一种对肿瘤组织中单个肿瘤细胞高纯度富集的方法

技术领域

本发明属于肿瘤组织的单细胞分离技术领域，更具体涉及一种对肿瘤组织中单个肿瘤细胞高纯度富集的方法，适用于对肿瘤单细胞进行细胞水平和基因水平的相关研究，一方面可以做细胞体外培养和药敏试验，或者直接用于肿瘤标志物表达分析比如PD-L1以指导免疫治疗用药，另一方面可以用于单细胞基因测序和转录组测序，从而研究肿瘤发生发展机制、药物作用机制以及辅助肿瘤诊断和寻找治疗的靶点，同时为药效预测和新药研发等提供新的方向。

背景技术

肿瘤的异质性是肿瘤所特有的特性。简单讲就是在一个肿瘤范围之内，所有的肿瘤细胞和肿瘤组织不具有单一的肿瘤特征，而是具有着各自相对特异的不同特征和临床表现。这也是肿瘤在生长过程中，经过多次的增长、生长、增殖、分裂的过程，使得子细胞逐渐与原始肿瘤细胞的分子学成分、基因成分发生了一定的改变，从而使得肿瘤的生长、侵袭能力以及肿瘤对药物的敏感性，放射治疗敏感性等方面均产生差异。这也使得肿瘤在治疗和预后上会产生一定的差异。正是因为异质性的存在，才使得肿瘤发生耐药，治疗上出现各种不断的推进和进展，因此如果能够对肿瘤患者的组织(手术或穿刺)样本中的单个细胞进行高效分离用于细胞学和基因层面的分析，将对肿瘤的诊断和治疗提供更加精准的方案。肿瘤组织的单细胞分离方法，从最初的毛细管吸取，到流式分选再到微流体技术，众多的单细胞分离技术在不同的组织当中或多或少都取得了较为满意的结果，但目前没有一种快速高效分离单个细胞的通用方法。上述方法主要存在的问题是单细胞收率不高，要么细胞活率较低，要么纯度低不利于肿瘤单个细胞的DNA、RNA和蛋白表达的分析以及为肿瘤细胞体外药敏实验。因此，开发能够有效分离的肿瘤组织单细胞的方法具有极为重要的意义。常见的肿瘤组织样本检测方法主要基于组织切片进行免疫组化分析或是提取组织样本的DNA进行基因分析，但组织中含有纤维细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞、内皮细胞和树突状细胞等对于检测分离肿瘤细胞存在一定干扰，因此如果能富集高纯度的肿瘤细胞将对下游精准分析提供帮助。

从异质性的组织细胞样本中分离单细胞，需要先对组织进行解离得到细胞悬液，目前分离单细胞的方法主要有三种：吸管分离技术、流式分选技术和微流体技术。

吸管分离技术价格低廉，适用于极为稀少的单细胞挑选，但通量低，受人为因素干扰，需要技术熟练，长时间操作有RNA降解风险；流式分选适用于大量细胞的分选，通过荧光标记确保特定细胞的分离，纯度高，但单细胞分选效率不高，且回收的细胞受到机械损伤不利于后续基因分析；微流体技术是借助微流体设备，通过特异荧光标记能够从少量样本中分离出目的细胞，缺点是成本高。

此外还有激光显微切割技术，即通过扫描组织切片定位和切割目的区域，能够保留细胞的RNA完整性，但组织必须是冷冻保存或固定的，切割操作存在挑战，容易切到细胞或细胞核，还有RNA污染风险，而且小的细胞很难分离。

发明内容

为了克服现有技术存在的单细胞纯度低和细胞活率较低的问题，本发明的目的是在于提供了一种对肿瘤组织中单个肿瘤细胞高纯度富集的方法，通过特异性抗体磁微粒识别和标记组织细胞悬液中的目标细胞，通过便携式循环肿瘤细胞分离仪富集目标细胞，直接获得高纯度的肿瘤单细胞，不受组织块中结缔组织和油脂及血细胞等成分的影响。高通量高效率提取高纯度单细胞，操作简单，时间短，不易污染，可有效避免单细胞RNA降解，分选过程温和无机械应力保证了分选细胞的形态完整性和细胞活性，采用磁力覆盖式扫描捕获的方式没有样本用量限制，同时适用于对稀少、少量和大量细胞样本的富集分选。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明可以对组织中的上皮源细胞进行快速分离并保证高纯度和高活性，可用于为来源于组织样本的肿瘤细胞DNA、RNA和蛋白表达的分析以及为肿瘤细胞体外药敏实验研究提供新的方法和更广阔的材料来源。

