cGAS基因抑制剂在作为治疗心脏移植排斥药物中的应用

技术领域

本发明属于医学生物工程领域，具体涉及cGAS基因抑制剂在作为治疗心脏移植排斥药物中的应用。

背景技术

器官移植是治疗终末期器官衰竭最有效的治疗方法，可改善受者病情，延长其生存时间，提高受者的生活质量。据文献报道，心脏移植术后1年、5年和10年的总生存率分别为84.8％，72.4％和53.5％，平均生存时间可达14.8年。但由于原发终末期心脏病、术后并发症和终生服用免疫抑制药物等原因，心脏移植受者会存在较复杂的症状经历，部分症状可同时发生，影响生活质量。在心脏移植过程中不可避免地会发生缺血再灌注损伤，严重影响了心脏移植地临床预后。供心保存于器官保存液中，均会经历热缺血、冷缺血和再灌注损伤，引起炎性细胞因子释放，激活抗原提呈细胞，进而招募更多地CD4+、CD8+细胞，进而加强移植物排异作用。缓解移植器官缺血再灌注损伤，延长患者器移植器官的存活时间是迫在眉睫的问题。因此，针对上述过程新型靶点的药物开发，开发新的治疗策略十分迫切。

cGAS是主要的胞质DNA识别受体。cGAS可以识别病原微生物，比如DNA病毒(如HSV-1)、逆转录病毒(如HIV)和细菌。除此之外，cGAS还可以识别人工合成的双链DNA、线粒体或细胞核DNA。也有许多研究表明，当诸多器官如脑、肾脏、肝脏等，在经历缺血再灌注损伤后，cGAS被激活，促进了炎性细胞因子如IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-1β、TNF-α等的释放。

目前针对cGAS的研究主要集中于肿瘤、病毒感染、自身免疫疾病等，尚未有人在移植方向报道，针对cGAS蛋白及及其抑制剂的研究，在器官移植邻域，具有极大的应用价值和开发前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种cGAS基因抑制剂在作为治疗心脏移植排斥药物中的应用。本发明基于发现的新基因在器官移植中的作用机制，从而以cGAS基因为靶点应用药物治疗，缓解器官移植后排斥反应的作用。

本发明具体采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种cGAS基因抑制剂在作为治疗心脏移植排斥药物中的应用。

作为上述第一方面的优选，所述cGAS基因抑制剂为cGAS分子抑制剂Ru.521。

需说明的是，本发明中的cGAS分子抑制剂Ru.521，其CAS号为2262452-06-0，属于现有的市售产品。

作为上述第一方面的优选，所述cGAS分子抑制剂Ru.521用于作为治疗药物提高小鼠颈部心脏移植物的存活时间。

作为上述第一方面的优选，所述治疗药物给药后，小鼠颈部心脏移植物浸润的CD4+、CD8+淋巴细胞减少。

作为上述第一方面的优选，所述治疗药物给药后，小鼠颈部心脏移植物中炎性细胞因子的浸润程度减弱.

作为上述第一方面的优选，所述治疗药物给药后，小鼠颈部心脏移植物中脾脏淋巴细胞比例减少，脾脏活化的CD4+、CD8+T淋巴细胞比例减少。

作为上述第一方面的优选，所述药物为用磷酸盐缓冲液稀释药物母液得到的注射液，所述药物母液为cGAS分子抑制剂Ru.521的二甲基亚砜溶液。

作为上述第一方面的优选，cGAS分子抑制剂Ru.521的给药浓度为10mg/kg/天。

第二方面，本发明提供了一种心脏移植排斥治疗药物，其由cGAS基因抑制剂和药用辅料组成。

作为上述第二方面的优选，所述cGAS基因抑制剂为cGAS分子抑制剂Ru.521。

需说明的是，上述器官移植治疗药物的形式不限，理论上可以制成注射剂、片剂、粉剂等形式，具体的药用辅料需要根据药物形式进行选择。

作为上述第二方面的优选，上述治疗药物为用磷酸盐缓冲液稀释药物母液得到的注射液，所述药物母液为cGAS分子抑制剂Ru.521的二甲基亚砜溶液。

本发明提供了一种新基因cGAS在器官移植邻域内的研究，进而扩展一种cGAS蛋白抑制剂Ru.521的新用途，可应用于器官移植领域内。经实验证明，经cGAS蛋白抑制剂Ru.521治疗后，观察实验组与对照组小鼠颈部心脏移植物的存活时间延长，移植物浸润的CD4+、CD8+淋巴细胞减少，移植物中炎性细胞因子的浸润程度减弱，脾脏淋巴细胞比例减少，脾脏活化的CD4+、CD8+T淋巴细胞比例减少。

附图说明

图1为使用cGAS基因敲除的小鼠心脏移植物及使用Ru.521治疗后的小鼠心脏移植手术后的移植物生存曲线。

图2为小鼠心脏移植后第7天HE染色示意图。

图3为鼠心脏移植后第7天移植物免疫环境流式分析结果。

图4为鼠心脏移植后第7天脾脏免疫环境流式分析结果。

图5为小鼠HL-1细胞系cGAS-STING信号通路在双氧水条件下的激活情况。

图6为敲降HL-1细胞系的cGAS对HL-1细胞的炎症因子释放的影响。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

