一种用于分离罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的培养基及其应用

技术领域

本发明属于菌种计数技术领域，具体涉及一种用于分离罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的培养基及其应用。

背景技术

罗伊氏乳杆菌是一类普遍存在于人和动物肠道内的益生菌，具有提高免疫力、改善过敏体质、预防过敏反复发作及改善婴儿肠绞痛等的生物作用。罗伊氏乳杆菌，具有添加到乳制品中室温下长时间保持活性的特征，同时对肠应激综合症有明显的改善效果；瑞士乳杆菌是比较常见的乳酸菌，目前发现具有的生物作用有预防胃肠道感染、抗高血压、改善脑功能及免疫调节作用等；因此，设计开发针对罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的特异性培养基具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于分离罗伊氏乳杆菌或瑞士乳杆菌的培养基。

本发明还提出一种上述培养基的应用。

本发明还提出一种罗伊氏乳杆菌的分离方法。

本发明还提出一种瑞士乳杆菌的分离方法。

根据本发明的一个方面，提出了一种用于分离罗伊氏乳杆菌或瑞士乳杆菌的培养基，所述培养基含有盐酸克林霉素和环丙沙星，或万古霉素和环丙沙星。

在本发明的一些实施方式中，所述培养基为MRS琼脂。

在本发明的一些实施方式中，所述MRS琼脂浓度为60-70mg/mL。

在本发明的一些实施方式中，若所述培养基同时含有盐酸克林霉素和环丙沙星，其中，所述环丙沙星的浓度为0.01-0.025mg/mL，所述盐酸克林霉素的浓度为0.0001-0.001mg/mL；若所述的培养基同时含有环丙沙星和万古霉素，其中，所述环丙沙星的浓度为0.01-0.025mg/mL，所述万古霉素的浓度为0.05-0.1mg/mL。

在本发明的一些实施方式中，若所述培养基同时含有盐酸克林霉素和环丙沙星，其中，所述环丙沙星的浓度为0.01-0.02mg/mL，所述盐酸克林霉素的浓度为0.0001-0.0007mg/mL；若所述的培养基同时含有环丙沙星和万古霉素，其中，所述环丙沙星的浓度为0.01-0.02mg/mL，所述万古霉素的浓度为0.05-0.09mg/mL。

在本发明的第二方面，提出了一种上述培养基的应用，所述应用为在制备分离乳杆菌的产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备用于乳杆菌计数的产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述乳杆菌为罗伊氏乳杆菌和/或瑞士乳杆菌。

在本发明的第三方面，提出了一种罗伊氏乳杆菌的分离方法，所述方法包括以下步骤：将待分离的菌液加入上述培养基中，所述培养基同时含有万古霉素和环丙沙星，分离得到罗伊氏乳杆菌。

在本发明的第四方面，提出了一种瑞士乳杆菌的分离方法，所述方法包括以下步骤：将待分离的菌液加入上述培养基中，所述培养基同时含有盐酸克林霉素和环丙沙星，分离得到瑞士乳杆菌。

在本发明的第五方面，提出了一种罗伊氏乳杆菌的计数方法，所述方法包括以下步骤：将待测菌液加入上述培养基中，所述培养基同时含有万古霉素和环丙沙星，32℃-38℃厌氧培养60-80h后，对菌落进行计数。

在本发明的第六方面，提出了一种瑞士乳杆菌的计数方法，所述方法包括以下步骤：将待测菌液加入上述培养基中，所述培养基同时含有盐酸克林霉素和环丙沙星，32℃-38℃厌氧培养60-80h后，对菌落进行计数。

根据本发明的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本发明提出了一种用于分离罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的培养基，通过对罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌分离的最优抗生素组合和剂量进行筛选，实现罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌混合产品中的单菌计数。同时可实现为罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌产品研发、配方验证、工艺验证和产品功能性试验等领域的研究提供数据参考。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明测试例中的菌株培养结果示意图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

抗生素配制：

5mg/mL盐酸克林霉素、万古霉素、环丙沙星溶液：分别取50mg的盐酸克林霉素、万古霉素、环丙沙星依次分别加入到3份10mL无菌水中，振荡混匀成5mg/mL盐酸克林霉素、万古霉素、环丙沙星溶液，采用0.22μm的无菌微孔膜对配制后的溶液过滤除菌备用。

MRS琼脂培养基的配制：称取MRS琼脂66.2g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃以下，得到MRS琼脂培养基。

