对CD19阳性靶标(K562-CD19和Raji)增殖。

为了评估暴露于N1的CAR T细胞在肿瘤靶上的功能性能，在施用暴露于N1的CAR T细胞后，通过生物发光成像对小鼠(先前植入了表达萤火虫荧光素酶的Raji细胞)监测肿瘤负荷，或者与TC或IgG1对照培养物一起。将小鼠的照片显影，显示热图覆盖图中指示的肿瘤负荷。在第29天，由于肿瘤负荷，在对照T细胞组中的两只小鼠(无CAR表达)已被安乐死。到第84天，接受暴露于N1的CAR T细胞处理的五分之四的小鼠无肿瘤，而IgG组的其余两只小鼠均患有肿瘤，且TC组的所有小鼠均被安乐死。图8图解说明了施用对照T细胞、组织培养物(TC)CAR T细胞、Notch-1刺激的CAR T细胞和IgG1 CAR T细胞的个体的肿瘤负荷，通过生物发光成像(BLI)指示。所有时间点都是在给小鼠注射Raji肿瘤细胞后。每条线代表小鼠，且符号表示各个数据点。如图所示，接受暴露于N1的CAR T细胞的小鼠的肿瘤负荷大大降低，并且在输注后的100天内通常会继续下降。这些数据说明了暴露于N1的CAR T细胞在体内诱导针对肿瘤的有效反应的显著功效。而且，该功效保持很长一段时间，表明在诱导Notch信号传导的条件下培养的CAR T细胞的长期持久性。

在输注后和Raji肿瘤注射后的几个时间点评估了植入Raji的小鼠的血液中显示的T细胞。如上所述，将植入Raji的小鼠用对照T细胞、TC CAR T细胞、暴露于N1的CAR T细胞(在CART细胞生成过程中暴露于Notch1激动剂抗体)和暴露于IgG1的CAR T细胞进行处理。用氯化铵钾溶液裂解血液，然后用CD45、CD4、CD8和EGFR的抗体染色。在Canto II流式细胞仪上收集数据。图9A-9C图解说明了在多个时间点的血液中的T细胞的水平，图9A说明了CD8+和CD4+ T细胞的水平，图9B说明了CD8+ T细胞的水平，且图9C说明了CD4+ T细胞的水平。如图所示，从第35天起，接受暴露于N1的T细胞处理的Raji小鼠的EGFR+CD4+和CD8+ T细胞的频率比对照组高得多。要注意的是，在第35天的时间点肿瘤负荷已经较低，这进一步表明暴露于N1的T细胞的延长的存活和持久性导致在较长时间段内增强的抗肿瘤活性。

在输注后的几个时间点对从植入Raji的小鼠收集的T细胞进行细胞计数分析。在第56天和第91天，对CD45+细胞进行门控分析并对CD4+和CD8+相对于EGFR进行染色(未显示)。这些结果表明，接受暴露于N1的CAR T细胞处理的小鼠的血液中EGFR+和EGFR-细胞的频率更高，表明Notch1信号传导导致T细胞具有更高的增殖能力和持久性，而与细胞在体内暴露于抗原无关。

为了确定以上观察到的效果是否归因于输注到小鼠中的CAR T细胞还是来自未转导的T细胞(其是EGFR-)并且其已共输注的GvHD，在输注至小鼠之前，通过额外的EGFR分选重复进行测定。像上述分析一样，将幼稚人T细胞与Notch1激动剂抗体、对照(IgG1)或在不含IgG1(TC)的对照条件下孵育，用CD 19CAR转导，最后输注到已经植入Raji淋巴瘤细胞的小鼠中。然而，在过继转移T细胞之前，先对EGFR+细胞进行分选，以解决先前观察到的Notch1效应是由于CAR T细胞还是由于EGFR-细胞的任何同种异体反应性。具体地，将细胞用EGFR-生物素染色，然后用链霉亲和素-PE染色，以获得EGFR+细胞。不同组(未显示)的CAR转导效率相似。还通过流式细胞术评估了转导的T培养细胞上的表面标志物的表达，以确定转导的T培养细胞的表型。在第5天(输注前)，暴露于N1的CD4+ T细胞和暴露于N1的CD8+ T细胞二者均显示出更高的CD62L+细胞百分比、更高的CD45RA表达和更低的CD45RO表达。这些数据表明较低分化的表型。

