人IL-6突变体及其应用

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种人IL-6突变体及其应用。

背景技术

白细胞介素6(IL-6)既是促炎细胞因子，又是抗炎肌因子，在人类中，由IL6基因编码。此外，成骨细胞分泌IL-6以刺激破骨细胞的形成，许多血管中膜中的平滑肌细胞也产生IL-6作为促炎细胞因子。IL-6作为抗炎肌因子的作用是通过其对TNF-α和IL-1的抑制作用及其对IL-1ra和IL-10的激活介导的。

IL-6可刺激多种疾病的炎症和自身免疫过程，例如多发性硬化症、视神经脊髓炎谱系障碍(NMOSD)、糖尿病、动脉粥样硬化、抑郁症、阿尔茨海默病，系统性红斑狼疮，多发性骨髓瘤，前列腺癌，白塞氏病，类风湿性关节炎，和脑出血；因此可开发抗IL-6药物，作为治疗这些疾病的方法。例如托珠单抗，已被批准用于治疗类风湿性关节炎、卡斯尔曼病和全身性幼年特发性关节炎。

检测人体中IL-6需要制备高亲和力和高纯度的单克隆抗体。目前国内外针对IL-6单克隆抗体的纯化主要是采用偶联IL-6抗原的亲和层析柱、Protein A柱、Protein G柱等。其中，Protein A柱和Protein G柱的纯化收率、相对纯度均较低，而偶联IL-6抗原的亲和层析柱纯化得到的单抗具有特异性好、纯度高等优势。但是，由于IL-6抗原亲和柱与抗体结合力强，因此，采用偶联IL-6抗原的亲和层析柱纯化也存在一定问题，即对抗体的洗脱非常困难，收率较低。

发明内容

针对现有技术存在的偶联IL-6抗原的亲和层析柱纯化时，对抗体的洗脱非常困难，收率较低的问题，本发明提出了一种人IL-6突变体及其应用，人IL-6突变体的蛋白结构发生改变，降低其与IL-6单克隆抗体的亲和力，从而降低了IL-6抗原亲和层析柱与抗体的结合力，利用这个特点，用于制备IL-6单克隆抗体纯化使用的亲和层析柱。

本发明的技术方案是：

本发明保护一种人IL-6突变体，是在氨基酸序列如SEQ ID No:9所示的人IL-6抗原的基础上突变得到，突变位点为A13D、K27R、N48K。

进一步的，所述人IL-6突变体的氨基酸序列为SEQ ID No:8。

本发明还保护编码所述人IL-6突变体的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ IDNo:1。

本发明还保护构建所述人IL-6突变体的突变引物对，所述突变引物对包括A13D突变引物对、K27R突变引物对、N48K突变引物对；

所述A13D突变引物对的上游引物序列为SEQ ID No:2，其下游引物序列为SEQ IDNo:3；

所述K27R突变引物对的上游引物序列为SEQ ID No:4，其下游引物序列为SEQ IDNo:5；

所述N48K突变引物对的上游引物序列为SEQ ID No:6，其下游引物序列为SEQ IDNo:7；

上述突变引物对以SEQ ID NO:10所示序列的IL-6基因为扩增模板。

本发明保护所述的人IL-6突变体在制备亲和层析柱中的应用。

进一步的，所述人IL-6突变体作为抗原。

本发明又保护一种亲和层析柱，用于人IL-6抗体纯化使用，所述亲和层析柱以sepharose4b为载体，偶联所述的人IL-6突变体蛋白。

本发明的有益效果：

本发明提供的人IL-6突变体，通过蛋白构象的改变，降低了其与抗体的亲和性，采用该突变体制备的亲和层析柱在纯化特异性的IL-6抗体时，在二者结合率变化不大的前提下，变得更容易洗脱分离，纯化的抗体纯度高，回收率大大提升。

本发明通过对IL-6蛋白突变的实验，经过大量筛选，确定了C端的A13D，K27R，N48K突变位点能引起IL-6抗原与抗体亲和力的减弱，基于此，制备了IL-6抗原突变体亲和层析柱；该亲和层析柱以sepharose 4b为载体，偶联IL-6突变体，可以快速、高效的得到高纯度IL-6单克隆抗体。

附图说明

图1为IL-6突变体蛋白纯度分析结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的试剂和生物材料，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。

实施例1 IL-6基因突变库的构建

IL-6抗原(购自上海友科生物科技有限公司，人工合成)的氨基酸序列如SEQ IDNo:9所示；其碱基序列如SEQ ID No:10所示。

为了解决IL-6抗原(氨基酸序列如SEQ ID No:9所示，核苷酸序列如SEQ ID No:10所示)抗体的结合力，通过定向进化技术对该蛋白进行了大量突变的筛选，优化并自行设计3对PCR引物：

