一株抗十氯酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及食品安全免疫检测技术领域，尤其涉及一株抗十氯酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

十氯酮(chlordecone，CLD)又称为开蓬(Kepone)，是一种人工合成的有机氯杀虫剂。十氯酮因其难溶于水，有很强的疏水性，特别易于富集在生物体中，并且难以进行化学和生物降解，以及具有长距离跨界迁移的可能性，可以在环境中持久存在具有持久性有机污染物(POPs)的特性已被禁用。十氯酮曾广泛用于控制香蕉根蛀虫.它还用于苍蝇幼虫杀虫剂、杀菌剂、控制马铃薯甲虫、锈螨、马铃薯和烟草切根虫以及用于蚂蚁和蟑螂诱剂中，十氯酮是一种毒性较高的有机物，对胎儿中枢神经系统、泌尿生殖系统、免疫系统有一定影响。十氯酮可影响人体神经系统，使人体产生颤抖、体重下降、眼球痉挛、肋膜炎、关节痛、肝肿大和精子减少等症状。人体和动物的实验研究表明，十氯酮被吸收后，主要富集在肝脏，通过胆汁缓慢代谢，经过粪便排出体外，十氯酮对大鼠和小鼠有明显的致癌性，能使肝脏等其它器官产生恶性肿瘤.由于人类和老鼠都是哺乳类动物，有理由认为十氯酮对人体有可能的致癌性。因此，建立快速有效的检测十氯酮含量的方法具有重要意义及市场价值。

针对十氯酮的高效灵敏的检测方法是亟待解决的问题。目前的检测方法包括仪器分析法和免疫分析法。仪器分析法如高效液相色谱法(王荟,彭英,穆肃,等.气相色谱-串联质谱法测定土壤中十氯酮[J].中国环境监测,2015(5)：129-133；Saint-Hilaire M,Inthavong C,Bertin T,Lavison-Bompard G,Guérin T,Fournier A,Feidt C,Rychen G,Parinet J.Development and validation of an HPLC-MS/MS method with QuEChERSextraction using isotopic dilution to simultaneously analyze chlordecone andchlordecol in animal livers.Food Chem.2018,30；252：147-153.)、气相色谱串联质谱法(Martin-Laurent F,Sahnoun MM,Merlin C,Vollmer G,Lübke M.Detection andquantification of chlordecone in contaminated soils from the French WestIndies by GC-MS using the 13C10-chlordecone stable isotope as a tracer[J].Environ Sci Pollut Res Int.2014,21(7)：4928-4933；ALAIN SOLER,MARC LEBRUN,YOANLABROUSSE,et al.Solid-phase microextraction and gas chromatography-massspectrometry for quantitative determination of chlordecone in water,plant andsoil samples[J].Fruits,2014(4)：325-339)。由于对样品前处理繁琐，干扰物较多及仪器工作条件的限制，同时对操作人员的技术要求较高，因此仪器方法并不适用于现场检测。

免疫分析方法相对于仪器检测方法，具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。因此免疫检方法对十氯酮的检测具有重要意义。

酶联免疫法(ELISA)是一种低成本、快速且便携的免疫学检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测出结果。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是其重要前提。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一株抗十氯酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。由该杂交瘤细胞株分泌的抗体针对十氯酮具有较高的检测灵敏度，可以用来建立针对十氯酮的免疫学检测方法。

本发明的第一个目的是提供一株抗十氯酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.45115，本发明所得的杂交瘤细胞株属于单克隆细胞株。

本发明的第二个目的是提供一株抗十氯酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：

S1、将克来范溶于有机溶剂，加入碱性溶液加热至70-90℃搅拌反应0.5-2h，用酸性溶液调节pH至4-5，得到十氯酮半抗原；

S2、使用S1中所述十氯酮半抗原制备十氯酮完全抗原，将所得的十氯酮完全抗原制备成含抗原弗氏完全佐剂与含抗原弗氏不完全佐剂；

S3、对免疫动物进行首次免疫、加强免疫和冲刺免疫，首次免疫采用S2中所述含抗原弗氏完全佐剂，加强免疫采用S2中所述含抗原弗氏不完全佐剂，冲刺免疫采用S2中所述十氯酮完全抗原；

S4、取S3中冲刺免疫后的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，得到所述抗十氯酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

在本发明的一个实施例中，在S1中，还包括萃取、纯化和干燥步骤。

在本发明的一个实施例中，在S1中，所述有机溶剂为二甲亚砜、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，在S1中，所述碱性溶液中的碱性溶剂为氢氧化钠和/或氢氧化钾。

在本发明的一个实施例中，所述克来范和碱性溶剂的物质的量比为1：1-3。

在本发明的一个实施例中，所述克来范和碱性溶剂的物质的量比为1：2。

在本发明的一个实施例中，在S1中，所述有机溶剂中克来范的浓度为0.01-0.05g/mL。

在本发明的一个实施例中，在S1中，所述有机溶剂中克来范的浓度为0.02g/mL。

在本发明的一个实施例中，在S1中，所述酸性溶液为盐酸溶液。

在本发明的一个实施例中，在S1中，所述十氯酮半抗原结构式如下：

在本发明的一个实施例中，在S1中，所述十氯酮半抗原的制备方法具体包括如下步骤，将1equ.克来范溶于二甲亚砜，加入2equ.氢氧化钠溶液加热至80℃搅拌反应1h；加入纯水，用盐酸溶液调节pH至4-5，经萃取、纯化、干燥，得白色固体即为十氯酮半抗原。