在类似的分析中，在第5天(输注前)评估CD4+和CD8+CAR T细胞的其他表面标志物。具体地，确定CD95、CCR7、CD28、CD27、CD62L以及PD-1、Lag-3、CD25、CD69和Tim-3的表达。对于CD4+CAR T细胞和CD8+CAR T细胞二者，表型在培养条件之间存在差异，与暴露于IgG1的细胞或TC对照细胞相比，暴露于N1的T细胞表达更高水平的CCR7、CD28、CD27和CD62L，和更低水平的Lag-3和CD69，最终提示较低的分化/激活的表型。

为了解决后面的时间点，在转导的T细胞上在第11天(输注前)通过流式细胞术再次评估表面标志物的表达，以确定转导的T培养细胞的表型。与用IgG1对照或在TC中孵育的T细胞相比，暴露于N1的CD4+ T细胞和暴露于N1的CD8+ T细胞继续表现出更高的CD62L+细胞百分比，更高的CD45RA表达和更低的CD45RO表达。这表明在通过N1抗Notch受体激动剂抗体进行Notch信号传导后，在离体培养过程中继续并长期维持较低分化的表型。

为了评估这些暴露于N1的CAR T细胞(针对EGFR+分选的)在肿瘤靶上的功能性能，如上所述，通过生物发光成像(BLI)在植入Raji的小鼠中监测肿瘤负荷。Raji细胞表达的萤火虫荧光素酶用于成像。为了比较，给小鼠施用先前暴露于N1抗Notch受体激动剂、IgG1对照或TC(无IgG1对照)的CAR T细胞。用热图覆盖图中指示的肿瘤负荷显影小鼠图像。到第21天，与对照相比，观察到CD19 CAR N1组的抗肿瘤活性的明显增加。图10A图解说明了在用Raji细胞植入小鼠后的时间，如通过生物发光辐射所指示的，肿瘤大小，其中每条线代表小鼠，并且符号表示各个数据点。如图所示，与对照CAR T细胞相比，接受暴露于N1的CAR T细胞的小鼠的肿瘤大小大大减小。图10B说明了植入Raji的小鼠的存活曲线。如图所示，输注了暴露于N1的CAR T细胞的个体具有显著延长的存活时间，到研究结束时，有多于一半的受试动物仍存活。相反，所有接受等剂量对照T细胞(无CAR表达或N1暴露)或对照暴露于N1的T细胞(无CAR表达)的植入Raji的小鼠在移植后第20天死亡。接受TC对照CAR T细胞(无N1暴露)或暴露于IgG1的CAR T细胞的植入Raji的小鼠具有延长的存活时间，但每组中的所有小鼠最终在移植后第50至60天死亡。这说明了暴露于N1的CAR T细胞在体内诱导对肿瘤的有效反应的长时间的显著功效。此外，该数据证实如上所述的过继细胞疗法的性能是由于Notch刺激(例如暴露于N1)的CART细胞本身，而不是任何EGFR细胞的同种异体反应性。

实施例3

以上证明了在存在Notch激动剂的情况下产生的CAR T细胞导致较低分化的表型，而不抑制增殖和功能。另外，以上证明了，与未暴露于Notch激动剂的对照CAR T细胞相比，施用在Notch激动剂的存在下产生的这些CAR T细胞具有增强的功效和在体内的持久性。在植入Raji淋巴瘤的NSG小鼠中证实，与未暴露于Notch激动剂的对照T细胞和对照CAR T细胞的过继转移相比，具有诱导的Notch信号传导的CAR T细胞的过继转移导致显著减少的肿瘤负荷，以及在延长的时间内提高的存活率。