1)用于A13D突变引物对：

上游引物如SEQ ID No:2所示，即：5’-GGAATTCGGATCCCCAGTACCCCCAGGAGAAG-3’；

下游引物如SEQ ID No:3所示，即：5’-ACGCCTCGAGCTGTCTGTGTGGGTCGGC-3’。

2)用于K27R突变引物对：

上游引物如SEQ ID No:4所示，即：5’-GGAATTCGGATCCAGACAGCCACTCACC-3’；

下游引物如SEQ ID No:5所示，即：5’-ACGCCTCGAGGTACCGAATTTGTCTGTC-3’。

3)用于N48K突变引物对：

上游引物如SEQ ID No:6所示，即：5’-GGAATTCGGATCCCGACGGCATCTCAGCCCT-3’；

下游引物如SEQ ID No:7所示，即：5’-ACGCCTCGAGTCACATTTGCCGAAGAG-3’。

实施例2 IL-6突变体表达菌株的构建和发酵

步骤1、以IL-6基因为模板，使用上述引物，加入2×TransStart FastPfu PCRSuperMix扩增整个质粒基因。PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸5min，30个循环后，72℃充分延伸10min，4℃保存。PCR结束后加入DMT酶消化体外降解非突变型质粒模板，胶回收目的基因。

步骤2、将胶回收突变体基因和pET-28a载体用BamHI和XhoI酶切后暴露出相同的末端，T4连接酶室温连接，转化DMT感受态细胞中，涂布LB+Kan平板，37℃过夜培养。次日，筛选得到重组菌株。

步骤3、从培养平板挑取单克隆菌落接种到10ml LB+Kan培养基中，37℃培养后，提取质粒，送测序公司检测。

步骤4、检测成功的质粒转化到BL21(DE3)感受态中，涂布LB+Kan平板，37℃过夜培养。挑取单克隆菌落接种到5ml LB+Kan培养基中，37℃培养后接种到500ml LB+Kan培养基中，37℃扩大培养至OD

IL-6突变体蛋白的突变位点为A13D，K27R，N48K，得到的IL-6突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示，即：

PVPPGEDSKDVADPHRQPLTSSERIDRQIRYILDGISALRKETCNKSKMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM。

该IL-6突变体蛋白的编码基因序列如SEQ ID No:1所示，即：

CCAGTACCCCCAGGAGAAGATTCCAAAGATGTAGCCGACCCACACAGACAGCCACTCACCTCTTCAGAACGAATTGACAGACAAATTCGGTACATCCTCGACGGCATCTCAGCCCTGAGAAAGGAGACATGTAACAAGAGTAAGATGTGTGAAAGCAGCAAAGAGGCACTGGCAGAAAACAACCTGAACCTTCCAAAGATGGCTGAAAAAGATGGATGCTTCCAATCTGGATTCAATGAGGAGACTTGCCTGGTGAAAATCATCACTGGTCTTTTGGAGTTTGAGGTATACCTAGAGTACCTCCAGAACAGATTTGAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTACAAAAGTCCTGATCCAGTTCCTGCAGAAAAAGGCAAAGAATCTAGATGCAATAACCACCCCTGACCCAACCACAAATGCCAGCCTGCTGACGAAGCTGCAGGCACAGAACCAGTGGCTGCAGGACATGACAACTCATCTCATTCTGCGCAGCTTTAAGGAGTTCCTGCAGTCCAGCCTGAGGGCTCTTCGGCAAATGTGA。

实施例3 IL-6突变体纯化

缓冲液A：50mM PBS，500mM NaCl；

缓冲液B：50mM PBS，500mM NaCl，500mM imidazole。

纯化步骤如下：

诱导表达后的菌液8000rpm离心5min，缓冲液A重悬菌体，超声破碎30min后12000rpm离心30min收集上清液；

将上清液加入到Ni-NTA中结合1h，使用缓冲液A和缓冲液B配制咪唑浓度为10mM，20mM，50mM，200mM缓冲液分步洗脱目的蛋白；

启动蠕动泵，流速30rpm，同时打开蛋白检测仪，用上述配制好的各种梯度的缓冲液冲至检测仪基线至平稳；

收集各种梯度洗脱的蛋白样品，并取少量样品制备SDS-PAGE所需要的样品；

收集目的蛋白并浓缩换液，测定蛋白浓度。

IL-6抗原突变体的纯度分析，如图1所示，经过Bandscan扫描分析软件，IL-6抗原突变体纯度大于98％。

实施例4 IL-6突变体亲和柱偶联制备工艺

1)活化sepharose 4b树脂

称取1.00g的sepharose4b树脂于烧杯中，加入50mL的1mM盐酸室温下溶胀5min，转入抽滤瓶抽滤后，直接加50mL的1mM盐酸，室温浸没5min后再抽滤，反复共5次；少量多次的加入15～20mL的1mM盐酸，将树脂吸取转入小三角瓶准备偶联。