在本发明的一个实施例中，在S2中，所述十氯酮完全抗原由所述十氯酮半抗原与载体蛋白偶联得到；所述十氯酮完全抗原结构式如下：

在本发明的一个实施例中，所述载体蛋白包括牛血清蛋白(BSA)。

在本发明的一个实施例中，在S2中，所述十氯酮完全抗原的制备方法包括如下步骤，将所述十氯酮半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)溶解于溶剂中，反应得到混合液，后将混合液加入到载体蛋白溶液中进行反应，得到所述十氯酮完全抗原。

在本发明的一个实施例中，所述溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。

在本发明的一个实施例中，所述十氯酮半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)的物质的量比为1：1-1.5：1-1.5。

在本发明的一个实施例中，所述十氯酮半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)的物质的量比为1：1.2：1.2。

在本发明的一个实施例中，所述十氯酮半抗原在溶剂中的浓度为10.0-14.0g/L。

在本发明的一个实施例中，所述十氯酮半抗原在溶剂中的浓度为12.0g/L。

在本发明的一个实施例中，所述十氯酮半抗原与所述载体蛋白的物质的量比为30-80：1。

在本发明的一个实施例中，所述十氯酮半抗原与所述载体蛋白的物质的量比为50：1。

在本发明的一个实施例中，在S2中，所述十氯酮完全抗原的制备方法具体包括如下步骤，十氯酮半抗原KLV溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌反应，称为A液；称取载体蛋白，加入硼酸缓冲溶液，称为B液；搅拌下，缓慢将A液逐滴加至B液中，室温反应，得到含有KLV-BSA的混合液；透析，即得十氯酮完全抗原。

在本发明的一个实施例中，所述无水N,N-二甲基甲酰胺与所述硼酸缓冲溶液的体积比为1：5-15。

在本发明的一个实施例中，所述无水N,N-二甲基甲酰胺与所述硼酸缓冲溶液的体积比为1：10。

在本发明的一个实施例中，在S2中，所述含抗原弗氏完全佐剂是弗氏完全佐剂与十氯酮完全抗原的等体积混合的乳化液。

在本发明的一个实施例中，在S2中，所述含抗原弗氏不完全佐剂是弗氏不完全佐剂与十氯酮完全抗原的等体积混合的乳化液。

在本发明的一个实施例中，在S3中，整个免疫过程包括1次首次免疫、4-6次加强免疫和1次冲刺免疫。

在本发明的一个实施例中，加强免疫次数为5次。

在本发明的一个实施例中，在S3中，整个免疫过程中首次免疫与加强免疫之间间隔28-31天，加强免疫之间间隔20-22天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18-21天。

在本发明的一个实施例中，在S3中，整个免疫过程中首次免疫的剂量为95-105μg/只，加强免疫的剂量为45-55μg/只，冲刺免疫的剂量为20-30μg/只。

在本发明的一个实施例中，在S3中，所述加强免疫过程中对免疫动物进行采血，通过间接竞争酶联免疫法(icELISA)检测血清效价和抑制率，筛选出血清中十氯酮抗体含量高的获得免疫的免疫动物疫。

在本发明的一个实施例中，所述采血是在加强免疫过程结束后第6-8天进行。

在本发明的一个实施例中，在S3中，所述免疫是通过背部皮下注射入免疫动物体内。

在本发明的一个实施例中，在S4中，细胞融合是将融合的细胞通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，得到杂交瘤细胞株。

在本发明的一个实施例中，所述HAT培养基为RPMI-1640培养基。

在本发明的一个实施例中，所述亚克隆的次数为2-4次。

在本发明的一个实施例中，在S4中，所述细胞融合是通过聚乙二醇(PEG4000)法进行的。

在本发明的一个实施例中，在S4中，所述细胞融合是在冲刺免疫结束2-4天后进行。

本发明的第三个目的是提供一种所述杂交瘤细胞株在制备十氯酮单克隆抗体中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种十氯酮单克隆抗体，所述十氯酮单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.45115的杂交瘤细胞株分泌得到。

在本发明的一个实施例中，向免疫动物腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.45115的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，获得所述十氯酮单克隆抗体。

在本发明的一个实施例中，向8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL，7天后每只小鼠腹腔注射1×10

本发明的第五个目的是提供一种组合物，所述组合物中含有所述的杂交瘤细胞株和/或所述的十氯酮单克隆抗体。

本发明的第六个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有所述的杂交瘤细胞株、所述的十氯酮单克隆抗体和所述的组合物中的一种或多种。

本发明的第七个目的是提供一种所述的杂交瘤细胞株、所述的十氯酮克隆抗体、所述的组合物或所述的试剂盒在检测十氯酮中的应用，尤其是应用于食品安全检测中十氯酮残留的分析检测。