下述实施例中所用的试剂和材料，若无特殊说明，均可采用市售产品。

实施例1

本实施例中，使用CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建cGAS基因敲除的小鼠，cGAS基因敲除的小鼠不会表达cGAS蛋白，用cGAS敲除的小鼠心脏作为移植物，通过构建小鼠颈部异位心脏移植模型，观察cGAS基因敲除移植物的存活时间，并对相应指标进行分析。Ru.521(CAS:2262452-06-0)是一种特异性cGAS抑制剂，能抑制胞质中的双链DNA与cGAS蛋白的结合，为了将cGAS靶向抑制剂推向应用，进一步使用Ru.521于移植后的小鼠，观察移植物的存活时间，并对相应指标进行分析。

1.构建小鼠颈部异位心脏移植模型及给药

1.1实验动物及主要材料：雄性纯系Balb/c小鼠，体重20-25g，购于上海斯莱科公司；雄性纯系C57BL/6背景，体重20-25g，购于上海斯莱科公司；C57BL/6背景来源cGAS基因敲除小鼠，体重20-25g，由他人实验室赠予。

1.2方法：利用已经建立多年的小鼠心脏移植作为研究模型，C57BL/6野生型小鼠及cGAS基因敲除小鼠为移植心脏供体，而BALB/c作为移植受体。为避免性别因素对移植的干扰，实验将全部采用雄性小鼠。供体取C57BL/6小鼠，用戊巴比妥溶液(0.1g/10ml)，剃毛后以碘伏局部消毒、全身肝素化(100U/ml)后，立即取下供体小鼠的心脏，放入4℃HTK心脏保存液中储存，然后将供体升主动脉和受体颈总动脉、供体肺动脉和受体颈外静脉行套管吻合，术后每日手指触诊受鼠颈部供心心跳，如供心室性心跳不再搏动或仅有细微颤动均视为排斥终点。

1.3分组及给药方式：以野生Balb/C小鼠作为受体，移植上野生型C57BL/6小鼠心脏作为野生型移植物组，移植上cGAS敲除的C57BL/6小鼠心脏作为cGAS

2.体外细胞系实验及给药

2.1细胞培养：使用的小鼠心房肌细胞系HL-1购买自武汉普诺赛生命科技有限公司，培养在5％ CO2、37℃的细胞培养箱中。其中，HL-1使用MEM培养基；细胞完全培养液配比：50ml胎牛血清，5ml青霉素，5ml链霉素，450ml培养基。

2.2质粒构建：构建cGAS敲低慢病毒载体质粒，步骤如下：1)目的片段的获得；2)选择质粒载体；3)酶切位点的选择和分析；4)连接、转化；5)挑取克隆提质粒并验证。

2.3质粒转染：转染前24h将HL-1细胞系接种到6孔板中，质粒经过与转染试剂混合、静置后，将其混合体系加入无血清培养基中，轻摇后放于细胞培养箱培养，并在转染后6h更换完全培养基继续培养。48h后，荧光显微镜检测质粒转染效率，蛋白质免疫印迹检验质粒转染效果。

2.4Western blotting：收集转染、接受不同双氧水处理的HL-1细胞，加入蛋白裂解液裂解细胞，冰上反应30min。离心取上清液，按照BCA蛋白定量检测试剂盒说明书所示，进行上清液蛋白定量操作。将蛋白样品加入8％或12％的SDS聚丙烯酰胺电泳凝胶中，于120V电压下电泳60分钟，电泳结束后，将凝胶中的蛋白转印至PVDF膜上。封闭液在4℃下封闭40分钟。将PVDF膜加入一抗稀释液中，在4℃条件下孵育过夜。经TBST缓冲液洗涤3次后，加入二抗稀释液中，在4℃下条件下孵育2小时。经TBST缓冲液洗涤3次后，将显色液滴加至PVDF膜表面，化学发光成像仪曝光显影。最后将曝光条带在Image J软件上进行分析处理。

2.5细胞免疫荧光：步骤如下：1)制作细胞爬片；2)固定；3)细胞打孔；4)细胞封闭；5)孵育抗体；6)爬片固定；7)激光共聚焦显微镜图像采集以及统计分析。

2.实验结果

建立小鼠颈部异位心脏移植模型，使用cGAS基因敲除的小鼠心脏移植物及使用Ru.521药物治疗的小鼠移植物存活时间延长(结果见于图1)。使用cGAS基因敲除的小鼠移植术后第7天HE结果显示移植物中浸润淋巴细胞数量减少，免疫组化染色结果显示移植物中的IL-6、TNF-α、IFN-γ炎性细胞因子浸润程度降低(结果见于图2)，使用cGAS基因敲除的小鼠的移植物及脾脏中浸润的活化的CD8

体外HL-1细胞系实验中，用双氧水(H

由此可见，cGAS分子抑制剂Ru.521可以作为治疗小鼠心脏移植的药物进行应用。

需要说明的是，虽然上述实施例以小鼠作为治疗对象，但是本发明并不仅限于治疗小鼠心脏移植，在其他的哺乳动物器官中也可以用于cGAS分子抑制剂治疗小鼠心脏移植，延长移植物存活时间。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。