为了具体评估持久性特征和耗竭敏感性，提供了长时间暴露于抗原条件的暴露于Notch激动剂的CAR T细胞。

如上文更详细所述，将幼稚T细胞与Notch激动剂或对照条件(IgG1抗原或无抗原TC对照)一起培养。培养基还含有3:1比例的抗CD3/CD28

图11A和11B图解说明了重复的抗原暴露测定的结果。如图11A所示，在第二次和第三次施用靶K562-CD19细胞后，与N1抗Notch受体抗体(Notch激动剂)一起培养的CD8+CAR T细胞保留了比对照细胞培养物显著更高的归一化细胞数。关于Raji细胞的施用，如图11B所示，与IgG1对照培养物相比，与N1抗体一起培养的CD8+CAR T细胞表现出比对照细胞培养物更高的归一化细胞数。此外，在第二次和第三次靶Raji细胞施用后，与两种对照培养物相比，与N1抗体一起培养的CD8+CAR T细胞表现出显著更高的数目。图11C图解说明了与N1抗Notch受体抗体一起培养的CD8

实施例4

该实施例描述了证实诱导的Notch信号传导对CD4+ T细胞和CD8+ T细胞具有独立作用的测定，并且具有诱导的Notch信号传导的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的混合群体在抗肿瘤反应中提供协同作用。

对CD8+CAR T细胞进行类似的测定。如上所述，将CD8+CAR T细胞在包被有2.5μg抗Notch抗体(N1)或IgG1作为对照的板上培养。在培养11天后，如上所述，将暴露于N1的CD8+CAR T细胞以不同剂量输注到NSG-Raji小鼠中。使用萤火虫荧光素酶通过生物发光成像评估肿瘤负荷。如图13A图解说明的，仅输注暴露于N1的CD8+CAR T细胞后，观察到增强的抗肿瘤作用，尽管这种作用的差异随时间而减小。如上所述，在输注后的几个时间点评估CD8+CAR T细胞的水平。有趣的是，由于与N1抗体一起孵育，没有CD8+CAR T细胞的明显峰扩增。与在输注后第14天达到约30％至45％峰值的CD4+CAR T细胞相反，在其峰值处的CD8+CAR T细胞水平低于淋巴细胞单峰的约2％。评估了输注暴露于N1的CD8+CAR T细胞的NSG-Raji小鼠的存活率。如图13B所示，与输注了暴露于IgG对照的CD8+CAR T细胞的NSG-Raji小鼠相比，输注了暴露于N1-的CD8+CAR T细胞的NSG-Raji小鼠几乎没有延长的存活时间。

为了进一步评估，检查了CD8+CAR T细胞的两种不同培养物。将CD8+CAR T细胞与N1抗体激动剂或IgG1在板上培养7天或培养7天后在正常组织培养烧瓶中培养另外4天(D11组)。如上所述，将CD8+CAR T细胞输注到NSG-Raji小鼠中。通过萤火虫荧光素酶的生物发光成像随时间测试不同输注对肿瘤负荷的影响。如图14A中所示，由于输注了暴露于N1激动剂达7天的CD8+CAR T细胞，导致肿瘤负荷降低的的增加。此外，如图14B所示，暴露于N1激动剂达7天的CD8+CAR T细胞在体内表现出增加的增殖，在输注后第14天左右达到峰值。然而，如图14C所示，与暴露于IgG对照的CD8+CAR T细胞相比，CD8+CAR T细胞功能的这些增强并未导致增加的存活率。