实施例1

本实施例提出一种用于分离罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的培养基，制备过程如下：

在上述制备得到的MRS琼脂培养基中添加环丙沙星溶液，使环丙沙星在MRS琼脂培养基的浓度为1mg/mL。

实施例2

本实施例提出一种用于分离罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的培养基，制备过程如下：

在上述制备得到的MRS琼脂培养基中添加盐酸克林霉素溶液，使盐酸克林霉素在MRS琼脂培养基的浓度为1mg/mL。

实施例3

本实施例提出一种用于分离罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的培养基，制备过程如下：

在上述制备得到的MRS琼脂培养基中添加万古霉素溶液，使万古霉素在MRS琼脂培养基的浓度为1mg/mL。

实施例4

本实施例提出一种用于分离罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的培养基，制备过程如下：

制备6份MRS琼脂培养基，依次分别向MRS琼脂培养基中加入盐酸克林霉素溶液，使得盐酸克林霉素在MRS琼脂培养基的浓度分别为0.0001、0.001、0.01、0.02、0.05、0.1mg/mL。

实施例5

本实施例提出一种用于分离罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的培养基，制备过程如下：

准备6份MRS琼脂培养基，依次分别向MRS琼脂培养基中加入万古霉素溶液，使得万古霉素在MRS琼脂培养基的浓度分别为0.0001、0.001、0.01、0.02、0.05、0.1mg/mL。

实施例6

本实施例提出一种用于分离罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的培养基，制备过程如下：

准备6份MRS琼脂培养基，依次分别向MRS琼脂培养基中加入环丙沙星溶液，使得环丙沙星在MRS琼脂培养基的浓度分别为0.0001、0.001、0.01、0.02、0.05、0.1mg/mL。

实施例7

本实施例提出一种用于分离罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的培养基(环丙沙星及盐酸克林霉素改良MRS琼脂培养基)，制备过程如下：

准备36份MRS琼脂培养基，均分为6组，依次分别向每组MRS琼脂培养基中加入盐酸克林霉素溶液，使得盐酸克林霉素在每组MRS琼脂培养基中浓度依次为0.0001、0.0003、0.0005、0.0007、0.0009、0.001mg/mL；

然后在每组含有盐酸克林霉素的MRS琼脂培养基中，依次分别向含有盐酸克林霉素的MRS琼脂培养基中环丙沙星溶液，使得各组中6份MRS琼脂培养基中环丙沙星的浓度依次为0.001、0.005、0.01、0.015、0.02和0.025mg/mL；

得到36份环丙沙星及盐酸克林霉素改良MRS琼脂培养基。

实施例8

本实施例提出一种用于分离罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的培养基(环丙沙星及万古霉素改良MRS琼脂培养基)，制备过程如下：

准备36份MRS琼脂培养基，均分为6组，依次分别向每组MRS琼脂培养基中加入万古霉素溶液，使得万古霉素在每组MRS琼脂培养基中浓度依次为0.02、0.03、0.05、0.07、0.09、0.1mg/mL；

然后在每组含有万古霉素的MRS琼脂培养基中，依次分别向含有万古霉素的MRS琼脂培养基中环丙沙星溶液，使得各组中6份MRS琼脂培养基中环丙沙星的浓度依次为0.001、0.005、0.01、0.015、0.02和0.025mg/mL；

得到36份环丙沙星及万古霉素改良MRS琼脂培养基。

对比例1

与实施例1的区别在于，在MRS琼脂培养基添加庆大霉素溶液，使庆大霉素在MRS琼脂培养基的浓度为1mg/mL。

对比例2

与实施例1的区别在于，在MRS琼脂培养基添加链霉素溶液，使链霉素在MRS琼脂培养基的浓度为1mg/mL。

对比例3

与实施例1的区别在于，在MRS琼脂培养基添加青霉素溶液，使青霉素在MRS琼脂培养基的浓度为1mg/mL。

对比例4

与实施例1的区别在于，在MRS琼脂培养基添加氯霉素溶液，使氯霉素在MRS琼脂培养基的浓度为1mg/mL。

对比例5

与实施例1的区别在于，在MRS琼脂培养基添加卡那霉素溶液，使卡那霉素在MRS琼脂培养基的浓度为1mg/mL。

对比例6

与实施例1的区别在于，在MRS琼脂培养基添加甲硝唑溶液，使甲硝唑在MRS琼脂培养基的浓度为1mg/mL。

对比例7

与实施例1的区别在于，在MRS琼脂培养基添加磺胺甲基异恶唑溶液，使磺胺甲基异恶唑在MRS琼脂培养基的浓度为1mg/mL。

对比例8

与实施例1的区别在于，在MRS琼脂培养基添加头孢噻溶液，使头孢噻在MRS琼脂培养基的浓度为1mg/mL。

测试例

1、单种抗生素的筛选

使用复苏后的罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌(来源于拉曼公司和科汉森公司专利菌种、美国菌种保藏中心及中国工业微生物菌种保藏管理中心)分别划线至实施例1-3和对比例1-8制备得到的培养基中，36℃±1℃厌氧培养72h±2h后，分别观察罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的生长情况，每个稀释度做4个平行试验。乳杆菌的生长情况示例如图1所示。