一种对肿瘤组织中单个肿瘤细胞高纯度富集的方法，包括如下步骤：

(1)组织破碎：用镊子小心将细丝状或块状组织取出置于六孔板左侧收集槽，用眼科镊固定住组织，同时用医用剪刀将组织细细剪碎，然后滴加100～200ul细胞消化液覆盖组织细胞，常温(20－25℃)静置4～6min，加入1ml细胞重悬液；

(2)细胞过筛：取细胞筛放到六孔板右侧收集槽(用于滤除未消化成单个细胞的细胞团)，用移液枪将左侧收集槽中的样本溶液转入右侧收集槽中过筛，并用细胞重悬液补充体积至不少于3ml。

(3)样本与磁珠孵育：向处理好的组织样本中加入2ul EPCAM磁珠，充分混匀后于3D摇床上以7转/分钟的速度缓慢转动，室温(20－25℃)孵育30～40min。

(4)靶细胞分离：将上述六孔板放入循环肿瘤细胞分离仪(宜昌美光硅谷生命科技股份有限公司)中，操作“捕获”流程收集、洗涤、释放，进行靶细胞富集。

(5)显微镜观察：将分离后的六孔细胞培养板放置于倒置荧光显微镜下，可通过明场进行初步地判定富集的单个肿瘤细胞的完整性和活性状态；也可进行免疫荧光染色进一步排除非肿瘤细胞，通过计算视野下的细胞数可判断肿瘤细胞纯度，便于做下游的DNA分析。

以上所述的肿瘤组织可以是：手术组织、穿刺组织。可以是肺癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌等实体瘤患者样本。

通过上述的技术措施：样本与磁珠孵育，利用EPCAM磁珠特异性识别并结合组织破碎液中的肿瘤细胞，然后通过循环肿瘤细胞分离仪精准捕获出EPCAM磁珠标记的靶细胞。解决了传统方法单细胞收率不高、活率较低或纯度低的问题，非常有利于对得到的活细胞做进一步的基因和蛋白表达分析或用于细胞培养及药敏试验等。做基因分析时，对细胞纯度要求非常高，以保证构建文库的质量和测序的准确性；做细胞蛋白表达分析比如PD-L1研究时，常规免疫组化需要对组织切片中不少于100个肿瘤细胞进行分析，而且分析过程无法排除淋巴细胞和巨噬细胞的干扰，通过本技术对组织中的肿瘤细胞进行富集提纯，可对提供的组织进行全肿瘤细胞分析，免去了制片的繁琐步骤，且保证了PD-L1表达分析的全面性、准确性；做组织单细胞培养研究时可免去手动去除结缔组织的繁琐步骤，结缔组织通常很难去除出干净，直接影响细胞能否成功培养；采用本明从组织中提取到的肿瘤细胞纯度高，无结缔组织、血细胞、油脂等成分残留，且细胞活性保持良好，经培养成活率可达90％以上。提取的肿瘤单细胞便于进行PD-L1染色分析和计数，且单细胞能够成功用于文库构建和测序。

本发明很好的克服了现有技术的各项不足(分离的靶细胞纯度不高、活性低，分离操作复杂、耗时长、细胞活性降低甚至分解)，操作简单，受人为影响因素小，自动化分选效率高，且回收的细胞完整度好、纯度和活力均较高，无需对组织进行固定等特殊处理，也不用花费精力去除组织中靶细胞以外的其它成分。

本发明对样本量和样本前处理及技术熟练程度没有特殊要求，能够从头发丝大小的穿刺组织中获取几个到几十个纯的肿瘤细胞，也能够对豌豆大小的组织块中分离出几百个纯的肿瘤细胞，分选效率高且细胞活性好，非常有利于后续对活的单细胞进行细胞培养或直接进行基因分析或蛋白表达分析。