这些结果表明诱导的Notch信号传导对CD4+ T细胞和CD8+ T细胞具有独立或不同的作用。针对CD4+ T细胞的测定证实，在培养物中暴露于Notch激动剂会导致更高的CD4+ T细胞的增殖能力，在输注后第10天到第14天之间具有峰扩增和超过40％的CAR T细胞单重态，而暴露于IgG对照的仅有小于10％的CAR T细胞。然而，尽管相对高的体内扩增水平，但这并未导致可测量的抗肿瘤功效改善。相反，针对CD8+ T细胞的测定证实，在培养物中暴露于Notch激动剂，导致输注后相对较小的T细胞扩增峰。有趣的是，Notch诱导的CD8+ T细胞在输注后表现出更好的肿瘤控制，尽管肿瘤最终生长到与对照CD8+ T细胞输注相同的范围内。考虑到这些独立的作用，检验了CD4+ T细胞和CD8+ T细胞与Notch信号传导的协同。分别生成四种CAR T细胞培养物：暴露于Notch激动剂N1抗体的CD4+CAR T细胞；暴露于对照IgG1抗体的CD4+ CAR T细胞；暴露于Notch激动剂N1抗体的CD8+CAR T细胞；和暴露于对照IgG1抗体的CD8+CAR T细胞。在第11天，将CD4+和CD8+培养物的组合以1:1的比例混合在一起，并输注到NSG-Raji小鼠中。参见例如，Hudecek,M.等人，The NonsignalingExtracellular Spacer Domain of Chimeric Antigen Receptors Is Decisive for InVivo Antitumor Activity,Cancer Immunology Research,125-135(2015)，其全部内容通过引用并入本文，用于公开CD19-CAR T细胞在NSG-Raji小鼠中的应用。对于每种组合，随时间确定CD4+CAR T细胞和CD8+CAR T细胞的增殖。如图15A和15B所示，无论CD8+CAR T细胞先前是否暴露于Notch激动剂，在CD4+CAR T细胞先前暴露于Notch激动剂的情况下的输注导致CD4+CAR T细胞和CD8+CAR T细胞二者的最大增殖。这证明了在培养期间在CD4+ T细胞中的诱导的Notch信号传导增加了CD4+ CART细胞和CD8+CART细胞二者的增殖和延长的持久性，并且在上述实施例中观察到了显著的抗肿瘤功效。

为了进一步表征与N1激动剂抗体一起孵育的CD4+CAR T细胞的表型，使用四甲基若丹明甲酯(TMRM)染色剂进行进一步的测定，以用诱导的Notch信号传导标记CD4+CAR T细胞中的线粒体。将幼稚CD4+ T细胞在含有2.5μg固定化的N1抗Notch抗体的板上培养11天。如图16A所示，与N1抗体一起孵育的CD4+CAR T细胞具有较低的线粒体膜电位，表明增加的代谢适应性。进一步的流式细胞术分析表明，这种由Notch信号传导的降低的线粒体膜电位主要在CD45RA高/CD45RO低CD4细胞中。参见图16B。最终，在培养物中诱导Notch信号传导导致在CD8+ T细胞表面上产生明显的分子谱。参见例如，图16C。

实施例5

在以上实施例中获得的结果基于使用分离的幼稚(即，TN)T细胞的测定。在该实施例中，针对不同的初始T细胞亚群研究了诱导的Notch信号传导的作用。

接下来，对CD4+ T

考虑到诱导的Notch信号传导对不同分选的T细胞亚群具有类似的影响，测试了对所有培养物的影响。将大量的CD8+ T细胞分选并在抗Notch1激动剂抗体、N1或IgG1抗体对照中培养。在培养开始后第5、第7和第11天测试细胞的发育细胞标志物CD28、CD27、CD62L、PD-1、LAG3和CD25的表达。如图20所示，在培养五天后，与具有较高比例的T

