长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6、制备方法及应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6、制备方法及应用。

背景技术

长牡蛎（

DM9是一类包含有糖类识别结构域（DM9）并且能够抵抗真菌及细菌感染、促进细胞吞噬行使免疫调节功能的蛋白。研究发现，含DM9结构域蛋白在模式识别、微生物凝集、吞噬调理和细胞凝集等过程中发挥重要作用。果蝇中的一个含DM9结构域蛋白表达量在感染

但是，迄今为止并没有关于长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6、制备方法及作为抑制革兰氏阳性菌

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述问题，提供一种长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6、制备方法及应用。

本发明的技术解决方案是：一种长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种上述长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6的制备方法，依次按照如下步骤进行：

a. 用引物P1和P2对长牡蛎

b. 将PCR扩增产物与pET30a载体经

c. 将所述重组子转入大肠杆菌

一种如上所述长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6在制备抑制革兰氏阳性菌

本发明长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6克隆自长牡蛎cDNA文库，具有多种微生物的结合活性并且能够显著提高长牡蛎血淋巴细胞对于革兰氏阴性菌吞噬率，除对真菌

附图说明

图1是本发明实施例长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6与菌结合活性检测效果图。

图2是本发明实施例长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6与糖结合活性检测效果图。

图3是本发明实施例长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6促吞噬作用检测效果图。

具体实施方式

本发明长牡蛎含DM9结构域重组蛋白CgDM9CP-6制备方法，依次按照如下步骤进行：

1. 重组载体的构建

本发明实施例采用重组载体为Novagen公司pET-30a(+)原核表达载体。通过PCR技术，采用5’末端分别添加了

PCR反应条件为：首先94℃预变性5 min，然后进入下列循环：94℃变性30s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，共进行30个循环，最后72℃延伸10 min；利用琼脂糖胶电泳将扩增片段纯化回收，与pMD19-T载体连接；转化后筛选阳性克隆，提取质粒，并使用

2. 重组蛋白r

将构建好的重组质粒转化表达大肠杆菌Transetta（DE3）中，挑取单克隆，接种于200 mL LB液体培养基中，220 rpm，37℃培养至OD

3. 重组蛋白r

将表达产物采用镍琼脂糖凝胶FF柱纯化，获得了变性重组蛋白，用透析缓冲液透析复性。具体操作步骤如下：

（1）镍琼脂糖凝胶FF装柱，1.6×20 cm，柱床体积为10 mL；

（2）用缓冲液I（50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH=9.0，50 mmol/LNaCl，8 mol/L尿素）平衡2~5个床体积，流速为2 mL/min；

（3）取经IPTG诱导表达细胞，用缓冲液I重悬，150 W超声破碎30 min，12,000 rpm，4℃离心30 min，上清液用0.45 μm滤膜过滤后，过柱，流速为1 mL/min；

（4）用缓冲液I再洗2~5个床体积，流速为2 mL/min；

（5） 用含50 mmol/L咪唑缓冲液I再洗2~5个柱床体积，流速为2 mL/min；

（6）用含400 mmol/L咪唑缓冲液I洗脱目的蛋白，收集；

（7）用SDS-PAGE检测融合蛋白表达；

（8）用纯水流洗5个柱床体积，再用20%乙醇流洗3个柱床体积，流速为2 mL/min，柱子置于4℃环境中保存变性状态下提纯重组蛋白需要在复性缓冲液中通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠，恢复正确构象。变性纯化产物经2 mM还原谷胱甘肽、0.4 mM氧化谷胱甘肽、1 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度起始6 M逐渐替换到4 M、3 M、2 M、1 M、0 M，最后一次透析至无尿素透析液时不加甘油，每次在4℃透析12 h，即得到长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6，所得到的长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

长度：143个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

特性：分子量为15.9 kDa，等电点为7.69，具有两个DM9结构域。

实验例1：本发明长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6与菌结合活性检测

基于western blotting方法检测重组蛋白rCgDM9CP-6对两种革兰氏阴性菌（灿烂弧菌和大肠杆菌），两种革兰氏阳性菌（藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌）以及两种真菌耶罗维亚酵母菌和毕赤酵母结合活性。所用菌种来源如下：灿烂弧菌（

具体操作如下：

（1）对上述6种微生物进行过夜培养，培养方法：藤黄微球菌和大肠杆菌于LB培养基37℃培养20 h，金黄色葡萄球菌于LB培养基28℃培养20 h，灿烂弧菌和耶罗维亚酵母菌于2216E培养基中28℃培养20 h，毕赤酵母菌于YPD培养基中28℃培养20 h；