单细胞分离活性实验数据：

取乳腺癌细胞系MCF-7细胞进行培养，待长满后加入细胞消化液将成片细胞消化成单个细胞悬浮液备用。将循环肿瘤细胞分离仪放入超净工作台紫外照射30min备用。准备新鲜无肿瘤血样4管，分别取100个左右MCF-7细胞加入其中，颠倒混匀，再加入2ul CD326磁珠，于3D摇床上孵育30min，在超净工作台中将血样转入干净的六孔板，用循环肿瘤细胞分离仪收集、洗涤并释放到装有3ml培养液的六孔板中。盖好盖子，放入二氧化碳培养箱中培养，计数细胞一周成活率。

表一循环肿瘤细胞分离仪分离出的单细胞一周成活率

结果：用循环肿瘤细胞分离仪从血细胞中分离出的MCF-7肿瘤细胞，除少数几个未能贴壁，绝大多数细胞能够正常生长和分裂增殖，说明捕获的细胞活性高，可正常培养。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

A、与毛细管分离相比，本发明分选精度高，通过免疫磁珠一次性对组织破碎液中的靶细胞富集，效率高。

B、与流式细胞仪相比，本发明分选保证了细胞高活性和高纯度，分选效率高。

C、与微流体技术相比，本发明分选其方法简单，成本低廉，易于大规模推广使用，为肿瘤单细胞下游分析提供高质量材料。

附图说明

图1A和图1B为一种对肿瘤组织中单个肿瘤细胞高纯度富集的方法分离出的乳腺癌肿瘤单细胞和细胞培养图。

分离出的肿瘤细胞成单个细胞，特异性粘附抗体磁珠，细胞形态保持完好无破损，细胞背景纯净无杂质。通过抗体磁珠捕获的肿瘤细胞保持高度活性，能够正常培养并分裂增殖。

图2A和图2B为一种对肿瘤组织中单个肿瘤细胞高纯度富集的方法对分离出的肺癌肿瘤单细胞做PD-L1免疫治疗靶点分析的图。

通过对组织中的肿瘤单细胞做PD-L1表达的阳性占比分析，用于免疫抑制剂用药指导。图2A为PD-L1表达阳性组织单细胞，图2B为PD-L1表达阴性组织单细胞。

图2A为一种对肿瘤组织中单个肿瘤细胞高纯度富集的方法的显示PD-L1表达的紫色荧光示意图。

明场下可见与特异性磁珠结合，同时荧光下对应细胞核显蓝色荧光，显示非血细胞标识绿色荧光的异常细胞，显示PD-L1表达的紫色荧光。

图2B为一种对肿瘤组织中单个肿瘤细胞高纯度富集的方法的不显示PD-L1表达的紫色荧光示意图。

明场下可见与特异性磁珠结合，同时荧光下对应细胞核显蓝色荧光，显示非血细胞标识绿色荧光的异常细胞，不显示PD-L1表达的紫色荧光。

图3A和图3B为一种对肿瘤组织中单个肿瘤细胞高纯度富集的方法的对分离出的膀胱癌组织的PD-L1阳性和PD-L1阴性单细胞做文库构建的图。

分离出的肿瘤细胞保持高度活性，10个细胞可建库成功并进行测序分析。

具体实施方式

实施例1：

一种对乳腺癌肿瘤组织中单个肿瘤细胞高纯度富集的方法，其步骤是：

(1)组织破碎：用镊子小心将块状组织取出置于六孔板左侧收集槽，用眼科镊固定住组织，同时用医用剪刀将组织细细剪碎，然后滴加100ul细胞消化液覆盖组织细胞，常温(23-28℃)静置5min，加入1ml细胞重悬液；

(2)细胞过筛：取细胞筛放到六孔板右侧收集槽(用于滤除未消化成单个细胞的细胞团)，用移液枪将左侧收集槽中的样本溶液转入右侧收集槽中过筛，并用细胞重悬液补充体积至不少于3ml。