表1

其中，“-”为菌株生长不良，“+”为菌株生长很好，“×”为不生长。

结果如表1所示，从表1中可以看出，只有盐酸克林霉素、环丙沙星和万古霉素可以同时使得瑞士乳杆菌和罗伊氏乳杆菌生长，其中，在环丙沙星和万古霉素的存在下，罗伊氏乳杆菌生长良好，在盐酸克林霉素和环丙沙星存在下，瑞士乳杆菌生长良好。

2、单种抗生素浓度的筛选

使用复苏后的罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌(来源于拉曼公司和科汉森公司专利菌种、美国菌种保藏中心及中国工业微生物菌种保藏管理中心)分别划线至实施例4-6制备得到的培养基中，36℃±1℃厌氧培养72h±2h后，分别观察罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的生长情况，每个稀释度做4个平行试验。

表2

其中，“△”为罗伊氏乳杆菌生长不良，“▲”为罗伊氏乳杆菌生长良好，“○”为瑞士乳杆菌生长不良，“●”为瑞士乳杆菌生长良好。

结果如表2所示，从表中可以看出，瑞士乳杆菌和罗伊氏乳杆菌在分别添加单种抗生素(分别为区间浓度0.0001mg/mL-0.001mg/mL盐酸克林霉素、区间浓度0.001-0.02mg/mL的环丙沙星、区间浓度0.02mg/mL-0.1mg/mL万古霉素)的培养基上存在生长差异，但无法完全抑制非目标菌(另外一种菌)的生长。综上抗生素浓度的筛选的数据知：针对瑞士乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的分离筛选，含单种抗生素配方的培养基都存在局限性，需要设计组合型抗生素进行后续的效果验证。

3、抗生素组合筛选

使用复苏后的罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌(来源于拉曼公司和科汉森公司专利菌种、美国菌种保藏中心及中国工业微生物菌种保藏管理中心)分别划线至实施例7、实施例8中制得的不同MRS培养基中，36℃±1℃厌氧培养72h±2h后，分别观察罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的生长情况，每个稀释度做4个平行试验。

表3

表4

其中，“△”为罗伊氏乳杆菌生长不良，“▲”为罗伊氏乳杆菌生长良好，

结果如表3和表4所示，从表中可以看出，瑞士乳杆菌的计数可选择MRS琼脂添加区间浓度为0.01-0.025mg/mL环丙沙星和区间浓度为0.0001-0.001mg/mL盐酸克林霉素，制成环丙沙星及盐酸克林霉素改良MRS琼脂培养基，罗伊氏乳杆菌的计数可选择在MRS琼脂添加区间浓度为0.01-0.025mg/mL环丙沙星和区间浓度为0.02-0.1mg/mL万古霉素，制成环丙沙星及万古霉素改良MRS琼脂培养基。

基于抗生素对乳酸菌具有抑制生长的特性，选择能够达到筛选标准的抗生素最低浓度为本次验证推荐的试验优选浓度，即以瑞士乳杆菌计数时，优选为含有浓度为0.01-0.025mg/mL环丙沙星和浓度为0.0001-0.001mg/mL盐酸克林霉素的MRS琼脂培养基，更优为含有浓度为0.01-0.02mg/mL环丙沙星和浓度为0.0001-0.0007mg/mL盐酸克林霉素的MRS琼脂培养基；以罗氏乳杆菌计数时，优选为含有浓度为0.01-0.025mg/mL环丙沙星和浓度为0.05-0.1mg/mL万古霉素的MRS琼脂培养基，更优的含有浓度为0.01-0.02mg/mL环丙沙星和终浓度为0.05-0.09mg/mL万古霉素的MRS琼脂培养基。

4、乳酸菌混合产品中罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的测定

检测样品为完美(广东)日用品有限公司完美萃妍益生菌固体饮料(含拉曼公司生产的罗伊氏乳杆菌HA-188、瑞士乳杆菌Rosell-52)。

(1)样品中瑞士乳杆菌的计数方法，包括以下步骤：

称取25g样品至装有225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打2min制成1：10样品匀液；按10倍梯度稀释样液至10

