用于呼出气冠状病毒的可视化快速检测口罩及其制备方法

技术领域

本发明涉及医疗用品技术领域，具体涉及一种用于呼出气冠状病毒的可视化快速检测口罩及其制备方法。

背景技术

冠状病毒是一类主要引起呼吸道、肠道疾病的病原体。在这些病毒的表面有很多突起，像一顶皇冠，所以被命名为冠状病毒。冠状病毒属的病毒是具外套膜(envelope)的正链单股RNA病毒，直径约80～120nm，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，感染人、鼠、猪、猫、犬、狼、鸡、牛、禽类脊椎动物。冠状病毒的一个变种SARS-CoV是引起重症急性呼吸综合征(SARS)的病原体，属于RNA病毒。

冠状病毒最早于1937年从鸡身上分离出来，病毒颗粒的直径60～200nm，平均直径为100nm，呈球形或椭圆形，具有多形性。冠状病毒有包膜，包膜上存在棘突，整个病毒像日冕，不同的冠状病毒的棘突有明显的差异。当冠状病毒感染细胞内时，有时可见管状的包涵体。目前为止，已知可以感染人类的冠状病毒有7种：2019新型冠状病毒(2019-nCoV)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于2019新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。

目前，对于2019新型冠状病毒的检测方法主要是胸部CT以及反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等，但是，这些方法需要借助专业人士以及专业设备，通常只能在医院或者专业机构完成检测，这就导致这些检测方法的应用大大受限。其次，大量疑似病人进入医院检测，极大地增加了交叉感染的风险，也导致医疗资源的紧张。面对突发的疫情，急需要一种快速诊断的方法来居家筛查使用，对疑似病人进行初筛，以实现对暂时无法确诊的疑似病人以及无法去医院检测的其他人群(易感人群、老人、小孩等)初步快速的诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于呼出气冠状病毒的可视化快速检测口罩及其制备方法，该口罩可便捷、快速地检测呼出气中是否有冠状病毒，是对目前冠状病毒检测方法的补充，尤其是对于2019新型冠状病毒，可显著提升诊断效率、提高检测准确度。

为此，本发明第一方面提供一种用于呼出气冠状病毒的可视化快速检测口罩，所述可视化快速检测口罩包括口罩主体、呼吸阀和试纸条；

所述试纸条设置于呼吸阀上，用于接收待测的呼出气；

所述试纸条包括滤片、样品垫、结合垫、显色垫和吸水垫；

所述样品垫、结合垫、显色垫和吸水垫依次搭接，贴合设置于所述滤片上；

所述样品垫位于所述滤片的上表面，具有吸水涂层；所述滤片的上表面朝向所述口罩主体的内侧；

所述结合垫包含胶体金，所述胶体金包被有冠状病毒N蛋白抗体；

所述显色垫位于所述滤片的下表面，设有检测线和质控线，所述检测线靠近所述结合垫一侧，所述质控线靠近所述吸水垫一侧；所述检测线包被有冠状病毒E蛋白抗体，所述质控线包被有抗冠状病毒N蛋白抗体IgG；

所述吸水垫位于所述滤片的下表面。

当受试者戴着所述可视化快速检测口罩呼吸时，由于呼吸阀为单向出气阀，呼出气主要经呼吸阀排出，设于呼吸阀上的试纸条的样品垫接收大量呼出气，在吸水垫的吸附作用下，呼出气中的水汽依次经样品垫、结合垫、显色垫，到达吸水垫。在此过程中，呼出气中的冠状病毒(如有)与对应抗体特异性结合，根据免疫反应原理实现显色检测。