（2）离心收集菌体，使用TBS缓冲液重悬，调整菌浓度为1×10

（3）吸取100 μL微生物悬液与等体积本发明实施例所得重组蛋白r

（4）10,000 rpm离心2 min收集菌体，TBS缓冲液清洗菌体四次；

（5）洗涤完成后收集菌体，使用40 μL无菌水重悬；

（6）加入10 μL 5×蛋白电泳缓冲液，于99℃加热10 min，SDS-PAGE电泳分离蛋白样品；

（7）电泳完成后，取下凝胶，并裁取相同大小NC膜和滤纸共同浸入电转缓冲液中静置10 min；

（8）按照从上到下顺序依次将滤纸、NC膜、凝胶和滤纸放入电转仪中，根据凝胶块面积大小设定对应电流，转膜25 min；

（9）取出NC膜，使用TBS缓冲液洗涤三次，每次5 min；

（10）使用缓冲液TBST洗涤三次，每次5 min；

（11）将NC膜放入5%脱脂奶粉（溶解于TBST）中，室温封闭2 h；

（12）取出NC膜，使用TBST缓冲液洗涤三次，每次5 min；

（13）将NC膜浸入按比例稀释的His标签单抗（购于上海生工）溶液（5%脱脂奶粉，TBST缓冲液），于室温条件下孵育1 h；

（14）取出NC膜，使用TBST缓冲液洗涤三次，每次5 min。

（15）将NC膜放入按比例稀释的羊抗小鼠HRP二抗（购自于上海生工）溶液中（5%脱脂奶粉TBST缓冲液），于室温孵育1 h；

（16）取出NC膜，使用TBST缓冲液洗涤三次，每次10 min；

（17）ECL方法显影，成像仪记录western blotting结果，如图1所示。

结果显示，本发明实施例长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及真菌均具有不同程度结合活性，且对灿烂弧菌、藤黄微球菌及耶罗维亚酵母菌结合活性高于对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和毕赤酵母菌结合活性。rTrx阴性对照组中则无明显条带。

实验例2：本发明长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6与糖结合活性检测

利用酶联免疫吸附反应(ELISA)实验检测本发明长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6与各种PAMPs结合情况。所用D-Mannose、Mannose、LPS和PGN四种糖均购自Sigma。

具体操作步骤如下：

（1）将Na

（2）弃掉包被液体并TBS-T清洗4次，每次4 min；

（3）清洗后孔内加3% BSA 250 μL于37℃恒温培养箱中封闭1 h；

（4）封闭完毕后重复步骤2；

（5）各孔加入稀释的浓度梯度重组蛋白rCgDM9CP-6 100 μL（阴性对照加入rTrx蛋白，对照孔加TBS）室内恒温孵育2 h；

（6）重复步骤(4）；

（7）各孔中以1：1,000比例加入His标签一抗100 μL，37℃放置1 h；

（8）同步骤（2）；

（9）将步骤（7）中抗体换成HRP二抗并37℃恒温培养箱孵育1 h；

（10）用TBST洗涤各孔5次，每次3 min；

（11）利用TMB显色液显色约30 min后加入终止液45.65 μL（浓度为2 M HCl）终止显色，随后测定得到OD

结果显示，本发明实施例长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6与Mannose、D-Mannose、LPS、PGN都具有结合活性，并且重组蛋白r

实验例3：本发明长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6促吞噬活性检测

采用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate isomer, FITC）对两种微生物（灿烂弧菌和金黄色葡萄球菌）进行标记，然后使用流式细胞仪对长牡蛎血淋巴细胞吞噬效率进行检测。

所述菌种来源如上。

具体操作如下：

（1）将上述两种微生物分别培养并收集菌体；

（2）使用甲醛与微生物混合，固定10 min；

（3）4,000 rpm，10 min离心收集菌；0.1 M NaHCO

（4）离心弃上清后，使用TBS缓冲液将微生物清洗至无色；

（5）使用TBS重悬菌体并调整浓度为10

（6） 加入等比例抗凝剂将血淋巴抽出后，用300目纱绢过滤，4℃，800 rpm，离心10min，收集血细胞；

（7）用L15加盐细胞培养基将细胞浓度调至10

（8）将本发明实施例所得长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6与细胞以1:1体积比室温避光孵育30 min；

（9）再加入等体积标记好菌液，室温避光孵育30 min；

（10）通过流式细胞仪检测其吞噬细胞数量，结果如图3所示。

结果显示，本发明实施例长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6对灿烂弧菌有明显促吞噬活性，对金黄色葡萄球菌吞噬也具有一定的促进作用。

序列表

<110> 大连海洋大学

<120> 长牡蛎含DM9结构域重组蛋白rCgDM9CP-6、制备方法及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 143

<212> PRT

<213> 长牡蛎(Crassostrea gigas)

<400> 1

Met Ala Val Trp Val Ser Thr Ser Gly Ser His Ile Pro Glu Asn Ala

1 5 10 15

Ile Arg Ala Gly Tyr Glu Glu Asn Gly Asn Pro Leu Phe Ile Ala Arg

20 25 30

Ala Lys Lys Glu Gly Thr Trp Thr Ser Gly Lys Cys Ser Pro Asn Tyr

35 40 45

Glu Gly Ala Tyr Ile Pro Tyr Asp Gly Lys Glu Phe Ile Val Lys Asp

50 55 60

Tyr Asp Val Leu Val Tyr Pro Ile Asn Ala Val Gly Phe Leu Asp Trp

65 70 75 80

Lys His Ala Ser Gly Gly Asn Val Pro Asp Asn Ala Phe Lys Thr Asp

85 90 95

Lys Asp Leu Tyr Val Gly Arg Ala Asn His Ala Gly Cys Leu Ile Pro

100 105 110

Gly Lys Ile Ser Thr Arg Tyr Lys Val Ala Tyr Met Gly Tyr Gly Leu

115 120 125

Lys Glu His Thr Thr Lys Glu Tyr Glu Val Leu Cys Gln Ile Lys

130 135 140

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1 )..(33)

<223> 引物

<400> 2

cgcggatccc ttgatttgac agaggacttc gta 33

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1 )..(20)

<223> 引物

<400> 3

ccgctcgaga tggcagtgtg ggtatcaaca t 31