实施例6

以上证明了在存在Notch激动剂的情况下产生的CAR T细胞导致较低分化的表型持续延长的时间，而不抑制增殖和功能。表明这些Notch诱导的CAR T细胞在植入Raji淋巴瘤的NSG小鼠中具有增强的功效和持久性，导致与未暴露于Notch激动剂的对照T细胞和对照CAR T细胞的过继转移相比，显著减少的肿瘤负荷和在延长的时间内提高的存活率。最后，体外研究表明，在反复和持续暴露于靶抗原的环境中，Notch诱导的CAR T细胞对耗竭的敏感性较低。与未暴露于Notch激动剂的类似CAR T细胞相比，培养的Notch诱导的CAR T细胞在恒定存在表达靶抗原的细胞的情况下保持较高的增殖活性。

该实施例描述了示例性测定法，以证实体内Notch诱导的CAR T细胞对耗竭的敏感性降低。

可以如上文更详细地描述的，产生实验和对照T细胞，即包括在具有Notch配体、IgG1对照配体或仅组织培养物的板上的培养步骤。培养物还可包含3:1比例的抗CD3/CD28

在一种示例性测定中，可以在Raji-ffluc模型中解决Notch诱导的CAR T细胞敏感性降低的问题，如通常在Hudecek,M.等人，Cancer Immunol Res.,2015,3(2):125-135(其全部内容通过引用并入本文)中更详细地描述的。简言之，可以用编码ffluc/eGFP融合基因的慢病毒转导Raji细胞，以标记细胞，然后用eGFP的表达进行分选以产生Raji-ffluc细胞。如上所述，可以将～5×10

在另一种示例性测定中，可以在ROR1+鼠模型中解决Notch诱导的CAR T细胞敏感性降低的问题，如通常在Hudecek,M.等人，Clin Cancer Res.,2013,19(12):3153-3164(其全部内容通过引用并入本文)中更详细地描述的。简言之，受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)是免疫疗法的候选物，其已通过CAR修饰的T细胞解决。ROR1是包含细胞外免疫球蛋白(Ig)样、卷曲和Kringle结构域的120-kDa的糖蛋白。ROR1在胚胎发生过程中表达但在正常成人组织中不存在，除了未成熟的B细胞前体的子集和脂肪细胞上的低水平表达外。首先证实ROR1通过转录谱在B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)中表达，随后在许多癌症的表面被鉴定出，所述癌症包括套细胞淋巴瘤(MCL)、具有t(1；19)染色体易位的急性淋巴细胞白血病(ALL)以及肺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌和卵巢癌(14-21)的子集。在肺腺癌和t(1；19)ALL中，ROR1在致癌信号传导中协同作用，用siRNA敲低ROR1暴露了该分子在维持肿瘤细胞存活中的关键作用。

对于该示例性测定，通过慢病毒转导具有全长ROR1基因的细胞来产生K562/ROR1和Raji/ROR1细胞。如上面更详细描述的，产生抗CD19和抗ROR1 CAR表达T细胞，包括暴露于Notch-1配体或适当的对照。NSG小鼠接受K562/ROR1和Raji/ROR1细胞(例如，～0.5×10

在任一种测定设计中，都可以随时间从小鼠中采集T细胞，并对其进行增殖状态、细胞毒性和细胞因子产生的测定/监测，如上文更详细地描述的。此外，如上文更详细地描述的，可以使用例如，生物发光分析来监测小鼠的肿瘤负荷，并且在重复施用Raji-ffluc细胞的情况下监测存活率。

鉴于以上结果证实了在受试动物体内延长的存活时间、持久性和激活以及在持续或反复暴露于抗原的环境中对耗竭的降低的敏感性，预期本测定法证实与在培养过程中未接受Notch信号传导的CAR T细胞相比，所施用的Notch诱导的CAR T细胞在体内维持较低分化状态持续延长的时间段。预期这种延长的持久性表现为在体内延长和/或重复的抗原暴露期间的降低的耗竭率，导致肿瘤负荷的增强的减少和/或清除以及增加的受试动物存活率。