进一步，所述口罩本体选自一次性使用医用口罩、医用外科口罩、工业防护口罩或民用防护口罩。在具体的实施方式中，选用N95口罩，例如3M 9501V口罩。

进一步，所述样品垫的吸水涂层的材料包括MOFs-HKUST-1、Cr-soc-MOF-1、NU-1500-Cr、活性炭、多孔硅中的一种或多种。

进一步，所述胶体金的粒径为10-50nm。

进一步，所述冠状病毒N蛋白抗体包括兔anti-SARS Nsp3抗体、兔MERS&SARS-CoVNP抗体。

进一步，所述冠状病毒N蛋白抗体包被胶体金的结合浓度为30-60μg/ml。

进一步，所述冠状病毒E蛋白抗体包括兔anti-SARS E蛋白抗体。

进一步，所述冠状病毒E蛋白抗体的包被浓度为1-5μg/cm。

进一步，所述抗冠状病毒E蛋白抗体IgG为羊抗兔IgG单克隆抗体。

进一步，所述抗冠状病毒E蛋白抗体IgG的包被浓度为1-5μg/cm。

本发明的第二方面提供了所述用于呼出气冠状病毒的可视化快速检测口罩的制备方法，包括：

(1)将样品垫表面涂覆所述吸水涂层，厚度为1-2mm；

(2)将冠状病毒N蛋白抗体包被于胶体金，将包被冠状病毒N蛋白抗体的胶体金均匀涂覆于结合垫表面，室温晾干；

(3)在显色垫上分别刻画检测线和质控线，将冠状病毒E蛋白抗体包被于检测线，将抗冠状病毒N蛋白抗体IgG包被于质控线，室温晾干；

(4)将步骤(1)制备的样品垫、步骤(2)制备的结合垫、步骤(3)制备的显色垫以及吸水垫依次粘附在滤片上，即制备得到所述试纸条；

(5)取设有呼吸阀的口罩本体，将步骤(4)制备的试纸条固定于呼吸阀上，使所述样品垫朝向口罩内侧，即制备得到所述用于呼出气冠状病毒的可视化快速检测口罩。

在具体实施方式中，所述吸水涂层的材料为MOFs-HKUST-1，步骤(1)包括：将硝酸铜溶液和乙醇胺溶液混合，在室温下静置24-36h，经有机相滤膜抽滤后得到第一薄膜材料；然后将第一薄膜材料与均苯三甲酸的乙醇水溶液在常温下反应0.5-2h，得到第二薄膜材料；将第二薄膜材料涂覆于样品垫表面。

进一步，步骤(2)中，所述胶体金的制备方法包括：以氯金酸为主要原料，通过还原反应制备得到所述胶体金；所用的还原剂选自柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠中的一种或多种；优选为柠檬酸钠。

本发明的第三方面提供了一种用于呼出气冠状病毒的检测方法，包括以下步骤：

受试者佩戴本发明所述的可视化快速检测口罩0.5-1h；观察检测线和质控线的颜色变化。

结果判定方法如下：

所述质控线和所述检测线都出现红色条带，判定为阳性结果；

仅在所述质控线出现红色条带，判定为阴性结果；

所述质控线无红色条带出现，不论所述检测线是否出现红色条带，判定结果无效。

本发明从受试者呼出气为出发点，呼出气相比于痰液、唾液，呼出气病毒携带量大、准确性高，尤其是对于早期或者潜伏期的疑似病人可显著增强诊断率。为了能够增强呼出气检测的灵敏度和便捷性，本发明设计了一种全新的可视化检测试纸条，试纸条可直接镶嵌在口罩气阀处，达到实时捕获、富集水分和病毒的功能。本发明提供的可视化快速检测口罩及相应的检测方法是对目前现有的检测手段的重要补充，大大提高新型冠状病毒的快速检测，尤其是对于早期或者潜伏期的疑似病人可显著的增强诊断率。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明提供的可视化快速检测口罩集纳米MOF涂层制备技术、单克隆抗体制备技术、纳米金标记技术、免疫检测技术和膜层析技术于一体；利用样品垫的吸水涂层，对呼出气中的水汽和病毒进行高效吸附和截获；利用抗原抗体反应的高度专一结合的特性，高效、专一、灵敏、快速的识别病毒；并通过免疫金标记技术，在不借助专业仪器设备的条件下，依靠目测就可以获知定性的检测结果。

(2)本发明以受试者的呼出气为检测对象，相比于痰液、唾液等体液，呼出气的病毒携带量更大，故本发明提供的可视化快速检测口罩对于早期或者潜伏期的疑似病人亦可实现准确诊断。

(3)相对于目前常用的电镜技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等检测方法，本发明提供的可视化快速检测口罩操作简单、便于携带、成本低廉，仅需佩戴0.5h即可实现快速检测，适合居家筛查适用。

(4)当具体选用Anti-SARS E蛋白抗体、anti-SARS N蛋白抗体、抗anti-SARS N蛋白抗体羊IgG多克隆抗体时，本发明提供的可视化快速检测口罩可快速诊断受试者是否感染2019新型冠状病毒或SARS病毒，尤其是对于早期或者潜伏期的疑似病人可显著增强诊断率。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1为本发明的用于呼出气冠状病毒的可视化快速检测口罩的示意图；

图2为试纸条的正面示意图；

图3为试纸条的反面示意图；

图4为样品垫的MOF涂层上表面的电镜表征图；

图5为样品垫的MOF涂层侧面的电镜表征图；

图6为结合垫涂覆胶体金前后的对比图，图6A示出了未涂覆胶体金的结合垫照片，图6B示出了涂覆了包被有冠状病毒N蛋白抗体的胶体金的结合垫照片；

1-口罩主体，2-呼吸阀，3-试纸条，31-滤片，32-样品垫，33-结合垫，34-显色垫，341-检测线，342-质控线，35-吸水垫。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1