将活菌计数平板于36℃±1℃厌氧培养72h±2h后，选取菌落数为30CFU～300CFU的平板进行计数。

(2)样品中罗伊氏乳杆菌的计数方法，包括以下步骤：

称取25g样品至装有225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打2min制成1：10样品匀液；按10倍梯度稀释样液至10

将活菌计数平板于36℃±1℃厌氧培养72h±2h后，选取菌落数为30CFU～300CFU的平板进行计数。

(3)总乳酸菌的计数

称取25g样品至装有225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打2min制成1：10样品匀液；按10倍梯度稀释样液至10

将活菌计数平板于36℃±1℃厌氧培养72h±2h后，选取菌落数为30CFU～300CFU的平板进行计数。

测定得到乳酸菌混合产品中罗伊氏乳杆菌为5.5×10

5、罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的测试是否存在生长互相干扰的实验

罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的测试是否存在生长互相干扰的实验，具体过程为：

(1)取新鲜培养的罗伊氏乳杆菌加入无菌生理盐水中，混匀后再稀释得到约1×10

(2)取新鲜培养的瑞士乳杆菌加入无菌生理盐水中，混匀后再稀释得到约1×10

(3)以体积比为1:1的比例混合罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌菌液，制备成混合菌液；

(4)将样品1×10

分别吸取1mL样品涂布于实施例7制备得到的环丙沙星及盐酸克林霉素改良MRS琼脂培养基、实施例8制备得到的环丙沙星及万古霉素改良MRS琼脂培养基和MRS琼脂培养基中，每组做6个平皿。

将活菌计数平板于36℃±1℃厌氧培养72h±2h后，选取菌落数为30CFU～300CFU的平板进行计数。

含罗伊氏乳杆菌单菌样品、瑞士乳杆菌单菌样品、罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌混合菌样品，测得的回收率分别为80.0％、82.4％、81.5％，对照组无法区分罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌混合菌样品，结果说明罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌使用已确定最优抗生素组合的生长不存在互相干扰。

6、精密度和准确度的验证实验

本试验例测试了罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的分离计数是否准确，具体方法如下：

分别制备30个测试样品，其中10个样品高浓度菌量水平(10

(1)样品中瑞士乳杆菌的计数方法，包括以下步骤：

称取25g样品至装有225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打2min制成1：10样品匀液；按10倍梯度稀释样液至适宜梯度，根据样品活菌总数的估计，选择3个连续适宜稀释度，吸取1mL样品匀液，涂布于实施例7制备的环丙沙星和盐酸克林霉素改良的MRS培养基(其中，环丙沙星的浓度为0.01mg/mL，盐酸克林霉素的浓度为0.0001mg/mL)中，每个稀释度做4个平皿，进行活菌平板计数。

将活菌计数平板于36℃±1℃厌氧培养72h±2h后，选取菌落数为30CFU～300CFU的平板进行计数。

(2)样品中罗伊氏乳杆菌的计数方法，包括以下步骤：

称取25g样品至装有225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打2min制成1：10样品匀液；按10倍梯度稀释样液至适宜梯度，根据样品活菌总数的估计，选择3个连续适宜稀释度，吸取1mL样品匀液，涂布于实施例8制备得到的环丙沙星及万古霉素改良MRS琼脂培养基(其中，环丙沙星的浓度为0.01mg/mL，万古霉素的浓度为0.05mg/mL)内，每个稀释度做4个平皿，进行活菌平板计数。

将活菌计数平板于36℃±1℃厌氧培养72h±2h后，选取菌落数为30CFU～300CFU的平板进行计数。

(3)总乳酸菌的计数(基准对照方法)，包括以下步骤：

称取25g样品至装有225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打2min制成1：10样品匀液；按10倍梯度稀释样液至适宜梯度，根据样品活菌总数的估计，选择3个连续适宜稀释度，吸取1mL样品匀液于MRS琼脂培养基内，每个稀释度做4个平皿，进行活菌平板计数。

将活菌计数平板于36℃±1℃厌氧培养72h±2h后，选取菌落数为30CFU～300CFU的平板进行计数。

样品中瑞士乳杆菌和罗伊氏乳杆菌检测计数结果加和后总乳酸菌计数结果作比较:其回收率90％；同时两组数据t检验差异显著性分析为P＝0.995＞0.05，其差异不显著；单人分别测得的样品结果(含基准对照方法和最优抗生素组合方法)中最大值与最小值的lg值之差r＝0.09(≤0.25)；双人分别测得的样品结果(含基准对照方法和最优抗生素组合方法)中最大值与最小值的lg值之差r＝0.19(≤0.45)；说明罗伊氏乳杆菌和瑞士乳杆菌使用已确定最优抗生素组合的测试方法准确可靠。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。