实施例7

可以使用EASYSEP

PBS用于稀释用于包被的抗体。Notch1孔用2.5μg/mL的LEAF纯化的Notch1抗体(Biolegend目录号352104)、DLL1、DLL4或N2抗体(Biolegend目录号348301)包被。IgG孔用2.5μg/mL人IgG包被。Retronectin(Takara)以5μg/ml用于包被的孔。在24孔格式中，每孔使用的包被量为0.5mL，在12孔格式中为每孔1mL，并且在6孔格式中为每孔2mL。

使用包装和包膜载体PCHGP-2、pCMV-Rev2和pCMV-G和磷酸钙转染方案产生浓缩的fmc63(抗CD19-41BB CAR)慢病毒。在病毒产生三天后，使用PEG浓缩病毒并超速离心，然后重悬于DMEM中。使用前测量病毒滴度。

转导前一天，将细胞以2e5个细胞/孔的密度在Notch1/retroectin、人IgG/retronectin或TC处理的板中铺板。转导前，将细胞与抗

在T细胞刺激后72小时(转导后48小时)，将细胞转移至包被的或TC处理的12孔板中，并进行半培养基更换加额外500uL培养基。在T细胞刺激后五天，将磁性

增殖(如在Michael Hudecek,Maria-Teresa Lupo-Stanghellini,PaulaL.Kosasih,Daniel Sommermeyer,Michael C.Jensen,Christoph Rader and StanleyR.Riddell DOI:10.1158/1078-0432.CCR-13-0330，2013年7月发表的Receptor Affinityand Extracellular Domain Modifications Affect Tumor Recognition by ROR1-Specific Chimeric Antigen Receptor T Cells中)。

用0.2μmol/L羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；Invitrogen)标记T细胞，洗涤，并用在无外源细胞因子的培养基中的刺激细胞一式三份铺板。在72小时孵育后，将细胞用抗CD4或CD8 mAb、抗EGFR mAb和碘化丙啶标记，并通过流式细胞术分析以评估活CD4/CD8+ T细胞的细胞分裂。

为了进行体外表型和激活分析以及小鼠出血分析，将细胞用单克隆抗体染色20分钟，然后在流式缓冲液中洗涤并在Canto II流式细胞仪上进行数据采集。在Flowjo(Treestar)中分析数据。

尽管已经示出和描述了说明性实施方案，但是应当理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下在其中进行各种改变。

序列表

<110> 福瑞德哈金森癌症研究中心

Riddell, Stanley R.

Bernstein, Irwin D.

Pont, Margot J.

<120> 结合诱导的Notch信号传导的过继T细胞疗法的方法和组合物

<130> FHTM-1-70118

<150> US 62/723936

<151> 2018-08-28

<160> 17

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 685

<212> PRT

<213> 黑鼠（Rattus rattus）

<400> 1

Met Thr Pro Gly Ser Arg Ser Ala Cys Arg Trp Ala Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Val Leu Trp Pro Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Ile Phe Gln Leu

20 25 30

Arg Leu Gln Glu Phe Ala Asn Glu Arg Gly Met Leu Ala Asn Gly Arg

35 40 45

Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Ile Cys Leu Lys His

50 55 60

Tyr Gln Ala Thr Phe Ser Glu Gly Pro Cys Thr Phe Gly Asn Val Ser

65 70 75 80

Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Val Ile Arg Asp Lys Asn Ser

85 90 95

Gly Ser Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro

100 105 110

Gly Thr Phe Ser Leu Asn Ile Gln Ala Trp His Thr Pro Gly Asp Asp

115 120 125

Leu Arg Pro Glu Thr Ser Pro Gly Asn Ser Leu Ile Ser Gln Ile Ile

130 135 140

Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Lys Asn Trp Lys Ser Asp Glu Gln