本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明提供的细胞株分泌的单克隆抗体对十氯酮具有较好的特异性和检测灵敏度(IC

生物材料保藏

分泌抗十氯酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株属于单克隆细胞株，所述杂交瘤细胞株于2022年03月03保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45115，分类命名为单克隆细胞株。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1为本发明单克隆抗体的亚型鉴定。

图2为本发明单克隆抗体的亲和力测定。

图3为本发明单克隆抗体对十氯酮的抑制标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

(1)下述实施例中涉及的培养基如下：

RPMI-1640培养基(mg/L)：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L-羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B120.005、碳酸氢钠2000。

(2)下述实施例中涉及的溶液的配置如下：

碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na

磷酸盐缓冲液(PBS)：8.0g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH

PBST：含0.05％吐温-20的PBS；

抗体稀释液：PBS加入0.1％明胶；

TMB显色液：A液：Na

(3)下述实施例中涉及的检测方法如下：

十氯酮抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(CBS)将抗原稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL。选择最佳工作点后，将十氯酮标准品稀释0，0.01，0.03，0.11，0.33，1，3和9μg/mL等浓度，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro 8.5做图，获得十氯酮标准抑制曲线，计算IC

实施例

一株抗十氯酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法，具体包括以下步骤：

A、十氯酮半抗原的合成

十氯酮半抗原KLV的合成路线如下：

将0.10g(0.16mmol)克来范溶于2mL二甲亚砜，加入6mL 1mol L

B、十氯酮完全抗原的制备

步骤A制备的半抗原KLV，与牛血清蛋白(BSA)偶联得到完全抗原KLV-BSA，完全抗原KLV-BSA具体制备方法如下：

a、称取步骤A制得的半抗原KLV 4.6mg(0.0075mmol)溶于200μL无水N,N-二甲基甲酰胺，依次加入1.7mg(0.009mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)1.0mg(0.009mmol)，室温搅拌反应0.5h，称为A液；称取牛血清蛋白BSA 10mg(0.00015mmol)，加入2mL硼酸缓冲溶液，称为B液；搅拌下，缓慢将A液逐滴加至B液中，室温反应2h，得到含有KLV-BSA的混合液；

b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将步骤a中含有KLV-BSA的混合液置于透析袋，用0.01mol L

制得的完全抗原包括KLV-BSA免疫原和KLV-OVA包被原，其中免疫原KLV-BSA用作下一步的小鼠免疫。

包被原KLV-OVA的制法与KLV-BSA相同，用于后续应用检测时使用。

C、小鼠的免疫

KLV-BSA免疫原与等体积弗氏佐剂混合乳化后，获得注射剂，通过颈背部皮下注射BALB/c小鼠。

首次免疫(100μg/只)用弗氏完全佐剂与KLV-BSA免疫原的等体积混合乳化液作为注射剂，5次加强免疫(50μg/只)用弗氏不完全佐剂与KLV-BSA免疫原的等体积混合乳化液作为注射剂。首次免疫与第一次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。最后一次用经生理盐水稀释至浓度为0.5mg/mL的KLV-BSA免疫原(25μg/只，不含佐剂)冲刺免疫；冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔20天；通过间接竞争酶联免疫法(icELISA)检测血清效价和抑制率。

D、细胞融合

在冲刺免疫三天后，按照常规PEG法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死十氯酮免疫小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出该小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集鼠源骨髓瘤SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO

c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO

E、细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合的第3天对融合细胞进行2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用icELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用对十氯酮为标准品，用icELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对十氯酮标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得单克隆杂交瘤细胞株。

测试例

A、十氯酮单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄KLV-BSA免疫BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10

使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的十氯酮单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为IgG2b型，经小鼠单抗亚型鉴定试剂盒检测得轻链类型为κ型，如图1所示。

采用间接ELISA测定，亲和力常数的计算方法：以抗体浓度-OD 450nm值作图，计算不同抗原浓度时OD 450nm对应的抗体浓度，当OD 450nm值为50％时单克隆抗体的浓度，代入公式Ka＝(n-1)/2(nAb’–Ab)计算亲和力常数Ka(Lmol

以上结果说明所制备的十氯酮单克隆抗体具有较高的亲和力，可用于十氯酮免疫分析检测和亲和柱的制备。

B、十氯酮单克隆抗体的应用

将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的十氯酮单克隆抗体应用于十氯酮的添加回收试验，具体包括步骤如下：

(a)包被：将前述步骤B中得到的包被原KLV-OVA用0.05mol L

(b)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min。

(c)封闭：加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。

(d)加样：在阳性对照孔加入100μLPBS；检测孔加入100μL浓度为0.3～50μg L

(e)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。

(f)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD

采用icELISA检测对十氯酮的灵敏度，如图3所示，根据标准方程y＝0.11702+0.8059(1+x/1.1366)

用icELISA测定十氯酮单克隆抗体的IC

该单克隆抗体对十氯酮的交叉为100％，对十氯酮类似物交叉率小于6％，交叉率＝(十氯酮的IC

表1

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。