本实施例提供了一种用于呼出气冠状病毒的可视化快速检测口罩，参照图1和图2，所述可视化快速检测口罩包括口罩主体1，呼吸阀2和试纸条3，所述试纸条3设置于呼吸阀2上，用于接收待测的呼出气；所述试纸条3包括滤片31、样品垫32、结合垫33、显色垫34和吸水垫35；所述样品垫32、结合垫33、显色垫34和吸水垫35依次搭接，贴合设置于所述滤片31上；所述样品垫32位于所述滤片31的上表面，具有吸水涂层；所述滤片31的上表面朝向口罩主体1的内侧；所述结合垫33包含胶体金，所述胶体金包被有冠状病毒N蛋白抗体；所述显色垫34位于所述滤片31的下表面，设有检测线341和质控线342，所述检测线341靠近所述结合垫33一侧，所述质控线342靠近所述吸水垫35一侧；所述检测线341包被有冠状病毒E蛋白抗体，所述质控线342包被有抗冠状病毒N蛋白抗体IgG；所述吸水垫35位于所述滤片31的下表面。

当受试者戴着所述可视化快速检测口罩呼吸时，由于呼吸阀2为单向出气阀，呼出气主要经呼吸阀2排出，设于呼吸阀2上的试纸条3的样品垫32接收大量呼出气，在吸水垫35的吸附作用下，呼出气中的水汽依次经样品垫32、结合垫33、显色垫34，到达吸水垫35。在此过程中，呼出气中的冠状病毒(如有)与对应抗体特异性结合，根据免疫反应原理实现显色检测。

实施例2

本实施例制备了一种用于呼出气冠状病毒的可视化快速检测口罩，包括：

1材料与试剂

1.1材料

3M9501V口罩购自北京禹通宏业科技发展有限公司。滤片、样品垫、吸水纸、结合垫、显色垫、吸水垫购自北京艾德康瑞科技有限公司。

1.2抗体

Anti-SARS E抗体、anti-SARS N蛋白抗体、抗anti-SARS N蛋白抗体羊IgG多克隆抗体购自英国Abcam。

2实验方法

2.1吸水MOF样品垫的制备

将相同体积的硝酸铜溶液(4mM)和乙醇胺溶液迅速混合，并在室温下静置36h。在尼龙66的有机相滤膜(0.22μm)上抽滤60mL的反应液得到淡蓝色的薄膜材料。随后将所得到的薄膜材料与15mL均苯三甲酸(5mM)的乙醇水溶液(v:v＝1:1)在常温下反应1h，得到深蓝色的HKUST-1薄膜。选取纤维素膜带作为样品垫，喷涂含5％BSA，0.1％Tween 20的PBS缓冲液，室温风干。将MOFs-HKUST-1薄膜涂在样品垫表面，静置室温风干。

2.2结合垫的制备

选取玻璃纤维素带作为结合垫固相材料，在条带上喷涂N蛋白抗体包被的胶体金，室温风干。

2.3显色垫的制备

在显色垫上画出质控线和检测线，质控线和检测线的间距为0.5-0.8cm，分别在质控线和检测线上包被抗anti-SARS N蛋白抗体羊IgG和E蛋白抗体，室温风干。

2.4组装检测口罩

将样品垫、结合垫、显色垫、吸水垫及滤片如图2所示安装好，然后用切割机切成试纸条，镶嵌入口罩气阀处，将样品垫一面朝向口罩内侧，即制备得到用于呼出气冠状病毒的可视化快速检测口罩。将本实施例制备得到的口罩用于实施例3-6。

实施例3定性检测

在无菌条件下，用患者(感染2019新型冠状病毒)呼出气对样品垫进行吹气，吹气时间为0.5h，静置5min后，观察检测线和质控线颜色变化；以气化的2019新型冠状病毒原液为对照组进行比对。

实验结果显示，气化的冠状病毒原液组和患者呼出气组的质控线均显示红色，说明此次数据有效。在检测线上均发现红色条带，说明本发明的试剂条可用于2019新型冠状病毒的定性检测。

实施例4特异性测定

分别使健康人、流感患者和新冠肺炎患者(感染2019新型冠状病毒)佩戴实施例1制备的可视化快速检测口罩，佩戴时间为0.5h。观察检测线和质控线颜色变化。

实验结果显示，三组样品的质控线均显示红色，说明此次数据有效。健康人组、流感病人组的检测线没有颜色变化，说明无2019新型冠状病毒感染。新冠肺炎患者组，检测线出现明显红色，说明该组患者感染有2019新型冠状病毒。

实施例5灵敏度测定

设置浓度梯度依次为10

实施例6临床患者检测

由于不同感染程度的患者，在单位时间内呼出气中病毒的含量是不同的，本实施例根据临床患者的检测结果，确定了不同感染程度的患者所需的检测时间。

将感染冠状病毒的患者按照感染的严重程度，分别设置为早期患者组、中期患者组和晚期患者组，分别佩戴实施例2制备的可视化快速检测口罩，观察需要多久的时间可以在检测线上观察到明显的颜色变化。结果显示，对于早期患者口罩佩戴时间达到55-60min时，可明显观察到检测线颜色变化；对于中、晚期患者，口罩佩戴时间在25-30min时，可明显观察到检测线的颜色变化。

由上述结果可知，为了达到有效检测的目的，对于早期患者，口罩佩戴时间不少于60min；对于中、晚期患者，口罩佩戴时间不少于30min。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。