145 150 155 160

Asn Asn Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val Val Cys Ser

165 170 175

Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Ser Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asp

180 185 190

Asp His Phe Gly His Tyr Glu Cys Gln Pro Asp Gly Ser Leu Ser Cys

195 200 205

Leu Pro Gly Trp Thr Gly Lys Tyr Cys Asp Gln Pro Ile Cys Leu Ser

210 215 220

Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Asp Glu Cys Asn

225 230 235 240

Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Pro Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His

245 250 255

Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Thr Ile Pro Trp Gln Cys Ala Cys

260 265 270

Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys

275 280 285

Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ser Thr Cys Ser Asn Ser Gly

290 295 300

Pro Arg Gly Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Pro Gly Tyr Thr Gly Glu His

305 310 315 320

Cys Glu Leu Glu Leu Ser Lys Cys Ala Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly

325 330 335

Gly Ser Cys Lys Asp His Glu Asn Ser Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro

340 345 350

Gly Tyr Tyr Gly Gln His Cys Glu His Ser Thr Leu Thr Cys Ala Asp

355 360 365

Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala

370 375 380

Ser Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu

385 390 395 400

Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln

405 410 415

Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Thr Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe

420 425 430

Thr Gly Thr His Cys Glu Leu His Ile Ser Asp Cys Ala Arg Ser Pro

435 440 445

Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Pro Val Cys

450 455 460

Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Ile Thr

465 470 475 480

Asn Asp Ala Cys Ala Ser Gly Pro Cys Phe Asn Gly Ala Thr Cys Tyr

485 490 495

Thr Gly Leu Ser Pro Asn Asn Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe

500 505 510

Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe Pro

515 520 525

Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Val Val Leu Leu Val Leu

530 535 540

Leu Val Met Val Ala Val Ala Val Arg Gln Leu Arg Leu Arg Arg Pro

545 550 555 560

Asp Asp Asp Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gln Lys

565 570 575

Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asn Thr Asn Gln Lys Lys

580 585 590

Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys Leu

595 600 605

Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Phe Leu Gly Arg

610 615 620

Gly Ser Thr Pro Gly Lys Tyr Pro His Ser Asp Lys Ser Leu Gly Glu

625 630 635 640

Lys Val Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Ala Cys Arg Ile Ser

645 650 655

Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gln Ser Val Cys Leu Ile

660 665 670

Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val

675 680 685

<210> 2

<211> 257

<212> PRT

<213> 黑鼠（Rattus rattus）

<400> 2

Ser Gly Ile Phe Gln Leu Arg Leu Gln Glu Phe Ala Asn Glu Arg Gly

1 5 10 15

Met Leu Ala Asn Gly Arg Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe

20 25 30

Arg Ile Cys Leu Lys His Tyr Gln Ala Thr Phe Ser Glu Gly Pro Cys

35 40 45

Thr Phe Gly Asn Val Ser Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Val

50 55 60

Ile Arg Asp Lys Asn Ser Gly Ser Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro

65 70 75 80

Phe Asn Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Asn Ile Gln Ala Trp

85 90 95

His Thr Pro Gly Asp Asp Leu Arg Pro Glu Thr Ser Pro Gly Asn Ser

100 105 110

Leu Ile Ser Gln Ile Ile Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Lys Asn

115 120 125

Trp Lys Ser Asp Glu Gln Asn Asn Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser

130 135 140

Tyr Arg Val Val Cys Ser Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Ser Cys Ser Arg

145 150 155 160

Leu Cys Lys Lys Arg Asp Asp His Phe Gly His Tyr Glu Cys Gln Pro

165 170 175

Asp Gly Ser Leu Ser Cys Leu Pro Gly Trp Thr Gly Lys Tyr Cys Asp

180 185 190

Gln Pro Ile Cys Leu Ser Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser

195 200 205

Lys Pro Asp Glu Cys Asn Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Pro Leu Cys

210 215 220

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Gln

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