2)突变体蛋白准备

将IL-6突变体蛋白换液至100mM NaHCO

3)偶联突变体

上述步骤1)中小三角瓶中，让树脂自然沉降后吸取上清，再将瓶子倾斜后用200μL枪吸取上清；

加入前处理过的突变体，补加1mL的NaHCO

4)测定蛋白浓度

偶联体转入离心管中8000rpm 4℃下离心10min后取上清，计量体积和检测蛋白含量。计算偶联率，突变体蛋白偶联率达到80％以上，即为偶联成功。

5)抗原偶联体清洗处理

用50mL的0.1M碳酸氢钠(pH 8.3，含0.5M的氯化钠)冲洗偶联体于抽滤瓶中；抽滤后，再用碳酸氢钠50mL冲洗一遍；抽滤后，加入0.1M的pH 8的Tris-HCl缓冲液100mL，将抽滤瓶下端用保鲜膜堵好，使其室温下浸泡封闭2h。

封闭之后用抽滤掉封闭液，用0.1M的pH 4的醋酸钠-醋酸缓冲液和0.1M的pH 8的Tris-HCl(含0.5M的氯化钠)缓冲液各50mL轮换冲洗，再抽滤，反复四次；最后加入50mL的0.02M的pH 8.0的PBS洗涤、抽滤，反复3次。

6)装柱

用10mL 0.02M的PBS混匀，取出来装柱；自然沉淀后，拧紧柱子；进0.02M的pH 7.4的PBS冲洗，检查是否遗漏。

装柱前可以取0.1mL偶联体重悬液，进行BCA测定，沉淀中显示较深的蓝色，说明抗原在偶联和封闭、冲洗时均为正常偶联。

试验例1 IL-6抗体纯化方法的比较实验

人IL-6蛋白刺激小鼠，杂交瘤细胞，收集腹水，纯化抗体等步骤，制备得到IL-6单克隆抗体，根据IL-6抗体的特点，从抗体纯度、回收率、稳定性等为出发点，设计并验证了三套实验方法，并对纯化方案做了相关比较。

方法(1)：protein G亲和层析柱纯化IL-6抗体

方法(2)：IL-6抗原亲和层析柱纯化IL-6抗体

方法(3)：IL-6抗原突变体亲和层析柱纯化IL-6抗体

分别采用上述三种方法的纯化方法的步骤如下：

平衡：准备好三种方法各自采用的层析柱，然后用20mL纯水清洗protein G层析柱、IL-6抗原亲和柱、IL-6抗原突变体亲和柱，再用20mL结合缓冲液(0.02M PBS，pH 8.0)以1mL/min的速度冲洗三种层析柱；

上样：样品用结合缓冲液稀释5倍，用0.22μm除菌器除菌。用注射器上样，收集穿透液；

洗脱：用结合缓冲液冲洗柱子至蛋白检测仪基线不变，弃流出液；用洗脱缓冲液(0.1Mglycine-HCl，pH＝2.8)冲洗柱子至蛋白检测仪基线不变，并收集流出液(即洗脱液)。目的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE和Western-Blot，Bandscan扫描分析抗体纯度。

对上述采用三种层析柱得到的抗体分别进行检测，并分析结果如下：

(一)单克隆抗体亲和常数测定

亲和常数表示抗体与抗原结合的紧密程度，是确定抗体性质的重要参数之一，同时也是单克隆抗体稳定性的重要指标。三种方法洗脱的目的蛋白经过SDS-PAGE和Western-Blot验证后进行浓度测定，结果如表1所示。

(二)非竞争ELISA测定mAb的相对亲和常数

实验步骤如下：

①分别以20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL三种浓度的人源IL-6蛋白包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜；

②洗板，PBST 200μL/孔，洗涤3次，5min/次；

③封闭：用3％的BSA作为封闭液，110μL/孔，37℃保温孵育2h；

④洗板：同②；

⑤一抗：加入梯度稀释的单克隆抗体，100μL/孔，37℃保温孵育2h；

⑥洗板：同②；

⑦二抗：1：3000稀释酶标二抗，100μL/孔，37℃保温孵育45min；

⑧洗板：同②；

⑨显色：加入底物使用液，100μL/孔，37℃保温避光显色10min；

⑩终止：每孔加入50μL终止液，450nm处测Abs值，测定结果如表1所示。

(三)单克隆抗体稳定性实验

同样采用间接ELISA测定冻存前和冻存3个月后抗体与抗原的结合力，测定OD

表1三种抗体纯化方法的比较

表1说明三种纯化方法均能获得有活性的IL-6抗体，其中，protein G亲和层析纯化的抗体纯度和活性偏低；IL-6抗原亲和层析纯化的抗体回收率低；IL-6抗原突变体亲和层析纯化活性和回收率都高。

上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。