(3)样本与磁珠孵育：向处理好的组织样本中加入2ul EPCAM磁珠，充分混匀后于3D摇床上以7转/分钟的速度缓慢转动，室温(23-28℃)孵育30min。

(4)靶细胞分离：将上述六孔板放入循环肿瘤细胞分离仪(宜昌美光硅谷生命科技股份有限公司)中，操作“捕获”流程收集、洗涤、释放，进行靶细胞富集。

(5)显微镜观察：将分离后的六孔细胞培养板放置于倒置荧光显微镜下，可通过明场进行初步的判定富集的单个肿瘤细胞的完整度和活性状态。

(6)细胞体外培养：在超净工作台中吸弃缓冲液，向六孔板释放槽中加入3ml细胞培养液，于二氧化碳培养箱中37℃、5％二氧化碳条件下培养并观察细胞生长分裂状态。

通过上述具体技术措施，获得一个能从乳腺癌组织样本中分离单个肿瘤细胞具有高活性的技术效果。

实施例2：

一种早期肺癌穿刺样本中单个肿瘤细胞高纯度富集的方法，其步骤是：

(1)组织破碎：用镊子小心将细丝状组织取出置于六孔板左侧收集槽，用眼科镊固定住组织，同时用医用剪刀将组织细细剪碎，然后滴加100ul细胞消化液覆盖组织细胞，常温(23-28℃)静置5min，加入1ml细胞重悬液；

(2)细胞过筛：取细胞筛放到六孔板右侧收集槽(用于滤除未消化成单个细胞的细胞团)，用移液枪将左侧收集槽中的样本溶液转入右侧收集槽中过筛，并用细胞重悬液补充体积至不少于3ml。

(3)样本与磁珠孵育：向处理好的组织样本中加入2ul EPCAM磁珠，充分混匀后于3D摇床上以7转/分钟的速度缓慢转动，室温(23-28℃)孵育30min。

(4)靶细胞分离：将上述六孔板放入循环肿瘤细胞分离仪(宜昌美光硅谷生命科技股份有限公司)中，操作“捕获”流程收集、洗涤、释放，进行靶细胞富集。

(5)显微镜观察：将分离后的六孔细胞培养板放置于倒置荧光显微镜下，可通过明场进行初步的判定富集的单个肿瘤细胞。

(6)单个细胞的PD-L1染色：通过荧光染料对分离富集的单个细胞进行染色，结果表明不同的单个细胞存在PD-L1的表达差异，也证实了肿瘤的异质性。

通过上述具体技术措施，获得一个能从肺癌组织中对单个细胞进行PD-L1表达检测的好的技术效果，可用于临床指导用药。

实施例3：

一种对膀胱癌肿瘤组织中单个肿瘤细胞高纯度富集的方法，其步骤是：

(1)组织破碎：用镊子小心将块状组织取出置于六孔板左侧收集槽，用眼科镊固定住组织，同时用医用剪刀将组织细细剪碎，然后滴加100ul细胞消化液覆盖组织细胞，常温(23-28℃)静置5min，加入1ml细胞重悬液；

(2)细胞过筛：取细胞筛放到六孔板右侧收集槽(用于滤除未消化成单个细胞的细胞团)，用移液枪将左侧收集槽中的样本溶液转入右侧收集槽中过筛，并用细胞重悬液补充体积至不少于3ml。

(3)样本与磁珠孵育：向处理好的组织样本中加入2ul EPCAM磁珠，充分混匀后于3D摇床上以7转/分钟的速度缓慢转动，室温(23-28℃)孵育30min。

(4)靶细胞分离：将上述六孔板放入循环肿瘤细胞分离仪(宜昌美光硅谷生命科技股份有限公司)中，操作“捕获”流程收集、洗涤、释放，进行靶细胞富集。

(5)显微镜观察：将分离后的六孔细胞培养板防置于倒置荧光显微镜下，可通过明场进行初步的判定富集的单个肿瘤细胞的活性状态。

(6)单个细胞的PD-L1染色：通过荧光染料对分离富集的单个细胞进行染色，区分组织细胞中的PD-L1阳性和PD-L1阴性的肿瘤细胞。

(7)单个细胞提取：通过单细胞分选仪(美光硅谷生命科技股份有限公司)分别提取出10个PD-L1阳性肿瘤单细胞、10个PD-L1阴性肿瘤单细胞进行文库构建和基因测序。

(8)单细胞文库制备：向装有10个细胞的离心管中直接加入PCR反应液进行直扩，采用CHS panel进行靶向扩增文库制备，用Qubit检测文库浓度，Qsep检测文库长度，结果如图3A-B所示，10个PD-L1阳性组织单细胞的文库浓度为32.2ng/uL，10个PD-L1阴性组织单细胞的文库浓度为24.4ng/uL，文库长度均为200～300bp，说明建库成功，可用于测序。

(9)对基因组进行高通量测序分析。

基因测序得到的致病性突变数据如下表二，可以通过对数据进行分析，去找到相应的靶向药物。

表二